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1、精选优质文档-倾情为你奉上多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变,多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一,学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。多酚氧化酶的活性测定有多种方法,出于一般实验室的条件相对不是很先进,本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌,邻苯二醌能够被抗坏血酸还原,如抗坏血酸充足,少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。由于该酶最适pH为6,因此这一过程在pH6时最快。 把分析对象配成pH6左右的样液,在抗坏血酸和邻苯二酚存在时,于2
2、0下振荡2min,这时抗坏血酸被氧化。精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。用碘量法(以碘酸钾为基准试剂)进行滴定,测得剩余的抗坏血酸。由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量,并计算出酶活性,并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。所有上述过程的主要反应式如下: 酶邻苯二酚 邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸 邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果;马铃薯。研钵;烧杯;50毫升量瓶;250毫升三角瓶;秒表;滴定管;温度计。四、试剂10.2邻苯二酚溶液:用粗天平称0.2克邻苯二酚,溶解于蒸馏水,稀释
3、到100毫升,(准备用的前1-2天配制)。贮于棕色玻璃瓶中,放在冷凉处。20.01N碘酸钾溶液:用分析天平精确称取0.3566克KIO2(预先在102烘2小时,在干燥皿中冷却备用),用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中,加5毫升1N的NaOH溶液(此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应)和2克KI,溶解,用蒸馏水稀释到刻度,混匀,保存于棕色瓶中。3pH6.4的磷酸缓冲液,称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中,加10毫升1N的NaOH溶液,用无碳酸的水稀释至200毫升,保存于磨口玻璃瓶中。40.04N抗坏血酸溶液:用粗天平称取0.35克抗坏血酸溶解到蒸馏水中,用水稀释至100毫升,混
4、匀。溶液只能用一天。55%的偏磷酸溶液:50克偏磷酸(经验式HPO3)溶解到蒸馏水中,稀释至1升后混匀,保存于磨口玻璃瓶中。60.5%可溶性淀粉。五、操作程序称1克新鲜的植物材料,加蒸馏水于瓷研钵中研细,转移到50毫升容量瓶,混匀。充分振荡勿使沉淀下沉,吸10毫升这种悬浮液,倒入250毫升三角瓶中。加入1毫升pH6.4的磷酸缓冲液,再加入5毫升0.4N的抗坏血酸溶液,混匀。加入5毫升0.2%的邻苯二酚溶液,同时开始计时并充分振荡。为使空气中的氧气不断进入溶液一直要均匀地振荡2分钟。经精确作用2分钟后,加入5毫升5%的偏磷酸溶液以停止反应。(整个实验都应在20进行。即反各种试剂样液都予先放到20
5、环境中,做时也在20环境下做,加入偏磷酸量还可根据自己的模索而定)。加入1毫升0.5%的淀粉溶液,用0.01N碘酸钾溶液滴定坑坏血酸的剩余物,直至兰色不消失为止。同时进行对照滴定。为此吸取10毫升悬浮液注入另一只三角瓶中,加5毫升偏磷酸,再加入1毫升pH6.4磷酸缓冲液,5毫升0.4N抗坏血酸,再加淀粉液,也用0.01NKIO3溶液滴定。六、计算多酚氧化酶活性 式中:A多酚氧化酶活性(1克分析物质,20下,1min氧化抗坏血酸的微克分子数);50分析材料悬浮液的总体积;(ml);n分析材料的重量(g);10测定酶活性所取的悬浮液体积(ml);2反应时间(min);a用于滴定对照的0.01KIO3溶液体积(ml);b用于样品滴定的0.01NKIO3溶液体积(ml);50.01N抗坏血酸溶液每ml换算为微克分子数抗坏血酸的系数()。专心-专注-专业