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1、Western blot 实验技术定义：n印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。nWestern Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 n1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Wes
2、tern Blot基本原理基本原理 Western BlotWestern Blot：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物 是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 n蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l 电泳l转膜l 封闭l 一抗杂交l 洗涤l 二抗杂交l 洗涤l
3、 底物显色煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。）M纯净水（ddH2O）M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 （Arc-Bis）。30%（29:1）MSDS（10%）MTris-HCLM四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）M过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基）凝胶成份凝胶成份SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项
4、：聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散 电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到90V开始电泳，待marker开始分离时将电压调到120V，直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。膜的选择泡膜：泡膜： 转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移bufferbuffer浸泡浸泡20min20min （1.1.凝胶凝胶若是没在预冷的转膜若是没在预冷的转膜bufferbuffer中浸泡，就会在转膜过程中出现中浸泡，就会在转膜过
5、程中出现凝胶凝胶皱缩皱缩，导致出现，导致出现转移条带变形转移条带变形。2.PVDF2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）膜具有疏水性，需用甲醇浸泡） 转膜顺序：转膜顺序： 阴极碳板阴极碳板+ +海绵海绵+ +三滤三滤+ +胶胶+ +膜膜+ +三滤三滤+ +海绵海绵+ +阳极碳板阳极碳板转膜条件：转膜条件： 0.35A 250V 1h40min 0.35A 250V 1h40min 冰浴冰浴中进行转膜中进行转膜 （具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）要的转膜时间越长，反之则短
6、。） n避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。n夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。n保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。n鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。 一抗、二抗孵育n加入一抗溶液孵育（抗体浓度过高会导致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性 ）。4 时过夜。n回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗涤不充分会导致膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确
7、）。n加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 室温25min。n回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min。 短时间多次洗膜较长时间少次洗膜更有效。Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底， 影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。关于磷酸化蛋白检测的注意事项：n保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！n使用5%的BSA作为封闭试剂！不能使用脱脂奶粉!（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景。）抗体保存注意事项：1.收到抗体后按要求离心
8、后再打开管盖进行分装和保存！2.对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -200C。 2.1 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。 2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在40C，避免再冻起来！ 2.3 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。 3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。 4.长期保存，加入叠氮纳，防止细菌污染 任何时候，绝对避免反复冻融！任何时候，绝对避免反复冻融！？ 背景太高膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高 原因原因对对策策转膜前用转移缓冲液将膜转膜前用转移缓冲液将膜完全浸湿完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度