《（本科）7第4章 基因组测序技术ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《（本科）7第4章 基因组测序技术ppt课件.ppt（26页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、课程主讲人：（本科）7-第4章 基因组测序技术ppt课件DNA测序速度在过去测序速度在过去30年中以几何级数递增年中以几何级数递增DNADNA的复制为半的复制为半保留复制。由于保留复制。由于DNADNA单链复制延单链复制延伸时只能以核苷伸时只能以核苷酸单体的酸单体的5-5-磷磷酸基团与前一个酸基团与前一个核苷酸的核苷酸的3-3-羟羟基缩合生成磷酸基缩合生成磷酸酯键。因此酯键。因此DNADNA复制复制是以是以5533方式进行。方式进行。一个理想的一个理想的链终止法链终止法测测序序DNADNA聚合酶聚合酶应该具有应该具有以下特点：以下特点：1 1）复制时可有效复制时可有效掺入双掺入双 脱氧核苷酸脱
2、氧核苷酸或其它修或其它修 饰类似物（如荧光标饰类似物（如荧光标 记）；记）；2 2）具有较高的具有较高的加工性能加工性能；3 3）在在缺少外切核酸酶活缺少外切核酸酶活 性性时仍然具有很高的时仍然具有很高的 保真度保真度；4 4）能产生能产生清晰的一致的清晰的一致的 信号信号用于读序。用于读序。天然天然DNADNA聚合酶不能直接聚合酶不能直接 用于用于DNADNA测序测序，必须，必须 进行进行改造改造。1 1）Klenow Klenow (E.coli DNA(E.coli DNA聚合酶片段聚合酶片段) )： 加工性能低（加工性能低（ 15 nt ），具），具5 3和和3 5外切核酸酶活性；外切
3、核酸酶活性；已弃用已弃用2 2）T7 DNA PolT7 DNA Pol: : 需硫氧还蛋白辅助需硫氧还蛋白辅助，加工性能达，加工性能达 800 nt，具，具3 5 外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，保真度高保真度高；常规测序常规测序3 3）Taq DNA PolTaq DNA Pol: : 耐热聚合酶耐热聚合酶（最适温度（最适温度7272O O C C，100 nt/sec），），缺缺3 5 外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，保真度低保真度低，错错配率配率1/9 000，合成，合成3 -端具端具A突出；突出；PCR测序测序4) 4) PfuPfu DNA PolDNA Pol: : 耐热聚合酶耐
4、热聚合酶（最适温度（最适温度7272O O C C ，10 nt/ sec），具），具 3 5 外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，保真度高保真度高，错配错配率率1.3/106，3 -端平端，端平端，加工性能差加工性能差；辅助；辅助 PCR测序测序目前普遍采用的测序酶为目前普遍采用的测序酶为T7 DNA聚合酶的聚合酶的改造型改造型T7 Sequenase和改造型和改造型Taq DNA Pol。噬菌体噬菌体T7 DNA聚合聚合酶的特点如下：酶的特点如下：1）T7 DNA聚合酶的体聚合酶的体内活性需要内活性需要硫氧还蛋硫氧还蛋白白，可提高，可提高T7 Pol加工性能加工性能100倍倍, 从一从一次延伸
5、数个次延伸数个nt到一次到一次延伸延伸800 nt；2）T7 DNA聚合酶聚合酶缺少缺少5 3外切核酸酶活性外切核酸酶活性；3）T7 DNA聚合酶聚合酶具有很强的具有很强的单链和双单链和双链链DNA 3 5外切核外切核酸酶活性酸酶活性，这一活性，这一活性受受EDTA，还原剂及，还原剂及铁离子等影响。铁离子等影响。T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶结构简单结构简单，复制效率好于大肠杆菌，复制效率好于大肠杆菌DNADNA聚聚合酶合酶I I（DNA polymerase IDNA polymerase I）的）的KlenowKlenow片断，后者加工片断，后者加工性能只有性能只有15nt15nt。
6、 AMVAMV逆转录酶可达逆转录酶可达200nt, 200nt, 但复制速率但复制速率太低，每秒仅延伸数个核苷酸。此外，太低，每秒仅延伸数个核苷酸。此外，T7 DNAT7 DNA聚合酶最聚合酶最大的优点是不排斥大的优点是不排斥ddNTP,ddNTP,适合适合SangerSanger法测序。法测序。1 1） T7 DNA PolT7 DNA Pol: : 消除消除3-53-5外切核酸酶活外切核酸酶活 性，性，提高提高产生产生一致性的清晰条带一致性的清晰条带；2 2）Taq DNA PolTaq DNA Pol: : 消除排斥消除排斥ddNTPddNTP的倾向的倾向，提，提 高合成效率。高合成效率
7、。T7 DNA聚合酶用于聚合酶用于Sanger法测序的一法测序的一个个阻碍阻碍是其是其3 5外外切核酸酶活性切核酸酶活性，在，在dNTP溶度降低溶度降低时会时会干扰测序干扰测序，甚至降解，甚至降解DNA。通过突变去除。通过突变去除天然天然T7 DNA聚合酶聚合酶28aa组成的外切核酸组成的外切核酸酶活性结构域中酶活性结构域中144-157 aa可使可使3 5外切外切核酸酶活性丢失核酸酶活性丢失，但，但不影响其聚合酶功能不影响其聚合酶功能。耐热性耐热性DNA聚合酶聚合酶在在PCR循环测序中循环测序中有特别的优势，但有特别的优势，但有有排斥排斥ddNTP的倾的倾向，可达向，可达10 000倍倍。这
8、一特点这一特点决定决定于于DNA聚合酶中的聚合酶中的单单个氨基酸个氨基酸（T7, 526F，苯丙氨酸苯丙氨酸; DNA聚聚合酶合酶 I, F762，酪氨，酪氨酸酸; Taq , F667）。）。更换更换这一这一氨基酸氨基酸，可可消除消除聚合酶对聚合酶对ddNTP的排斥的排斥倾向。倾向。注：聚合酶注：聚合酶O螺旋位置苯丙氨酸排斥螺旋位置苯丙氨酸排斥ddNTP 第一代第一代DNA测序的特点：测序的特点： 1）间断测序间断测序（双脱氧核苷酸）（双脱氧核苷酸） 2）单一测序单一测序 （单一模板（单一模板DNA） 3）携带标记携带标记（同位素或荧光）（同位素或荧光） 4）限长测序限长测序（长度有限）（长
9、度有限）第一代第一代DNADNA测序的原测序的原理是依据理是依据SangerSanger设计设计的双脱氧核苷酸渗入的双脱氧核苷酸渗入法，必须同时法，必须同时分别进分别进行行4 4组反应组反应。每组反。每组反应中都有一种不同的应中都有一种不同的用用3232P P同位素标记的同位素标记的双脱氧核苷酸加入双脱氧核苷酸加入DNADNA复制单个反应液复制单个反应液。终止反应双脱氧核。终止反应双脱氧核苷酸的位置可以通过苷酸的位置可以通过测序凝胶测序凝胶DNA电泳电泳检测，经检测，经X-光片曝光光片曝光显示。根据显示。根据每个泳道每个泳道相邻的碱基条带相邻的碱基条带推测推测DNA序列。序列。双脱氧核苷酸的双
10、脱氧核苷酸的荧光荧光标记技术对实现标记技术对实现DNA的的自动化测序自动化测序具有非具有非常重要的意义。由于常重要的意义。由于不同的不同的4种双脱氧核种双脱氧核苷酸苷酸可用可用不同颜色的不同颜色的荧光物质标记荧光物质标记，因而，因而在在同一组反应同一组反应中，不中，不同颜色的荧光标记核同颜色的荧光标记核苷酸可以渗入到相应苷酸可以渗入到相应的测序位置。通过检的测序位置。通过检测仪分辨荧光的颜色测仪分辨荧光的颜色，即可判读碱基序列，即可判读碱基序列A. A. 一束并列的充满凝胶的用于一束并列的充满凝胶的用于DNADNA测序的毛细管。测序的毛细管。B.B.共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的共聚焦荧光
11、扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号荧光标记信号放大并由放大并由计算机读取计算机读取碱基序列，完成碱基序列，完成自动化测序自动化测序。Nature Biotechnology 30：434439，2012 第二代第二代DNA测序的特点：测序的特点： 1）连续测序连续测序（焦磷酸反应）（焦磷酸反应） 2）平行测序平行测序 （芯片设计）（芯片设计） 3）自动化测序自动化测序（荧光判读）（荧光判读） 4）高通量测序高通量测序（达到（达到Gb级）级）焦磷酸测序技术是一种焦磷酸测序技术是一种新的新的实时实时DNADNA 测序测序技术。技术。它在它在DNADNA 聚合酶聚合酶、三磷三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光
12、酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶酸酶4 4 种酶的协同作用种酶的协同作用下，使引物延伸聚合脱下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸。氧核糖核酸。 dNTP释放释放焦磷酸焦磷酸PPiPPi、PPiPPi转换转换为三磷酸腺苷（为三磷酸腺苷（ATPATP）、）、ATPATP 在荧光素酶作用下在荧光素酶作用下催化荧光素磷酸化，随催化荧光素磷酸化，随后发生氧化反应放出荧后发生氧化反应放出荧光。光。如果渗入的如果渗入的dNTPdNTP与与模板模板DNADNA碱基不配对，碱基不配对，则不发生反应。仪器可则不发生反应。仪器可自动记录，判读掺入的自动记录，判读掺入的碱基成员。碱基成员。4
13、54测序仪测序仪每次每次的测序的测序长度最高达长度最高达400-500 bp，平均为平均为100 bpScience 281： 363-365，1998 第二代第二代DNA测序模板制备测序模板制备 a) 基因组基因组DNA在打断之后尽可能稀释，达到液在打断之后尽可能稀释，达到液滴含一个滴含一个DNA每每。b) 给给DNA片段片段加上接头加上接头，连接到磁珠连接到磁珠上。上。c)制备制备悬浮乳液，悬浮乳液，每个液滴含每个液滴含PCR单克隆单克隆DNA。d) 将乳液加热使将乳液加热使DNA变性变性成单链，使成单链，使单个液滴含单个磁珠单个液滴含单个磁珠。e) 携带携带PCR扩增的扩增的DNA模板磁
14、珠。模板磁珠。f) 反应槽中引物起始反应槽中引物起始DNA测序。测序。Nature 437：376-80，2005第二代第二代DNA测序装置测序装置由由3个主要部件组成：个主要部件组成：a) 4个核苷酸供应池个核苷酸供应池，分别盛有分别盛有A,T,C, G，通过输送管与芯片连通过输送管与芯片连接。接。b) 芯片反应槽板芯片反应槽板，每个小槽中含有携带每个小槽中含有携带DNA模板的磁珠。模板的磁珠。c) 成像判读装置成像判读装置，包括，包括摄像头，计算机与可摄像头，计算机与可视频幕。视频幕。第二代第二代DNA测序是实时连续测序。如果渗入的碱测序是实时连续测序。如果渗入的碱基正确配对，测序反应槽会
15、发出荧光，仪器将记基正确配对，测序反应槽会发出荧光，仪器将记录渗入的核苷酸录渗入的核苷酸。如果。如果连续渗入的核苷酸连续渗入的核苷酸是是相同相同的，则会发生的，则会发生等摩尔倍数亮度等摩尔倍数亮度的荧光。参照的荧光。参照设立设立的对照的对照，计算机可正确记录测序的碱基数。，计算机可正确记录测序的碱基数。第二代第二代DNA测序结合了芯片技术，在每平方毫米的芯片上测序结合了芯片技术，在每平方毫米的芯片上可安装可安装480个小槽。每个小槽含一个磁珠，直径约个小槽。每个小槽含一个磁珠，直径约28 um ，可携带可携带1000万个万个DNA模板模板，产生足够的荧光供检测分辨。，产生足够的荧光供检测分辨。
16、每块芯片总共每块芯片总共160万个反应槽万个反应槽，可平行测序。每轮，可平行测序。每轮4次加样，次加样，依次为依次为A,T,C,G。一次测序执行一次测序执行44轮总计约轮总计约156次反应次反应。根。根据统计，二代测序的据统计，二代测序的平均长度为平均长度为109.9 bp, 精确度为精确度为98%。 每轮最高测序达每轮最高测序达4-6亿亿 bp. Nature 437：376-80，2005第三代第三代DNA测序的主要特征可以归结为单分子测序测序的主要特征可以归结为单分子测序（single -molecule sequencing，SMS），包括三种技术），包括三种技术路线：路线：1）基于单
17、分子基于单分子DNA合成的实时测序合成的实时测序（single-molecule real-time sequencing）；）；2）纳米孔单分子纳米孔单分子DNA电流阻遏电流阻遏(current blockage)测序测序；3）纳米孔单分子纳米孔单分子DNA碱基序列碱基序列的的电子阅读电子阅读。目前单分子目前单分子DNA测序技术总体上极不成熟。测序技术总体上极不成熟。纳米孔蛋白纳米孔蛋白-HL（A）和）和MspA (B)均为均为跨膜蛋白跨膜蛋白，各有两个相连的空腔。，各有两个相连的空腔。MspA的收缩的收缩孔道直径为孔道直径为1.3nm，比，比-HL的孔道更宽，但孔道的长的孔道更宽，但孔道的
18、长度更短。此外度更短。此外MspA上部的空腔空间更大，这一构型使其可容纳更上部的空腔空间更大，这一构型使其可容纳更多的溶液。多的溶液。DNA分子直径约分子直径约1 nm, 进入纳米孔蛋白内腔进入纳米孔蛋白内腔后，在离子后，在离子电流作用下穿越收缩区纳米孔狭道（电流作用下穿越收缩区纳米孔狭道（C），），引起离子电流改变引起离子电流改变。箭。箭头头为为DNADNA分子运动方向。当单链分子运动方向。当单链DNADNA分子通过纳米孔道时，由于碱基分子通过纳米孔道时，由于碱基会对电流产生阻遏引起电流数值的变化，可据此判别碱基的组成。会对电流产生阻遏引起电流数值的变化，可据此判别碱基的组成。 Nat Bi
19、otechnol 30: 326328，2012硅片上放置一层极薄的碳膜，中间留硅片上放置一层极薄的碳膜，中间留出纳米孔道出纳米孔道。纳米纳米孔道两侧孔道两侧的碳薄膜与的碳薄膜与电极相连电极相连，通过，通过横向电流横向电流的的监测监测识识别别逐个逐个移动的单分子移动的单分子DNA中的碱基中的碱基。上下位置的电极用。上下位置的电极用于推动溶液中的于推动溶液中的DNA单分子沿纳米孔移动。单分子沿纳米孔移动。Ib和和It：记：记录瞬时电流参数。录瞬时电流参数。Nanotechnology 23:268-296, 2012实现单分子实现单分子DNA的电子阅读必须克服一系列的的电子阅读必须克服一系列的技术难点技术难点, 主要涉及主要涉及: l1) 建立建立适合适合纳米孔单分子纳米孔单分子DNA测序的测序的平台平台; l2) 确定识别单分子确定识别单分子DNA序列的序列的技术参数技术参数; l3) 控制单分子控制单分子DNA在纳米孔道中的在纳米孔道中的移动速度移动速度, 便于电子阅读与记录。便于电子阅读与记录。