《微生物检测知识培训.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物检测知识培训.pdf（158页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 1第一章第一章 培养基简介培养基简介 培养基（Culture medium）是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的各种营养物质，由人工配制而成的营养基质，它专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存使用。为了满足微生物生长和代谢的需要，培养基必须包含碳源、氮源、水、无机盐和生长因子五大类营养物质。一般基础培养基中含有蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏、氯化钠、琼脂等基本营养成分。一些选择、鉴别培养基根据用途不同，需加入抑菌剂、指示剂、血液、糖等试剂，以利于特定细菌的分离和鉴别。需要使细菌大量生长、繁殖的培养基，主要成分多为氨基酸、核苷酸、无机盐、生长因子等。培养基的研制是微生物学领域的一项重要内容。
2、培养基属于基础应用学科，它广泛的应用于食品、化妆品、医药卫生、工农业、检验检疫、环保等诸多领域。 第一节 培养基的成分 琼脂是从石花菜、江篱、紫菜等红藻中提取的一种藻胶，它是由琼脂糖和琼胶质组成的长链多糖化合物。其优点在于不能被细菌分解利用，在细菌培养的温度下凝胶强度稳定。琼脂在细菌培养基中的应用使得细菌培养分离、纯化成为可能，极大地推动了细菌学的发展。 蛋白胨为动物蛋白经酶消化后得到的产物。蛋白胨在培养基中的主要作用是作为细菌生长代谢过程中所需要的氮源。 它的营养价值在于其中含有细菌菌体细胞生长所需要的氨基酸、多肽等成分。 胰酪蛋白胨 （Casein Tryptone） 是一种优质蛋白胨，
3、亦称胰酶消化酪蛋白胨，或称胰蛋白胨。该蛋白胨系酪蛋白经胰酶消化后，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状。可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。该蛋白胨营养丰富，为生物基因工程高密度发酵技术提供了可能。 大豆蛋白胨是由大豆蛋白经木瓜蛋白酶水解而得到的产物，营养丰富，富 2含碳水化合物和维生素。常用于培养对营养苛求的细菌。大豆蛋白胨不适合用于配制糖发酵试验培养基，因为其中含有大量的碳水化合物。 示蛋白胨是一种营养价值较高的蛋白胨，含有高比例的低分子量多肽、氨基酸以及促营养元素等。
4、它用在生产细菌毒素以及培养如奈瑟氏菌、葡萄球菌、嗜血杆菌、布鲁氏菌和棒状杆菌等对营养苛求细菌的培养基中。 牛肉浸膏是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。牛肉浸粉是用瘦牛肉加热抽提的浸出物，经喷雾干燥而形成的粉状物。它富含水溶性动物组织的营养物，如糖类、有机含氮物、水溶性维生素及无机盐等。它们的主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足。一般的用量为0.3%0.5%。 酵母粉是酵母细胞的自溶物经浓缩、喷雾干燥而成的粉状物。酵母粉富含
5、B族维生素、有机氮以及碳水化合物等。酵母粉在培养基中的含量一般为0.3%0.5%。 胆盐是一种胆酸的钠盐，它是从动物的胆汁中提取的一种混合物，含有胆酸、 结合胆酸以及胆汁醇等， 各种成分及其比例随动物的种属及贮存条件而变化。胆盐用在培养基中作为选择性抑制剂，主要抑制革兰氏阳性菌的生长。 第二节 培养基的分类 19世纪末，德国著名细菌学家科赫成功制备了固体培养基，并发明了玻璃培养皿，引起了细菌学的重大变革，同时也极大的推动了细菌的分离和鉴别。从此培养基生产成为了一项重要的产业。出现了世界闻名的英国Oxoid公司、美国BD公司和Neogen公司等专业化培养基生产厂家。我国从20世纪50年代开始研制
6、干燥培养基，到目前已有200多种干燥培养基，涌现出了以北京陆桥为代表的50多家培养基生产厂家。 培养基按营养物质的来源可分为：（1）天然培养基：由化学成分不完全明了的天然物质组成；（2）合成培养基：全部由已知化学成分的物质组成；（3） 3半合成培养基：由不明化学成分的天然物质和已知化学成分的物质组成。 培养基按物理性状可分为：（1）液体培养基：不含凝固剂，利于菌体的快速繁殖、代谢和积累产物；（2）流体培养基：含0.05%0.07%琼脂粉，可降低空气中氧进入培养基的速度， 利于一般厌氧菌的生长繁殖； （3） 半固体： 含0.2%0.8%琼脂粉，多用于细菌的动力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料
7、； （4）固体培养基：含1.5%2%琼脂，用于细菌的分离、鉴定、菌种保存及细菌疫苗制备等多方面。 培养基按功能可分为：（1）运输培养基：在取样后和实验室样品处理前的时间保护和维持微生物活性的培养基。 运输培养基中通常不允许包含使微生物的增殖的物质，但是培养基应能保护菌种，确保他们不质变 (如：Stuart 运输培养基或 Amies 运输培养基)。（2）保存培养基：用于在一定期限内保护和维持微生物活力，以防对微生物在长期保存中产生不利影响，或使微生物在长期保存后容易复苏（如：Dorset 卵黄培养基）的培养基。（3）复苏培养基：能够使受损或应激的微生物修复、使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进
8、微生物繁殖的培养基。（4）增菌培养基：大多为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供较适当的生长环境。 选择性增菌培养基：能够保证特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其它菌体生长的培养基（如：Rappaport-Vassiliads 培养基）；非选择性增菌培养基： 能够保证大多数微生物生长 （如： 营养肉汤） 的培养基。（5）分离培养基：选择性分离培养基：支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长的培养基（如：DHL 琼脂，EMB 琼脂，MarConkey 琼脂），常用的抑菌剂有胆盐、煌绿、玫瑰红钠、亚硒酸钠，常用的指示剂有溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝等，美蓝是氧化还原指示剂；非选择性分离培养基：对微生
9、物没有选择性抑制的分离培养基（如：营养琼脂） （6）鉴别培养基：能够进行一项或多项微生物生理学和生化特性鉴定试验的培养基，（如：尿素培养基，Kligler 琼脂）；能够用于分离培养的鉴别培养基被称作为分离/鉴别培养基（例如 XLD 琼脂）。（7）鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认实验的培养基。用于分离的鉴定培养基被称为分离/鉴定培养基。（8）多种用途的培养基：同时具有多种不同用途的特定培养基。例如，血琼脂是一种复苏培养基；同时又是分离培养基；用于溶血检测时为鉴别培养基。 4第二章第二章 食品微生物图谱食品微生物图谱 第一节 菌落总数 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而
10、形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。 当样品被稀释到一定程度， 与培养基混合，在一定培养条件下， 每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37C 培养 48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为
11、杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求， 以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。在进行菌落总数测定时，培养基表面有时会出现一种生长极快的蔓延菌，而影响菌落计数。解决方法是在涂布或倾注好的平板上层再覆盖一层培养基。需要注意的是，国标是用营养琼脂，而检验检疫行业标准是用平板计数琼脂。计数范围也有区别，国标是 30300，检验检疫行业标准是 25250。 平板计数琼脂 5TTC 营养琼脂以 TTC 作为菌落指示剂，TTC 即 2, 3, 5-三苯基四唑氯化物，一种菌落指示剂，遇
12、酸变红色。细菌分解糖类产酸，pH 值降低，所以，细菌在TTC 营养琼脂上显示暗红色菌落，便于计数。 细菌在 TTC 营养琼脂上的菌落特征 蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征 3M 菌落总数测试片（Aerobic Count Plate, AC）含有标准培养基，TTC 作为菌落指示剂，测试片设计有方格，便于计数。35 1C 培养 48 3h，计数红色菌落， 计数范围为 25250， 培养时测试片叠放片数小于 20。 AOAC 官方方法。 6 3M 菌落总数测试片(AC) 日水菌落总数测试板（CDTC）含有非选择性培养基，TTC 作为菌落指示剂，多数菌落显红色。计数时红色斑点计为一个菌落。 日水菌落
13、总数测试板（CDTC） 7第二节 大肠杆菌 大肠杆菌即大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，革兰氏阴性短杆菌，大小0.5m1m3m。周身鞭毛，能运动，无芽孢，兼性厌氧。能发酵多种糖类，产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素 B 和 K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为 5 类：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)
14、、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，主要寄生在大肠内。大肠杆菌在肠道中大量繁殖，几乎占粪便干重的 1/3。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标， 从而可能有肠道病原菌的存在。 因此， 常作为饮水和食物 （或药物）的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O） 、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K） ，后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为 150 多个血清型，其中有 16 个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿
15、腹泄和成人肋膜炎。它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是 1954 年在大肠杆菌 K12 菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55C 经 60min 或 60C 加热 15min 仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对
16、磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有 R 因子的质粒转移而获得的。 大肠杆菌在 EE 肉汤中，37C 培养 24h，肉汤变浑浊，颜色有绿变黄。SN、 8FDA、BAM 方法。 大肠杆菌在 EE 肉汤中的生长情况 44104：大肠肝菌，50071：伤寒沙门氏菌 大肠杆菌在 EC 肉汤中， 37C 培养 24h， 肉汤变浑浊， 并分解乳糖产生气体，在小倒管内收集有气泡。GB、SN、FDA 方法。 大肠杆菌在 EC 肉汤中的生长情况 大肠杆菌在 BGLB 肉汤中，37C 培养 24h，肉汤变浑浊，颜色消退，并分解乳糖产生气体，在小倒管内收集有气泡。 9 大肠杆菌在 BGLB 肉汤中的生长
17、情况 44104：大肠杆菌 伊红美蓝琼脂（EMB）中的伊红为酸性燃料，美蓝为碱性燃料，大肠杆菌在该培养基上可分解乳糖产酸，菌体带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽，有的菌株无金属光泽。GB、SN、FDA、BAM方法。 大肠杆菌在 EMB 上的菌落特征 10在科玛嘉 ECC 显色培养基上，37C 培养 24h，大肠菌群为红色菌落，大肠杆菌为蓝色菌落。 大肠杆菌在科玛嘉 ECC 显色培养基上的菌落特征 在陆桥大肠杆菌显色培养基上，37C 培养 24h，大肠杆菌为蓝色菌落。 3M 大肠杆菌/大肠菌群测试片(E.coli/Coliform Count Plate, EC)
18、， 含有改良的VRB 培养基，同时测定大肠杆菌和大肠菌群。351C，24h48h 内即可获得结果，计数范围 15150，带气泡的蓝色和红色菌落为大肠菌群，带气泡的蓝色菌 11落为大肠杆菌，培养时测试片叠放片数小于 20。AOAC 官方方法。 3M 大肠杆菌/大肠菌群测试片(EC) 日水大肠菌群/大肠杆菌测试板（CDEC）由于存在特殊的显色底物 X-gluc和 Magenta-Gal，大肠杆菌产生蓝色菌落，大肠菌群产生红色菌落。 大肠菌群/大肠杆菌测试板（CDEC） 12第三节 大肠菌群和粪大肠菌群 作为一种卫生指标菌，大肠菌群与大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染，大肠菌
19、群的存在并不代表对人有什么直接的危害。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌等） 。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。大肠菌群检测方法比大肠杆菌要简单地多，所以日益受到重视。 粪大肠菌群，也称作耐热大肠菌群，与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，粪大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，与大肠菌群相比，粪大肠菌群在食品中的检出，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。
20、 粪大肠菌群比大肠菌群更能贴切地反应食品受到人和动物粪便污染的程度。 大肠菌群在月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）里，分解乳糖产生气体，在小倒管内有气泡出现。SN、FDA、BAM 方法。 大肠菌群在 LST 试管中的产气现象 大肠菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）上，典型菌落为紫红色。SN 13方法。 大肠菌群在 VRBA 上的菌落特征 大肠菌群在去氧胆酸盐琼脂(DC)上， 典型菌落为红色， 菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 2 mm3mm 或更大。 大肠菌群在去氧胆酸盐琼脂(DC)上的菌落特征 在科玛嘉 ECC 显色培养基上，大肠菌群为红色菌落，而大肠杆菌为蓝色菌落。 14 大肠菌群
21、在科玛嘉 ECC 显色培养基上的菌落特征 在 OXOID 选择性大肠杆菌/大肠菌群显色培养基上，大肠菌群为红色菌落，而大肠杆菌为蓝色菌落。 大肠菌群在 OXOID 选择性大肠杆菌/大肠菌群显色培养基上的菌落特征 3M 大肠菌群测试片(Coliform Count Plate, CC)含有改良的 VRB 培养基。35 1C 培养 24 2 h，红色带气泡的菌落为目标菌落，计数范围 15150，培养时叠放片数小于 20。AOAC 官方方法。 15 3M 大肠菌群测试片(CC) 3M 高灵敏度大肠菌群测试片(High-Sensitivity Coliform Count Plate, HSCC)含有
22、改良的 VRB 培养基，灵敏度 1cfu/5mL 或 1cfu/g。35 1C 培养 24 2 h，红色带气泡的菌落为目标菌落，粉红色晕圈辅助判读，培养时叠放片数小于 10。AOAC 官方方法。 3M 高灵敏度大肠菌群测试片（HSCC） 3M 快速大肠菌群测试片可以快速的检测大肠菌群，测试片中含有改良的 16VRB 培养基和酸检测的 pH 指示剂。 培养时叠放片数小于 20， 35 1C， 培养 6h14h，推测大肠菌群；培养 24h，可确认大肠菌群。推测性判读：通过产酸区域计数大肠菌群(6h14h)，计数有或没有红点的黄色区域为推测的大肠菌群数。确定性判读：24 h 进行菌落计数，计数红色带
23、气泡的菌落为大肠菌群。 3M 快速大肠菌群测试片推测性判读 3M 快速大肠菌群测试片确定性判读 日水大肠菌群测试板 （CDCF） 培养基内含有 X-Gal 显色酶底物存在， 35C37C 培养 24h， 大肠菌群的菌落呈现蓝绿色或者蓝色； 培养基对大肠菌群有选择性，非大肠菌群菌落形成后没有颜色。 大肠菌群日水大肠菌群测试板（CDCF） 17第四节 肠杆菌科 国际肠杆菌科小组委员会（1962） 、Bergey 氏分类系统细菌学手册（1984）和 W.H Ewing 氏 著 肠 杆 菌 科 鉴 定 （ 1986 ） 一 书 中 均 将 肠 杆 菌 科（Enterobacteriaceae）定义为：
24、革兰氏阴性无芽孢杆菌，需氧、兼性厌氧，还原硝酸盐为亚硝酸盐，发酵利用葡萄糖产酸或产酸、产气，氧化酶阴性。据细菌学新的分类， 肠杆菌科现已包括肠道病原性和非病原性的大肠艾希氏菌、 志贺氏菌、爱德华氏菌、沙门氏菌、亚利桑那菌、枸橼酸杆菌、克雷伯氏菌、肠杆菌、团聚肠杆菌、哈夫尼亚菌、沙雷氏菌、变形杆菌、耶尔森氏菌、欧文氏菌 14 个菌属及其他 9 个菌群的细菌。故以其作为卫生指标菌比大肠菌群等更敏感，更准确。 目前在世界各地广泛采用大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌作为食品卫生指标菌，但在欧洲还大量使用肠杆菌科作为指标菌并且已有多年历史。其优点是可以消除因大肠菌群、 粪大肠菌群产气特性随检验方法和实验条
25、件不同而造成的不准确性；检出肠杆菌科可以认为加工后产品再次污染细菌，因此大大提高了以大肠菌群或粪大肠菌群试验来证明食品加工不当的敏感性。 目前北欧食品分析委员会（NMKL）及 ISO 已制定了食品中肠杆菌科检验的标准方法。 检测肠杆菌科较大肠菌群的优点是：首先它是食品加工中卫生状况的优良指示菌，包含多种指示菌，能检测非乳糖发酵菌，如沙门氏菌，志贺氏菌等。另外大肠菌群检测的局限性：缺乏对乳糖发酵阴性菌的检测，如沙门氏菌，志贺氏杆菌，耶尔森氏菌；专一性差，会检出非肠道菌，如沙雷氏菌、气单胞菌。 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）又称作肠道菌计数琼脂，肠杆菌科细菌在该培养基上可生成有或无沉淀环
26、的粉红色至红色菌落，直径 0.5mm 或更大。SN、FDA 方法。 18 肠杆菌科细菌在 VRBGA 上的菌落特征 44104：大肠杆菌，50115：鼠伤寒沙门氏菌 3M 肠杆菌科测试片（Enterobacteriaceae Count Plate, EB）含有改良的 VRB培养基和酸检测的 pH 指示剂。37 1C 培养 24 2 h，计数红点带黄色区域，或红点带气泡的菌落，或红点带有两者的菌落为肠杆菌科。培养时叠放片数小于20。AOAC 官方方法。 3M 肠杆菌科测试片(EB) 19第五节 沙门氏菌 沙门氏菌(Salmonella)属于肠杆菌科，是一大群形态、生化性状及抗原构造相似的革兰氏
27、阴性杆菌。 沙门氏菌无芽孢， 无荚膜， 多数细菌有周身鞭毛和菌毛，有动力。沙门氏菌能在简单的培养基上生长，含有煌绿或亚硒酸盐的培养基可抑制大肠杆菌的生长而起到选择性增菌作用。沙门氏菌生长的最佳温度为 35C37C，最佳 pH 值为 6.57.5。沙门氏菌的抗原结构是其分类的重要依据，其抗原可分为菌体抗原(O 抗原)、鞭毛抗原(H 抗原)和表面抗原(Vi 抗原)三种。按菌体抗原结构的不同，可分为 A、B、C、D、E、F、G、H、I 等血清群，再按鞭毛抗原的不同而鉴别组内的各血清型。目前，已知沙门氏菌共有 2000 多种血清型，在我国已发现有 161 个血清型，但从人类和动物经常分离出的血清型却只
28、有4050 种，其中仅有 10 种是主要血清型。与人类有关的血清型主要隶属于 AE 组，即伤寒杆菌、甲、乙、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌、 鸭沙门氏菌、 新港沙门氏菌等， 仅少数几种对人致病， 其中以鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。沙门氏菌在自然界有广泛的宿主，少数沙门氏菌对宿主有选择性， 绝大多数对人和动物均适应， 可寄居在哺乳类、 爬行类、鸟类、昆虫及人的胃肠道中。 亚硒酸盐胱氨酸增菌培养基（Selenite Cystine，SC）中的亚硒酸盐能对食品中的沙门氏菌选择性增菌，亚硒酸和蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫的代谢，从而抑
29、制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。但一般蛋白胨的含硫氨基酸很少，故需要加胱氨酸，以增强抑菌作用。此外，胱氨酸也有增进沙门氏菌生长的作用，还能减少亚硒酸盐对细菌的毒性，并可提供必需的氨基酸，有利于细菌生长。GB、SN、FDA、BAM 方法。 20 沙门氏菌在 SC 中的生长情况（右管为接菌管） 50115：鼠伤寒沙门氏菌 四硫磺酸盐基础培养基(Tetrationate Broth Base，TTB)中的胆盐为抑菌剂，能够抑制革兰氏阳性球菌的生长，硫代硫酸钠和碘所生产的四硫磺酸，能部分抑制大肠埃希氏菌的生长。沙门氏菌由于具有产四硫磺酸酶的特性，能分解四硫磺酸，因而能在 TTB 培养基中生长而
30、增殖。 （GB、SN、FDA、BAM 标准） 沙门氏菌在 TTB 中的生长情况（左管为接菌管） RVS（Rappaport Vassiliadis Soy Broth）肉汤用于肉制品、乳制品、粪便以及污水中沙门氏菌的选择性增菌。 培养基中大豆蛋白胨提供菌体细胞生长所需要的氮源、碳源等；氯盐可以提高培养基体系的渗透压，磷酸盐作为缓冲体系维持 21培养基酸性环境（pH5.2） ，孔雀绿可以抑制非沙门氏菌属细菌的生长。该培养基的选择性表现在高渗透压、低 pH 以及孔雀绿的抑菌作用。 （ISO 标准） 沙门氏菌在 RVS 中的生长情况（左管为接菌管） MKTTn（Muller Kauffmann wi
31、th Tetrathionate and novobiocin Broth Base）肉汤基础用于沙门氏菌属细菌的选择性增菌培养。酪胨、牛肉浸粉在培养基中作为基础营养物质提供菌体细胞生长所需的氮源、碳源及其他的营养元素等；NaCl维持体系渗透压平衡；CaCO3能中和吸收毒素代谢物质(主要是培养基酸碱度的变化对细菌生长的影响)； 胆盐抑制革兰氏阳性菌； Na2S2O3经 I2氧化生成四硫磺酸钠，对大肠菌群有抑制作用；煌绿可抑制大部分非沙门氏菌。 （ISO 标准） 沙门氏菌在 MKTTn 中的生长情况（左管为接菌管） 22三糖铁琼脂（TSI）适用于肠杆菌科的鉴定，用以观察细菌对糖的利用和硫化氢的产
32、生，培养基中乳糖、蔗糖和葡萄糖之比为 10101，沙门氏菌由于只发酵其中的葡萄糖，所产生的酸少，只有在培养基的底部（厌氧）呈酸性反应，而在表面的酸 （有氧） 被进一步氧化， 加之氮代谢的碱性产物也可中和少量的酸，使其呈中性或微碱性，因为指示剂是酚红，所以，外观呈红色，只有底部颜色有些偏黄。另一方面，能发酵乳糖的细菌（如大肠杆菌）则在底部产生大量的酸，并扩散至表面，使得整个培养基呈黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢遇到培养基中的铁盐，形成黑色的硫化亚铁。而三糖铁琼脂中的硫代硫酸钠作为还原剂，能保持还原环境，使产生的硫化氢不至被氧化。在总之，在三糖铁琼
33、脂上，沙门氏菌上层产碱显红色，下层产酸显黄色，培养基发黑（产硫化氢）或不发黑（不产硫化氢） 。 （GB、SN、ISO、FDA、BAM 标准） 沙门氏菌在三糖铁琼脂斜面上的颜色特征（右三管为沙门氏菌） 有些细菌能产生尿素酶而分解尿素琼脂中的尿素，产生大量的氨，使培养基的 pH 值升高，指示剂酚红由黄色变为粉红色。而沙门氏菌为尿素酶阴性菌，接种培养后尿素酶琼脂的颜色为黄色。 （GB、SN、FDA、BAM 标准） 23 沙门氏菌在尿素酶琼脂斜面上的颜色特征（右三管为沙门氏菌） 沙门氏菌能利用葡萄糖，将亚硫酸铋琼脂（BS）中的亚硫酸铋还原成硫化物，并与硫酸亚铁反应形成黑色菌落。由于沙门氏菌菌落内部有一
34、个内部电势向外扩散，从而导致菌落具有强还原力，将硫酸盐和亚硫酸盐还原成硫化物，由于铁离子的存在， 呈现黑色并集中于菌落中心， 四周逐渐淡化， 形成黑色或褐色环。此外，由于铋离子被还原为金属铋，使菌落呈现金属光泽。沙门氏菌在亚硫酸铋琼脂上培养 24h 后，可形成三种不同的菌落：深黑色菌落，大小为 2mm，扁平的菌落，并有向周围扩散的灰褐色晕环；灰黑色至灰褐色菌落，大小为 2mm3mm，圆形，光滑、湿润、突起，周围有向外扩散的灰褐色晕环，多数沙门氏菌属于此类（如下图） ；浅灰色菌落，一般较大，直径为 2mm4mm，突起黏液状，有向周围扩散或无扩散的灰褐色晕环。 24 沙门氏菌在 BS 琼脂上的菌落
35、特征 大肠杆菌 44104 在 BS 琼脂上的菌落特征 HE 琼脂（Hekton Enteric Agar）的特点是在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂和指示剂。如胆盐、枸橼酸盐、硫代硫酸钠等都可以抑制肠道致病性革兰氏阳性菌的生长。溴麝香草酚蓝及酸性复红为指示剂。沙门氏菌在 HE琼脂上培养 24h 后可形成两种不同的菌落：一类菌落大小为 2mm3mm，绿色至蓝绿色，中央有黑色沉淀物；另一类菌落大小约为 2mm，绿色至蓝绿色，无黑色沉淀物。亚利桑那沙门氏菌，因为发酵乳糖，可形成橙黄色带黑心的菌落，直径约为 2mm。利用乳糖的其它不产硫化氢的细菌为黄色菌落。有些柠檬杆菌（Citrobact
36、er） ，因为发酵乳糖，也可形成橙黄色带黑心的菌落，但柠檬杆菌形成 25的黑色中心比起亚利桑那沙门氏菌相对较小， 要注意这两种菌的区别。 GB、 FDA、BAM 方法。 沙门氏菌（硫化氢阳性）在 HE 琼脂上的菌落特征（黑色中心菌落） 沙门氏菌（硫化氢阴性）在 HE 琼脂上的菌落特征 26 亚利桑那沙门氏菌在 HE 琼脂上的菌落特征（黑色中心菌落） 柠檬杆菌在 HE 琼脂上的菌落特征 27 其它乳糖阳性硫化氢阴性的肠道菌在 HE 琼脂上的菌落特征 几种细菌在 HE 琼脂上的菌落特征比较图 50115：鼠伤寒沙门氏菌；51571：弗氏志贺氏菌；44104：大肠杆菌 沙门氏菌在 WS 琼脂上同 H
37、E 琼脂上的特征相似， 培养 24h 后可形成两种不同的菌落：一类菌落大小为 2mm3mm，绿色至蓝绿色，中央有黑色沉淀物；另一类菌落大小约为 2mm，绿色至蓝绿色，无黑色沉淀物。亚利桑那沙门氏菌，因为发酵乳糖，可形成橙黄色带黑心的菌落，直径约为 2mm。GB 方法。 28 沙门氏菌在 WS 琼脂上的菌落特征 木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂 （XLD） 中的去氧胆酸钠能够抑制一般革兰氏阳性菌的生长，在该培养基中去氧胆酸钠的浓度下，也可以部分地拟制大肠埃希氏菌的生长，而不影响沙门氏菌和志贺氏菌的生长。沙门氏菌培养 24h 后，大多数可形成浅粉色带黑心的菌落，大小约为 2mm，光滑、湿润、边缘整齐。亚利桑
38、那沙门氏菌， 因为发酵乳糖， 可形成带黑心的黄色菌落， 直径约为 2mm。 ISO、 FDA、BAM 方法。 沙门氏菌在 XLD 上的菌落特征 胆硫乳琼脂 （DHL） 中的去氧胆酸钠和枸橼酸钠能较强的抑制一般革兰氏阳 29性菌的生长，达到对沙门氏菌的选择性分离作用。沙门氏菌培养 24h 后，产生硫化氢的沙门氏菌可形成带有黑心的菌落，大小为 2mm3mm，圆形、突起、湿润、边缘整齐。不产生硫化氢的沙门氏菌，菌落中心无黑色沉淀物。亚利桑那沙门氏菌，因为发酵乳糖和产生硫化氢，形成红色带黑心的菌落。利用乳糖的其它不产硫化氢的细菌为红色菌落。GB、SN 方法。 沙门氏菌（硫化氢阳性）在 DHL 琼脂上的
39、菌落特征 沙门氏菌（硫化氢阴性）在 DHL 琼脂上的菌落特征 30 亚利桑那沙门氏菌在 DHL 琼脂上的菌落特征 其它乳糖阳性硫化氢阴性的肠道菌在 DHL 琼脂上的菌落特征 在亚利桑那琼脂（SA）上，沙门氏菌培养 24h 后，形成黄色有暗蓝色中心的菌落，菌落周围培养基中有黄色沉淀物，亚利桑那沙门氏菌为粉红色有黑色中心的菌落，有时全黑色，周围培养基呈红色。SN 方法。 31 沙门氏菌在 SA 琼脂上的菌落特征 亚利桑那沙门氏菌在 SA 琼脂上的菌落特征 在麦康凯琼脂（MacC）上，沙门氏菌培养24h后，典型菌落呈透明、无色，形成圆形、突起、湿润、光滑的菌落，有时带有暗色中心。 32 几种细菌在
40、MacC 琼脂上的菌落特征比较图 49005：奇异变形杆菌，50115：鼠伤寒沙门氏菌，44104：大肠杆菌 在伊红美蓝琼脂（EMB）上，沙门氏菌培养 24h 后，形成比培养基颜色稍浅，半透明至不透明的菌落，菌落大小为 2mm3mm。 沙门氏菌在 EMB 琼脂上的菌落特征 Salmonella Shigella（SS）琼脂用于沙门氏菌、志贺氏菌的选择性分离。沙门氏菌属与志贺氏菌属细菌因不发酵乳糖只分解蛋白胨而产生碱性物质， 所以菌 33落不着色，呈半透明。大肠杆菌能发酵乳糖产酸使胆酸盐沉淀，故菌落呈红色，或显红色之中心。某些变形杆菌和沙门氏菌的菌落中心为黑色，这是产硫化氢的缘故。GB方法。 沙
41、门氏菌在SS琼脂上的菌落特征 在亮绿琼脂（BGA）上，沙门氏菌培养24h后，典型沙门氏菌显粉红色。菌落大小为2mm3mm。FDA方法。 沙门氏菌在BGA琼脂上的菌落特征 34在科玛嘉(CHROMagar)沙门氏菌显色培养基上，沙门氏菌培养培养 24h 后，典型沙门氏菌显紫红色。菌落大小为 2mm3mm。 沙门氏菌在科玛嘉沙门氏菌显色培养基上的菌落特征 沙门氏菌在陆桥(Landbridge)沙门氏菌显色培养基上，沙门氏菌培养培养24h后，典型沙门氏菌显紫红色。菌落大小为2mm3mm。 沙门氏菌在陆桥沙门氏菌显色培养基上的菌落特征 35第六节 单核细胞增生李斯特氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌(Lis
42、teria monocytogenes)属于李斯特氏菌属，为革兰氏阳性短小杆菌，大小约为 0.4m0.5m1.0m2.0m, 直或稍弯，两端钝圆，常呈 V 字型或成双排列，偶尔可见双球状。该菌为兼性厌氧菌，不产生芽孢，一般不形成荚膜，对营养要求不高，在普通培养基上能生长，但在含血液、血清的培养基上生长更好。最适培养温度为 30C37C。在 20C25C培养有动力，穿刺培养 25 天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，也是最重要的人类食源性病原菌， 能引起人畜的李斯特氏菌病。 该菌广泛分布于自然界中， 如土壤、人体和动物的粪便中，
43、很容易污染食品，引起人的食物中毒。该菌在 4C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，有嗜冷菌一称。在冷藏食品微生物检验中，必须加以重视。 单核细胞增生李斯特氏菌在 Fraser 肉汤中 35C37C 培养 18h24h 后，可分解 Fraser 肉汤中的七叶苷，使颜色变黑。SN、ISO 方法。 单核细胞增生李斯特氏菌在 Fraser 肉汤中的颜色变化 在含 0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)上，用 45 度入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。GB、SN、ISO、FDA、 36BAM 方法。 单核细胞增生李斯特氏菌在在 TSA
44、-YE 上的菌落特征（45 度入射光照射） 在 PALCAM 琼脂上，单核细胞增生李斯特氏菌在 35C 培养 24h48h 后，形成灰绿色菌落，其外围有一黑色环。ISO、FDA、BAM 方法。 单核细胞增生李斯特氏菌在在 PALCAM 琼脂上的菌落特征 在牛津琼脂(OXA)上， 单核细胞增生李斯特氏菌在 35C 培养 24h48h 后，形成灰绿色菌落，其外围有一黑色环。GB、SN、ISO、FDA、BAM 方法。 37 单核细胞增生李斯特氏菌在 OXA 上的菌落特征 在陆桥李斯特氏菌显色培养基上，单核细胞增生李斯特氏菌 37C 培养 24 h28h，平板上出现绿色菌落，菌落周围有一不透明环。英诺
45、克李斯特氏菌 37C培养 48h，平板上出现绿色菌落，菌落周围没有不透明环。 单核细胞增生李斯特氏菌在陆桥李斯特氏菌显色培养基上的菌落特征 在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基平板上， 单核细胞增生李斯特氏菌 37C 培养 24h48h，平板出现蓝色菌落，菌落周围有一不透明环。 38 单核细胞增生李斯特氏菌在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上的菌落特征 在血平板琼脂上， 单核细胞增生李斯特氏菌形成灰白色菌落， 产生 -溶血现象。 单核细胞增生李斯特氏菌在血平板琼脂上的菌落特征 3M 环境李斯特氏菌属测试片适用于环境样品的检测，检测李斯特氏菌属，35C37C 培养 282 h，紫红色菌落，可作定性、半定量和定
46、量判读，无需增菌，仅需 1h1.5h 修复，便于室内操作。 39 40第七节 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌（Staplylococcus aureus）属于葡萄球菌属，典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径 0.8m 左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度 37C，最适生长 pH 7.4。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在 10%15%NaCl 肉汤中生长。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色
47、葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金黄色葡萄球菌在胰酪胨大豆肉汤（TSB）或 10NaCl 胰酪胨大豆肉汤中培养 24h48h 后呈浑浊生长。GB、SN、FDA、BAM 方法。 金黄色葡萄球菌在 TSB 的生长情况 在 BP（Baird-Parker）琼脂上，金黄色葡萄球菌呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，直径 2mm3mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色 ( 非白色 ) 的边缘，周围绕以不透明圈 ( 沉淀 )，其外常有一清晰带 (卵磷脂环)。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌
48、株， 除没有不透明圈和清晰带外， 其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌 41落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。其它葡萄球菌虽然也显示灰黑色至黑色，但是没有不透明圈 (沉淀) 和清晰带（卵磷脂环）出现。GB、SN、ISO、FDA、BAM 方法。 金黄色葡萄球菌在 BP 琼脂上的菌落特征 其它葡萄球菌在 BP 琼脂上的菌落特征 在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基上，典型的金黄色葡萄球菌呈红色菌 42落。 金黄色葡萄球菌在科玛嘉显色培养基上的菌落特征 在陆桥金黄色葡萄球菌显色培养基上，典型的金黄色葡萄球菌呈红色菌落。 在卵黄甘露醇高盐琼脂培养基（Egg-Yol
49、k Manmitol Salt Agar Base）上，金黄色葡萄球菌的典型特征是菌落显褐色，外围有一黄色的晕圈。 43 金黄色葡萄球菌在甘露醇高盐琼脂培养基上的菌落特征 金黄色葡萄球菌在血平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径 1 mm2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。 金黄色葡萄球菌在血平板脂培养基上的菌落特征 金黄色葡萄球菌在 DNA 酶琼脂上，菌落呈灰黑色，外围有白色晕圈。 44 金黄色葡萄球菌在 DNA 酶琼脂上的菌落特征 金黄色葡萄球菌在 Vogel-Jonnson 培养基上，菌落呈黑色，外围有白色晕圈。 金黄色葡萄球菌在 Vogel-Jonnson 培养基上的菌落特征 金黄色
50、葡萄球菌在卵磷脂吐温 80 琼脂上， 菌落呈金黄色， 外围有白色晕圈。 45 金黄色葡萄球菌在卵磷脂吐温 80 琼脂上的菌落特征 26003：金黄色葡萄球菌 在甲苯胺蓝 DNA 酶琼脂上，金黄色葡萄球菌刺破接种线周围形成浅粉红色的晕圈，其它细菌培养基颜色无变化。 金黄色葡萄球菌在甲苯胺蓝 DNA 酶琼脂上的菌落特征 11529 和 26003：金黄色葡萄球菌；46114：肺炎克雷伯氏菌 3M 金黄色葡萄球菌快速测试片含改良 Baird-Parker 培养基，同 3 个 BP 平板加一个凝固酶试管的方法等效，24 2 h 即可获得确认结果，紫红色菌落确认为金黄色葡萄球菌，计数范围 15150，出