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1、第十六章 药品质量控制中的现代分析方法与技术,主要的方法与技术:1、色谱分析2、光谱分析3、色谱光谱联用技术,第一节 毛细管气相色谱分析法,特 点,1、它具有管长而细的特点。普通的填充柱：长24m、内径46mm；毛细管柱：长560m甚至100m、内径0.20.53mm. 2、渗透性很高，固定相液量很少。 3、柱效高、吸附性小、柱流失少。 4、分离温度低、分析速度快。,一、色谱柱类型,1、普通开管柱, 壁涂开管柱 现代的壁涂开管柱通常是先将管壁经过表面处理后再涂固定液。,长560m、内径0.20.53mm. 按固定液涂布方式可分为三类。,色谱柱类型（续）,色谱柱类型（续）, 多孔层开管柱 先在管
2、壁涂一层多孔性物质（如氧化铝），再涂布固定液。, 担体涂渍开管柱 先将担体（如硅藻土）涂在管壁，再涂布固定液。,2、微内径开管柱,3、大内径开管柱,内径小于0.1mm，通常为0.05mm。,内径0.32 0.53 mm，通常为0.32mm。,二、进样方式, 分流进样 样品在汽化室分为两部分，大部分放空，小部分进入色谱柱进行分析。常用入口分流器。 适用范围: 高浓度样品分析，但不适于痕量分析和宽沸程样品分析。,由于系统和样品的差异，其进样方式多种多样，现重点介绍四种：,进样方式（续）, 不分流进样 样品注入并在汽化室汽化，但在开管柱入口端再度冷却，以液体捕集，并保持冷却；然后快速加热色谱柱进行“
3、再进样”。,适用范围: 痕量分析和宽沸程样品分析。,特点：溶剂在柱头富集，使在溶剂附近的组分色谱峰成 为尖峰，以利于分离。但操作难于控制。,进样方式（续）, 柱头进样 液态样品不经过汽化室汽化，直接注入冷态的色谱柱头进行分离与分析。,适用范围: 宽沸程的易于挥发的低浓度样品分析。,特点：1）可获得最佳的重复性和精密度。 2）技术要求严格，实际使用不太方便。 3）易于导致样品在柱中积累，使柱效降低或失效。 4）样品必须经过严格的预处理。,进样方式（续）, 直接进样 样品在进样器中快速蒸发进样，进样器单独加热不受柱温影响。,适用范围: 痕量分析和宽沸程样品分析，且比不分流进 样宽一个数量级以上的样
4、品。,特点：1）样品在“进样器”（加热器衬套或柱头）中蒸发。 2）对于低挥发性组分难于定量分析。,三、应用示例,1、人血浆中5-单硝酸异山梨酸（5-ISMN）的测定,样品处理：氯仿萃取法从血浆中分离药物。测定方法：内标法，内标物消心痛。进样方法：分流法，其分流比1：5。,应用示例（续）,人血浆中5-单硝酸异山梨酸（5-ISMN）的测定,样品处理：氯仿萃取法从血浆中分离药物。测定方法：内标法，内标物消心痛。进样方法：分流法，其分流比1：5。,应用示例（续）,第二节 手性药物的高效液相 色谱分析,手性药物在天然和半合成药物以及合成药物中所占的比例逐年上升，在20世纪初的1992种药物中，其分布为：
5、,一、手性分离、分析概况,手性分离、分析概况（续）,手性药物的分离、分析方法,二、手性药物拆分基本原理三点手性识别模型,手性识别部位：A-A，B-B，C-C,直接法 对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，从而形成非对映异构体化合物，然后以常规(偶尔也用手性)固定相分离、分析测定，这类方法称为直接法，或称为手性衍生试剂法(chiral derivatization reagent, i.e. CDR)。 间接法 在HPLC中，使用手性固定相（chiral stationary phase, i.e. CSP）或手性流动相（chiral mobile phase, i.e. CMP）分离对映体混合物
6、从而进行测定，即为间接法。,三、HPLC手性分离分析方法的分类,1、 CDR的适用性,四、柱前手性衍生化(CDR)法,当手性药物在手性固定相HPLC中呈现出较弱的色谱分离 特征时，可以通过CDR法选用适当的手性衍生化试剂使 其生成具有明显色谱分离性的非对映异构体。,通过在手性药物的结构中增加某些基团，从而达到增加色 谱系统对手性对映异构体药物的选择性。,为了提高紫外或荧光检测的灵敏度或选择性。,2、CDR的基本原理,CDR法(续),将对映异构体衍生化为非对映异构体，即：,其中，R、S分别表示顺、逆时针排列的旋光异构体；SE光活性试剂，SA手性溶质，即手性药物。,3、 衍生化试剂及反应条件,CD
7、R法(续),1）、手性试剂应为光学纯，且贮存时保持稳定。 2）、反应条件应尽可能温和、简单，以防止外消旋化。 3）、衍生化反应需定量完成，以保证结果的准确性。 4）、结构中应具有易于衍生化的基团。 5）、产物在色谱分离时，应显示高柱效和检测高灵敏度。,1、基本原理,五、手性流动相拆分（CMP）法,将手性试剂添加到流动相中，手性试剂与药物消旋体中各对映体结合，形成稳定常数不同的结合物。基于这些非对映体药物结合物在固定相中的分配差异，实现对映体药物的分离测定。,CMP法（续）,1）流动相中手性添加剂与对映体药物形成的结合物（络合物）的稳定性远低于手性衍生化所形成的衍生化合物，有时甚至为瞬时非对映体
8、络合物。 2）手性添加物本身可从色谱柱流出，不构成对柱子的损害。 3）对于同一对映体药物，往往存在很多种手性添加剂，可以相互更换。 4）固定相可以采用普通的非手性固定相。, 特 点,CMP法（续）,在CLEC中，手性配基与金属离子络合形成手性添加剂，该络合物添加剂以适当的浓度分布于流动相中，遇有药物消旋体时，手性药物与一部分手性配基交换，它们共同形成非对映体的络合物对，这样的络合物对在正相或反相色谱柱上表现出不同的色谱行为，从而使其分离测定。,2、配基交换型手性添加剂（chiral ligand-exchange complexes, i.e. CLEC）,CMP法（续）,例如：氨基酸的手性分
9、离,CMP法（续）,环糊精是中空型环状低聚糖，其空穴具有手性特征，它能与中性分子或离子形成包合物。当流动相中存在环糊精添加剂时，若对映体药物的分子性状、大小与环糊精手性空穴相符时，它们将形成色谱行为不同的非对映体药物包合物，从而分离手性药物对映体。,3、环糊精（CD）添加剂,环糊精类型 常用的有、 等3种，在药物对映体分离测定中，主要应用和 型。,CMP法（续）,在流动相中，通过静电以及其它弱相互作用，使对映体荷电药物能与手性离子对添加剂形成在固定相和流动相中具有不同分配性能的非对映体离子对络合物，从而分离测定手性离子化药物。,4、手性离子对添加剂,常用的手性离子对添加剂 主要为10樟脑磺酸、
10、生物碱奎宁和奎尼丁。,六、手性固定相拆分（CSP）,CSP分离方法是手性分离研究最早、应用最广泛的一类方法，现在已经形成了系列的产业化手性色谱柱。到目前为止，主要有四类：吸附型、模拟酶移植型、电荷转移型和配体交换型。,主要特点1）使用方便，立体选择性好。2）具有广泛的适用性，当然还没有像ODS柱那样的普适性。3）价格昂贵。,七、应用示例,示例，DL-吡喹胺光学异构体柱前衍生化分析,手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）,应用示例（续）,HLPC测定法： 外标法，分别用D-吡喹胺和L-吡喹胺 的纯样品为外标液。,HLPC条件 色谱柱：C18 流动相：甲醇磷酸二氢钾 检测波长：250nm
11、,第三节 高效毛细管电泳分析,高效毛细管电泳（high performance capillary electropho-resis, i.e. HPCE）是以高电场为驱动力，在细内径毛细管内荷电粒子按其淌度或（和）分配系数的不同而进行分离的一种电泳技术。,一、概 述,特 点 1、分离效能高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点，在药物分析中广泛应用。 2、HPCE仪器组成简单、操作方便。,概述（续）,仪器原理示意图 它主要由高压电源系统、毛细管分离系统、检测与数据处理系统等构成。,概述（续）,1、电 泳,二、HPCE基本理论,电泳分离是基于组分在电场作用下迁移速度不同而进行的。若为球形荷
12、电离子，电泳迁移率（淌度）为：,其中，e荷电粒子的Zeta电势；介质的介电常数；介质的粘度。由于不同的荷电粒子的Zeta电势不同，使其具有不同的电泳迁移率，从而构成了电泳分离的基础。,2、电 渗,基本理论(续),电渗是指管内溶液在外力电场作用下整体朝一个方向运动的现象。 对于石英毛细管，其管壁表面的硅醇基（-SiOH）电离为-SiO-而带负电，溶液中的水合阳离子被吸附到表面形成双电层。当在毛细管两端加上电压时，溶剂化阳离子向阴极移动，即毛细管中整体溶液向阴极移动，从而形成了电渗流现象。,基本理论(续),1）HPCE中的电渗流具有平面流型或“塞子流”型。, 电渗流的特点,基本理论(续),电渗驱动
13、力：不会使样品区带扩散，使流出组分的峰形尖而窄，提高了柱效，并缓解了拖尾现象。 外压驱动力：使流体为抛物线型，导致了样品区带扩散，柱效下降，分离性能降低，峰变宽，且易于拖尾。,2）电渗流可以使几乎所有的样品组分不管电荷的性质和大小，均以相同的方向移动。 若为石英管，即电渗流均使它们向阴极移动。,存在两种驱动力：,基本理论(续),样品中各组分在毛细管中的流出时间取决于电渗流速度和组分电泳速度的矢量和。 在一般情况下，电渗流方向从阳极到阴极且电渗速度一般大于电泳速度，所以阴离子也在阴极流出。 合理地利用电渗流可以使阳离子、中性分子和阴离子按先后顺序以不同的迁移时间在阴极流出，从而实现HPCE对样品
14、组分的分离分析。,3、HPCE分析的基本原理,1、毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，i.e. CZE）,三、HPCE的主要分离模式,在CZE中，毛细管仅填充缓冲液，基于样品组分的淌度不同而分离。除了溶质组分本身的结构特点和缓冲液组成，不存在其它影响组分淌度的因素。 CZE是毛细管电泳中最简单、最基本、应用最广泛的一种分离模式。,2、胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography, i.e. MECC),分离模式(续）,在电泳分离缓冲液中加入离子型表面活性剂胶束，由于胶束的增溶性，使
15、样品中的分离组分与胶束发生疏水性或（和）离子性相互作用而使组分产生了增溶效应。组分之间增溶性的差异导致了载有样品组分的胶束的电泳淌度的差异，从而实现中性分子的电泳分离。,分离模式(续）,MECC的特点,分离模式(续）,1）分离机理：基于被分离组分的疏水性差异性或疏水性与离子相互作用的共同作用的差异性而分离。 2）克服了毛细管区带电泳中对中性分子难于同时分离测定的困难。 3）若胶束采用手性体时， MECC可以比HPLC更方便、快捷地用于手性药物的分离测定。,3、毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, i.e. CGE）,分离模式(续）, 特 点1）分离机理：
16、样品组分的荷电数目和分子大小差异性。2）凝胶较强的粘度减少了溶质的扩散，使被分离组分的峰形尖锐，达到了毛细管电泳中最高的柱效。,在毛细管中装入凝胶作为支持物，当带电溶质通过凝胶聚合物网格时，便受到了阻碍。溶质分子越大，所受的阻力越大，电迁移就越慢。因此荷电的溶质按分子大小和荷电数目在CGE中形成分离的流出峰，从而进行分离测定。,3、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳和毛细管电色谱,分离模式(续）,毛细管等电聚焦：主要用于蛋白质的分离测定，它基于 不同蛋白质的等电点不同，从而形成各自的稳定 分离区带。,毛细管等速电泳：是一种“移动界面”电泳技术。在一次 实验中，只能分离正离子或负离子，不能同时分 离
17、正负离子。,毛细管电色谱：与HPLC具有相似的固定相，以电渗流为 流动相驱动力，柱效比HPLC高，但低于无固定 相的HPCE，而增加了选择性。,HPCE在药物分析中的应用主要包括四个方面:,三、HPCE在药物分析中的应用,药物生产过程分析: 生产过程的监测与控制,包括原料 药、中间体及其成品分析.,2. 中药成分分析：HPCE广泛用于生物碱、黄酮及其甙类 药效成分的分析。,应用(续),3.手性药物拆分: 基于手性主客体络合的HPCE手性拆分 是药物对映体拆分的一个很重要的方法，主要有 两类主体分子即环糊精及其衍生物和手性冠醚。,4.体内药物分析: 主要用于体液中药物及其代谢药物分析、 违禁药物
18、分析和临床治疗诊断分析等三个方向。,应用(续),示例: 复方甘草片中甘草酸、甘草次酸、吗啡和苯甲酸 钠分析 （内标法，内标物为氢氧噻嗪）,应用(续),示例: 血样尿样中巴比妥类药物分析,血样测定方法：内标法，内标物为巴比妥。,应用(续),尿样测定方法：外标法。,第四节 近红外光谱分析,Near-Infrared(NIR) Spectral Analysis,1、近红外光谱（near infra-red spectrum, i.e. NIRS）,一、概 述,光谱归属,概述(续）,近红外光可激发O-H、C-H和N-H等含氢化学键的倍频跃迁（在相隔一个或几个振动能级间的跃迁，主要是一级和二级倍频跃迁
19、）和合频跃迁（两种振动状态的能级同时跃迁）。,2、NIRS的特点,概述(续）,1）NIRS吸收弱、谱带宽、谱带重叠多、谱带复杂、吸收 谱带少，但谱带稳定性好。,2）样品不需预处理、分析过程简单： 样品不需要稀释 即可直接测定；微量杂质或吸收很弱的组分不至于干 扰测定，减少了干扰组分。,3）采样方式灵活： 常用透射、漫透射和漫反射等三种采 样技术。透射技术可以采用石英比色皿和光纤两种方 式，漫反射技术可以使用积分球和光纤两种方式。,概述(续）,4）NIR技术可以实现无损伤、在线、原位快速检测。,5）适合于大批量样品分析：表现出快速、低成本、方便 等特点。,6）建立定性定量分析模型较为复杂，通常为
20、多元（多波 长）分析模型，模型的建立依赖于化学计量学的多元 校正方法。但是，模型建立后，其使用极为方便。,利用已知定性定量信息的具有代表性的一批样品作为标准样本，构造校正样本集和检验样本集。在校正样本集中，通过适当的方法建立定性定量信息与近红外光谱之间的校正模型。利用检验样本集检验校正模型的预测能力，从而检验和优化校正模型。若预测能力在实验所要求的误差范围内，则该模型可用于未知样本通过NIRS的定性定量分析。,二、NIRS定性定量分析的基本思想,1、组 成主药：安替比林、利多卡因。溶剂：乙醇、甘油。 抗氧剂：硫代硫酸钠。,三、应用示例：Otipax滴耳剂的NIRS分析,2、方 法 利用5种组分的对照品按处方量的25配制成25种不同浓度的对照溶液，在11002500nm波长区间测定溶液的漫反射光谱Rk，并与浓度建立线性关系。 C%F0 + F1log(1/R1) + F2log(1/R2) + + Fn log(1/Rn),3、建立和检验校正模型建立模型所采用的多元校正方法：多元线性回归(Multiple Linear Regression, i.e. MLR),应用示例（续）,多元校正模型,应用示例（续）,4、分析未知样品基于校正模型，利用NIR分析未知样品。,应用示例（续）,