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1、课程主讲人：（本科）29-第12章 基因组进化的机制-突变与修复ppt课件1 1）突变（）突变（mutationmutation）是一种生物学现象，系指生物个体）是一种生物学现象，系指生物个体 基因组，包括病毒，核外染色体核苷酸序列发生的改基因组，包括病毒，核外染色体核苷酸序列发生的改 变。变。2 2）地球上现存的生物以及已消失的生物都有发生）地球上现存的生物以及已消失的生物都有发生DNADNA突变突变 的潜能。的潜能。3 3）突变是一把双刃剑：即可为生物进化提供原材料，又）突变是一把双刃剑：即可为生物进化提供原材料，又 会对生物个体的生存产生严重影响，如疾病与癌症。会对生物个体的生存产生严重
2、影响，如疾病与癌症。4 4）突变是）突变是如何产生如何产生的？为何能的？为何能维持维持在一个在一个合理的水平合理的水平？1 1）大肠杆菌基因组的自然突率为）大肠杆菌基因组的自然突率为5x105x10-9-9/ /碱基碱基。2 2） XUE Y等报道人类人类Y Y染色体染色体DNADNA碱基突变率约为碱基突变率约为3x103x10-8-8/ /每代每代/ /每人每人。 Curr Biol. 19 Curr Biol. 19：1453-14571453-1457，200920093）Helgason A等报道等报道人类人类Y Y染色体染色体DNADNA碱基的突变率约为碱基的突变率约为7.2 x10
3、7.2 x10-10-10/ /每每年年/ /每个位点每个位点( (PPPYPPPY, , per position per year)per position per year) 。 Nature Genetics 47 Nature Genetics 47：453-457453-457，20152015FEMS Microbiol Rev 36: 11051121, 2012DNA复制的差错最初来源于：复制的差错最初来源于：1）碱基配对会发生较高比例的）碱基配对会发生较高比例的自然错配自然错配；2）DNA聚合酶聚合酶可通过可通过选择选择识别识别使差错率保持在使差错率保持在10-4-10-5
4、之间，但仍有之间，但仍有漏检的错配碱基掺入。错配掺入的碱基通过漏检的错配碱基掺入。错配掺入的碱基通过DNA聚合酶的聚合酶的校读功能校读功能使使差错率差错率降低两个数量级降低两个数量级。最后细胞的。最后细胞的错配修复系统错配修复系统使错配率使错配率降低降低3个个数量级数量级，最终最终使使突变率突变率保持在保持在10-9 -10-10之间之间 。 Cell Res. 18 Cell Res. 18：148161148161，20082008； Nature Review/Genetics 9Nature Review/Genetics 9：594-604594-604，20082008 在在DNA
5、复制时，由于碱基自然状态的理化特点，会使碱复制时，由于碱基自然状态的理化特点，会使碱基之间发生摇摆错配。基之间发生摇摆错配。DNADNA聚合酶中，仅有部分成员具有复制校读功能聚合酶中，仅有部分成员具有复制校读功能（proofreadingproofreading），即使最忠实的），即使最忠实的DNADNA聚合酶，聚合酶，在复制时也会偶尔出现碱基错配。人类主要的在复制时也会偶尔出现碱基错配。人类主要的两个两个DNADNA聚合酶聚合酶Pol （延迟链合成）（延迟链合成）和和Pol （引导链合成）（引导链合成）的保真度维持在的保真度维持在1010-5-5-10-10-7-7之间之间。Nature R
6、eview/Genetics 9Nature Review/Genetics 9：594-604594-604，20082008。大肠杆菌大肠杆菌DNA DNA Pol IIIPol III在复制叉位置发生错配掺入时（在复制叉位置发生错配掺入时（T:TT:T或或A:AA:A），），会发生会发生矫正矫正或保留或保留错配错配两种可能。在部分事件中，两种可能。在部分事件中，Pol IIIPol III离开错离开错配碱基，导致配碱基，导致DNADNA聚合酶交换（箭头所指）。在两条错配链中，聚合酶交换（箭头所指）。在两条错配链中，Pol IIIPol III离开复制叉离开复制叉，DNADNA聚合酶聚合酶
7、Pol IV Pol IV ( (前导链前导链) )和和Pol VPol V（后随（后随链）可以竞争性地结合引物末端，进行链）可以竞争性地结合引物末端，进行跨损伤错配复制跨损伤错配复制，使突变保，使突变保留。留。人类细胞中人类细胞中DNA 聚合酶约有聚合酶约有14种，其中种，其中Pol（eta）涉及）涉及DNA跨损伤修复跨损伤修复DNA复制。研究证实，复制。研究证实， Pol在进行在进行DNA复制时：复制时：1）在模板链碱基）在模板链碱基T的位置优先的位置优先掺入掺入G而非而非正常的正常的A; 2)在模板链在模板链C的位置，的位置， Pol掺入的碱基不是掺入的碱基不是G，而是，而是T, A和和
8、C, 比例分别为比例分别为1/9, 1/10合合1/11。 Zhang Y et al. Molecular and Cellular Biology 20:70997108, 2000 DNA复制或修复过程中产生的碱基突变，是人类癌症发生复制或修复过程中产生的碱基突变，是人类癌症发生的主要原因。的主要原因。细胞弱碱性状态使胞嘧啶细胞弱碱性状态使胞嘧啶4C4C上的氨基脱去生成尿嘧啶。生上的氨基脱去生成尿嘧啶。生成的尿嘧啶可被细胞修复系统切除修复。成的尿嘧啶可被细胞修复系统切除修复。甲基化胞嘧啶甲基化胞嘧啶脱氨基脱氨基(5mC)(5mC)生成胸腺嘧啶生成胸腺嘧啶(T)(T)，与正常胸腺，与正常胸
9、腺嘧啶无法区分，在下一轮嘧啶无法区分，在下一轮DNADNA复制时该位置由复制时该位置由T T取代。取代。哺乳动物哺乳动物每天每个细胞约每天每个细胞约100100个胞嘧啶发生脱氨基个胞嘧啶发生脱氨基，腺嘌，腺嘌呤和鸟嘌呤脱氨基比例比胞嘧啶脱氨基低呤和鸟嘌呤脱氨基比例比胞嘧啶脱氨基低100100倍。这是倍。这是真核生物基因组真核生物基因组A/TA/T比例高于比例高于G/CG/C的重要原因。的重要原因。细胞在自然条件下会细胞在自然条件下会水解水解DNADNA中核苷酸的中核苷酸的碱基和五碳糖碱基和五碳糖之间之间N-beta-N-beta-糖苷键糖苷键，产生，产生缺少碱基的核苷酸残基缺少碱基的核苷酸残基
10、，称为，称为APAP位位(apurinic/apyrimidinic site, 缺嘌呤缺嘌呤/缺嘧啶位点缺嘧啶位点）。据推据推算，自然状态细胞算，自然状态细胞DNADNA的核苷酸的核苷酸脱嘌呤脱嘌呤的比例约为的比例约为1/10 1/10 000000，脱嘧啶脱嘧啶的比例约为的比例约为1/5001/500。 DNA DNA分子的分子的APAP位点位点可由可由细胞的细胞的碱基缺失修复碱基缺失修复机制更正。机制更正。DNADNA序列中有许多由序列中有许多由简单重复序列简单重复序列的组成的组成的区段，如的区段，如-AAAAAA-AAAAAA-,-AGAGAGAGAG-,-CAG ,-AGAGAGAG
11、AG-,-CAG CAGCAGCAG-CAGCAGCAG-等。这些等。这些区段因结构原因，在区段因结构原因，在DNADNA复制时会发生复制时会发生滑滑序复制序复制(replica-(replica-tion slippage)tion slippage)。例。例如如-AAAAAA-AAAAAA-序列在复序列在复制时会产生环突结构制时会产生环突结构。如果环突结构出现。如果环突结构出现在新合成链，则会产在新合成链，则会产生插入突变。如环突生插入突变。如环突发生在模板链，则会发生在模板链，则会产生缺失突变。产生缺失突变。a）在到达三碱基重复区（）在到达三碱基重复区（CAG）n之前，之前，复制酶复制酶
12、Pol 和解旋酶和解旋酶之间是严之间是严格格偶联偶联的，在复制叉上彼此协调。的，在复制叉上彼此协调。b) 当聚合酶遇到当聚合酶遇到CAG串接重复序串接重复序列时，聚合酶的加工能力放缓，但解旋酶的行进速度不变。列时，聚合酶的加工能力放缓，但解旋酶的行进速度不变。c）为了）为了避免聚合酶与解旋酶之间的偶联脱离，引导链聚合酶会避免聚合酶与解旋酶之间的偶联脱离，引导链聚合酶会越过一段未复越过一段未复制的制的CAG模板序列模板序列，这段序列会形成，这段序列会形成环突结构环突结构，d) 其结果重复区收其结果重复区收缩。聚合酶与解旋酶之间的偶联压力是造成串接简单重复序列滑序复缩。聚合酶与解旋酶之间的偶联压力
13、是造成串接简单重复序列滑序复制的重要原因。制的重要原因。 Cell & Bioscience 2:7, 2012重复序列在代际之间的拷贝数变异可引起人类一些重要的遗传性疾病: Spinocerebellar ataxia type 1, Spinocerebellar ataxia type 1, 脊髓小脑共济失调脊髓小脑共济失调1 1型型 Friedreich ataxia,FRDA 1, Friedreich ataxia,FRDA 1, 弗里德赖希共济失调弗里德赖希共济失调 Fragile X Syndrom /FXS, X Fragile X Syndrom /FXS, X染色体脆弱症
14、染色体脆弱症 Myotonic dystrophy1, Myotonic dystrophy1,肌强直性营养不良肌强直性营养不良1 1 Myotonic dystrophy2, Myotonic dystrophy2,肌强直性营养不良肌强直性营养不良2 2a) 诱变剂与突变类型诱变剂与突变类型 上一行表示上一行表示DNA诱变剂，包括物理与化学诱变剂，包括物理与化学因子。下一行显示不同诱变剂因子。下一行显示不同诱变剂产生的产生的DNA损伤类型。损伤类型。B突变突变的效果的效果DNA损伤造成的损伤造成的3种主要种主要后果，包括影响细胞分裂后果，包括影响细胞分裂DNA的代谢紊乱导致细胞凋亡以及的代谢
15、紊乱导致细胞凋亡以及因基因突变和染色体畸变引起因基因突变和染色体畸变引起的癌变、老化和先天性遗传病的癌变、老化和先天性遗传病b) DNA损伤修复路线损伤修复路线 DNA在受到在受到内外理化等各种因子影响时会内外理化等各种因子影响时会产生不同的损伤产生不同的损伤, 细胞会启动细胞会启动DNA修复机制清除损伤的修复机制清除损伤的DNA。有。有6种种DNA损伤修复路线，它损伤修复路线，它们针对不同的们针对不同的DNA损伤状况：损伤状况：1）直接回复清除；）直接回复清除；2）错配修复）错配修复(MMR)；3）核苷酸切除修复）核苷酸切除修复(NER)；4) 碱基切除修复碱基切除修复(BER)；5) 同源
16、重组修复同源重组修复(HR)；6) 非非同源末端连接修复同源末端连接修复(NHEJ)。一）一）交联及烷基化修复交联及烷基化修复 1) 1)近邻嘧啶交联近邻嘧啶交联 2) 2)烷基化烷基化( (鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化,胞嘧啶和腺嘌呤甲基）胞嘧啶和腺嘌呤甲基） 二二) ) 单个碱基代换，切除修复单个碱基代换，切除修复，涉及单链，涉及单链 1 1）脱碱基）脱碱基(AP)(AP)切除修复，切除修复，BERBER 2 2）错配修复，）错配修复，MMRMMR三三) ) 单链核苷酸切除修复单链核苷酸切除修复，NERNER四四) ) 双链断裂，双链断裂，NHEJNHEJ和和HRHR修复修复，涉及双链，涉及双
17、链 1 1）非同源末端连接修复，）非同源末端连接修复，NHEJNHEJ 2 2） 微同源介导微同源介导末端连接修复，末端连接修复，MMEJ 3 3）同源重组修复，）同源重组修复，HRHR细胞中基因组细胞中基因组DNADNA在受到伤害时在受到伤害时会发生双链会发生双链DNADNA的断裂，这种的断裂，这种损伤必须及时修复，以免基因损伤必须及时修复，以免基因组功能受到影响。原核生物和组功能受到影响。原核生物和真核生物都有真核生物都有DNADNA双链断裂修复双链断裂修复机制，主要有两种修复路线：机制，主要有两种修复路线：1,1,非同源末端连接修复非同源末端连接修复( ( non- homologous
18、 end joining, NHEJNHEJ）( (注注, ,在在NHEJNHEJ未激活时未激活时, ,细胞采细胞采用用microhomology-mediated end joining, MMEJ),2),2）同源同源重组修复重组修复( (homologous recombi nation, HRHR)。同源种族修复必须存在同源染色体，缺少同源染色体时，只采用NHEJ修复双链断裂DNA。非同源末端连接（非同源末端连接（ Non-homologous End Joining Non-homologous End Joining，NHEJ NHEJ ）是一种不依赖于同源姐妹染色体是一种不依赖于
19、同源姐妹染色体DNADNA作为作为模板，在断裂处将两侧的断裂末端处理后直接连模板，在断裂处将两侧的断裂末端处理后直接连接的修复方法。这一方法因缺少修复模板，因而接的修复方法。这一方法因缺少修复模板，因而是一种是一种忠实度较差忠实度较差的的DNADNA修复修复模式。模式。真核生物中非同源末端连接修复方式主要发生在真核生物中非同源末端连接修复方式主要发生在G1G1期，因为期，因为G1G1期尚未期尚未DNADNA复制，缺少姐妹同源染色质复制，缺少姐妹同源染色质。在。在S S和和G2G2期，因存在姐妹同源染色质，双链期，因存在姐妹同源染色质，双链DNADNA断裂修复采取断裂修复采取HRHR（homol
20、ogous recombination,HRhomologous recombination,HR）修复模式。）修复模式。NHEJNHEJ最初最初是在是在真核生物中发现真核生物中发现的的, ,过去十年在过去十年在原核生原核生物物中中也发现存在也发现存在这一修复路线这一修复路线. .大肠杆菌缺少大肠杆菌缺少NHEJ, 但但枯枯草芽胞杆菌草芽胞杆菌和和结核分枝杆菌结核分枝杆菌含有含有NHEJ修复机制。原核修复机制。原核细胞在发生细胞在发生DSB时，时，Ku同同源二聚体与源二聚体与DSB末端结合，末端结合，并招募多功能酶并招募多功能酶LigD (ligase /polymerase/nuclease
21、)。LigD的聚合酶域与的聚合酶域与5-P专专一性结合，并与一性结合，并与Ku一道促一道促使末端联会。核酸酶和多聚使末端联会。核酸酶和多聚酶等共同加工修复酶等共同加工修复DSB，最，最后由连接酶缝合缺口。双链后由连接酶缝合缺口。双链断裂末端突出单链如有互补断裂末端突出单链如有互补序列，则采取序列，则采取MMEJ (microhomology-mediated end joining) 路线修复。路线修复。SOSSOS反应（反应（SOS responseSOS response）也称）也称应急反应，由克罗地亚人应急反应，由克罗地亚人 M M Radman Radman 在在19751975年发现
22、和命名年发现和命名，系系指染色体指染色体DNADNA受到严重损受到严重损伤时细胞做出的伤时细胞做出的应激反应应激反应。SOSSOS反应广泛存在于原核和反应广泛存在于原核和真真核生物核生物中，主要包括两个方面中，主要包括两个方面：DNADNA倾向差错倾向差错修复修复和和产生产生碱碱基突基突变变。大肠杆菌大肠杆菌SOSSOS反应起始于两个基因反应起始于两个基因：LexALexA和和RecARecA。a) a) 正常生长正常生长条件下，条件下，LexALexA蛋白二聚体与蛋白二聚体与5757个基因共有的调控序列个基因共有的调控序列SOSSOS盒盒框框(SOS box, 20bp(SOS box, 2
23、0bp）结合抑制）结合抑制基因表达。基因表达。b) b) 当染色体当染色体DNADNA受受到损伤，复制叉受阻，低表达到损伤，复制叉受阻，低表达的的RecARecA与单链与单链DNADNA结合后被激结合后被激活。激活的活。激活的RecARecA促使促使LexALexA二聚二聚体解体，被抑制基因表达。体解体，被抑制基因表达。SOS启动的损伤启动的损伤DNA倾向差错倾向差错复制复制的核的核心是，将心是，将易错复制酶易错复制酶PolV (Umu CD2) 组装到损伤组装到损伤DNA位置位置，并以损伤的，并以损伤的DNA单链为模板继续复制新链。单链为模板继续复制新链。DNA单链单链受受伤时复制叉受阻，单
24、链伤时复制叉受阻，单链区增加区增加，RecA蛋白以蛋白以ATP依赖的形式与暴露的单链依赖的形式与暴露的单链DNA结合形成蛋白结合形成蛋白-DNA纤丝并被激活。纤丝并被激活。被激活的被激活的RecA可与可与LexA互作，促使互作，促使LexA的自我切割并脱离结合的的自我切割并脱离结合的SOS盒框盒框导致导致SOS系统系统基因表达基因表达。这一反应初始。这一反应初始可可诱导核苷酸切除修复（诱导核苷酸切除修复（NER）。在）。在NER不足以应对不足以应对DNA损伤时，损伤时，LexA的的浓度进一步下降，浓度进一步下降，启动启动sulA, umuD, umuC等表达等表达，由此产生易错复制酶，由此产生易错复制酶PolV (Umu CD2), 并进行跨越损伤合成并进行跨越损伤合成(Translesion synthesis, TLS) (旁路修复旁路修复).J Nucleic Acids. 2010 Sep 30 pii: 947680