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1、病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第十六章第十六章 药品质量控制中的现代药品质量控制中的现代 分析方法与技术分析方法与技术 基本要求基本要求 毛细管气相色谱分析法毛细管气相色谱分析法 手性药物的液相色谱分析法手性药物的液相色谱分析法 核磁共振光谱分析法核磁共振光谱分析法 气相色谱气相色谱-质谱联用技术质谱联用技术返回主目录返回主目录病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程基本要求基本要求一一、熟熟悉悉毛毛细细管管气气相相色色谱谱法法、手手性性药药物物
2、的的高高效效液液相相色色谱谱法法的的基基本本内内容容及及其其在在药药物物分分析析中的应用。中的应用。二二、熟熟悉悉核核磁磁共共振振光光谱谱分分析析法法的的定定量量方方法法及其在药物分析中的应用。及其在药物分析中的应用。三三了了解解毛毛细细管管电电泳泳分分析析法法、红红外外光光谱谱法法、联用技术在药物分析中的应用。联用技术在药物分析中的应用。返 回病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 毛细管气相色谱法使用的色谱柱是空心的毛细管气相色谱法使用的色谱柱是空心的毛细管柱，叫开管柱：固定液涂渍或固定化在毛细管柱，叫开管柱：固定液涂
3、渍或固定化在柱管内壁上，而载气和其中的样品从中心的通柱管内壁上，而载气和其中的样品从中心的通道上通过。柱材料主要是熔融石英（道上通过。柱材料主要是熔融石英（FSOTFSOT）。）。一、高分辨气相色谱法一、高分辨气相色谱法病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（一）色谱柱（一）色谱柱1 1毛细管柱的类型：毛细管柱的类型：柱类型柱类型 柱内径柱内径 柱长柱长 液膜厚度液膜厚度普通开管柱普通开管柱 0.2 0.20.53mm 50.53mm 560m 0.160m 0.11.0m1.0m 壁涂开管柱壁涂开管柱 多孔层开管柱多孔层
4、开管柱 担体涂渍开管柱担体涂渍开管柱 微内径开管柱微内径开管柱 100m 100m大内径开管柱大内径开管柱 0.32mm 1m 0.32mm 1m或或5m5m病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2 2毛细管柱的选择毛细管柱的选择常用的常用的固定液固定液有：有：SE-31SE-31、OV-1OV-1、SE-54SE-54、SE-52SE-52、OV-1701OV-1701、Carbowax 20MCarbowax 20M。柱的选择柱的选择：根据样品组分的沸点，一般地，相差：根据样品组分的沸点，一般地，相差22或或22以上的
5、组分，采用非极性毛细管柱分离；以上的组分，采用非极性毛细管柱分离；若沸点相差在若沸点相差在22以内的组分，则需在极性较大以内的组分，则需在极性较大的毛细管柱上分离。的毛细管柱上分离。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3 3毛细管柱的性能评价毛细管柱的性能评价评价指标评价指标：分离效率、表面惰性、热稳定性。：分离效率、表面惰性、热稳定性。评价方法评价方法：在一定的色谱条件下，分离各种测试物质，：在一定的色谱条件下，分离各种测试物质，获得的特征性数据和峰对称性，以此来评价柱效和表获得的特征性数据和峰对称性，以此来评价柱效和
6、表面活性。在测定了柱效和表面活性之后，用流失速率面活性。在测定了柱效和表面活性之后，用流失速率试验来评价热稳定性。试验来评价热稳定性。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（二）进样方式（二）进样方式 分流进样分流进样：使用方便，对分流比、进样温：使用方便，对分流比、进样温度度 样品和载气的情况、进样体积和样品和载气的情况、进样体积和 浓度、进样重复性需要注意。浓度、进样重复性需要注意。不适于不适于痕量分析和宽沸程样。痕量分析和宽沸程样。适合适合大多数类型的样品，样品浓大多数类型的样品，样品浓 浓高、各组分的浓度相近浓高、
7、各组分的浓度相近病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程不分流进样不分流进样：须利用溶剂效应或冷阱，操作较难：须利用溶剂效应或冷阱，操作较难 特别适用于痕量分析和宽沸程样品特别适用于痕量分析和宽沸程样品柱头进样柱头进样：必须使用外径为：必须使用外径为0.17 0.17 0.23mm 0.23mm的的 细针，柱内径必须大于细针，柱内径必须大于0.32 mm,0.32 mm,不能通过隔垫进样，缓慢进样不能通过隔垫进样，缓慢进样 对热不稳定、稀的和宽沸程样品较对热不稳定、稀的和宽沸程样品较 理想；能给出定量结果理想；能给出定量结果
8、 非挥发物在柱的中积累导致柱变性非挥发物在柱的中积累导致柱变性 和柱效损失和柱效损失 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 直接进样直接进样：样品无须事先浓缩，进样器温度可较：样品无须事先浓缩，进样器温度可较 低，载气消耗量小，分析所需样量小低，载气消耗量小，分析所需样量小 适用于浓度范围要比不分流进样宽一个适用于浓度范围要比不分流进样宽一个 数量级以上的样品，有利于对热不稳定数量级以上的样品，有利于对热不稳定 的样品；当样品中含有挥发性低的组分的样品；当样品中含有挥发性低的组分 时，难于定量分析时，难于定量分析病原体侵
9、入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 （三）应用示例（三）应用示例-人尿中劳拉西泮的检测人尿中劳拉西泮的检测1.1.测定意义：劳拉西泮测定意义：劳拉西泮(简称简称LRZ)LRZ)上用为催眠、镇静上用为催眠、镇静和抗癫痫药物和抗癫痫药物,常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。为了确证这类案件的性质抢劫等麻醉后犯罪。为了确证这类案件的性质,经常经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。人体摄入该药后其血液中药物浓度较低进行检测
10、。人体摄入该药后其血液中药物浓度较低,且犯罪分子所用药量一般不使受害人死亡且犯罪分子所用药量一般不使受害人死亡,而且此类而且此类案件一般报案较迟，因此血中药物浓度较低案件一般报案较迟，因此血中药物浓度较低,对其检对其检测较为困难。该药主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液测较为困难。该药主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。排泄。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 2.2.色色谱谱条条件件：HP-5HP-5毛毛细细管管柱柱(30(300.32mm 0.32mm,膜膜厚厚0.10.1)。氮氮磷磷检检测测器器,不不分分流流进进样样(
11、阀阀关关闭闭时时间间0.75min),0.75min),进进样样口口温温度度:280,:280,柱柱温温:200(1min)20/min280:200(1min)20/min280(15min),(15min),载载气气为为高高纯纯氮氮(2.2(2.2ml/min),ml/min),尾吹气为高纯氮尾吹气为高纯氮(10ml/min)(10ml/min)。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3.3.样品预处理样品预处理-酶解及萃取酶解及萃取 取检尿取检尿1ml,1ml,加加10mg/L10mg/L的羟乙基氟西泮的羟乙基氟西泮
12、(HEF)(HEF)标准工标准工作液作液10l,10l,再加再加pH4.8pH4.8的乙酸盐缓冲液的乙酸盐缓冲液 50l 50l及及-葡萄葡萄糖醛酸苷酶溶液糖醛酸苷酶溶液0.1l,0.1l,置于置于5555水浴中水解水浴中水解4 4冷至室冷至室温后加温后加 pH10.8 pH10.8的碳酸盐缓冲液的碳酸盐缓冲液0.5ml0.5ml及乙醚及乙醚5ml,5ml,涡旋涡旋2min,2min,离心离心,分取上层有机相分取上层有机相4ml4ml置于经硅烷化处理的带置于经硅烷化处理的带尾管的鸡心瓶中尾管的鸡心瓶中,加甲醇加甲醇0.4ml,0.4ml,于于4040水浴中挥发至约水浴中挥发至约0.1ml,0.
13、1ml,进样进样1l1l进行进行GCGC分析分析病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 4.4.方法学评价方法学评价（1)1)选择性选择性:空白尿空白尿1ml1ml及空白尿及空白尿1ml1ml加加LRZLRZ和和HEFHEF标标准液准液,经酶解、萃取后进样分析所得色谱图表明尿经酶解、萃取后进样分析所得色谱图表明尿中杂质不干扰检测中杂质不干扰检测.（2)2)线性试验线性试验:用空白尿配制不同浓度的用空白尿配制不同浓度的LRZLRZ标准标准液进行酶解、萃取、进样分析液进行酶解、萃取、进样分析,将将LRZLRZ与与HEFHEF色
14、谱峰色谱峰面积的比值与面积的比值与LRZLRZ在尿液中的质量浓度进行线性回在尿液中的质量浓度进行线性回归归,得到工作曲线方程得到工作曲线方程:Y=3.110:Y=3.110-3-3X 3.010 X 3.010-3 3,=0.998=0.998。LRZLRZ在尿中的浓度为在尿中的浓度为5050500g/L500g/L范围内呈良好的线性范围内呈良好的线性.病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（3)3)萃取液的选择及萃取率萃取液的选择及萃取率:作者进行了多种溶剂萃取作者进行了多种溶剂萃取 LRZ LRZ的研究的研究,由经萃取
15、与未经萃取所得色谱峰面积由经萃取与未经萃取所得色谱峰面积 比计算比计算LRZLRZ的萃取率的萃取率,得得(meanSD)(meanSD)为为(83.43.1)%(83.43.1)%。（4 4）检出限）检出限:以以3 3倍信噪比计算检出限倍信噪比计算检出限,得本法的检出得本法的检出 限为限为5g/L5g/L。（5)5)回收率回收率:由工作曲线计算由工作曲线计算LRZLRZ的质量浓度及其回收的质量浓度及其回收 率率,得得(meanSD)(meanSD)为为(103.35.1)%(103.35.1)%。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的
16、病理生理过程5.5.尿液检测尿液检测:志愿者口服志愿者口服LRZ 2LRZ 2后后,于于3232小时小时内收集其排泄的尿液进行检测内收集其排泄的尿液进行检测,LRZLRZ于于9h9h达尿达尿中最高浓度为中最高浓度为444444/L,/L,检测结果表明检测结果表明,本方本方法适合于麻醉后犯罪案件中的检测要求。法适合于麻醉后犯罪案件中的检测要求。返 回病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、手性药物的高效液相色谱法二、手性药物的高效液相色谱法（一）手性药物拆分机理（一）手性药物拆分机理 为了使对映体转化为化学和物理性质不同的
17、非对映为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是行的是“三点手性识别模式三点手性识别模式”。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理
18、生理过程（二）手性（二）手性HPLCHPLC拆分法的类型拆分法的类型直接法直接法：柱前手性衍生化法：柱前手性衍生化法间接法间接法：手性流动相拆分法、手性固定相拆分法：手性流动相拆分法、手性固定相拆分法1 1柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。定相分离。对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘
19、衍生物类、光学活性氨基酸类、酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。固相衍生化试剂。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2 2手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。样品形成手性络合物。常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂类添加剂、手性离子对络合剂病原体侵入机体
20、，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3 3手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相添加剂）固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今添加剂）固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。的分子结构来选择合适的手性柱。常用的手性固定相常用的手性固定相：PirklePirkle型手性固定相、蛋白质类型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。手性固定相、环糊精类手性固定相。
21、病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（三）应用（三）应用1 1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2 2生物体液中药物对映体的分离分析研究可探生物体液中药物对映体的分离分析研究可探 索血药浓度与临床疗效的关系；索血药浓度与临床疗效的关系；3 3在研制手性药物过程中，可分别评价单个对在研制手性药物过程中，可分别评价单个对 映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4 4必要时，可进行手性药物对映体的制备分离必要时，可进行手性药物对映体的制备分离 （或
22、拆分）。（或拆分）。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）化法）手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯色谱条件：色谱柱色谱条件：色谱柱 NOVA-Pack C NOVA-Pack C1818（150mm3.9mm150mm3.9mm）流动相流动相 甲醇甲醇-0.01mol/L-0.01mol/L磷酸二氢钾磷酸二氢钾 （pH2.8pH2.8）（）（51495149）该法所用的手性衍生化试剂可以
23、与一级胺、二级该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。物可以在普通色谱系统中进行分离分析。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程示例二、示例二、DL-DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）色谱条件：色谱条件：色谱柱色谱柱 Zorbax ODS Zorbax ODS（250mm4.6mm250mm4.6mm），），流动相流动相 含有含有0.15%L-0.15%L-苯
24、丙氨酸及苯丙氨酸及0.11%0.11%硫酸铜硫酸铜（CuSOCuSO4 45H5H2 2O O）水溶液（以）水溶液（以0.05mol/L0.05mol/L硫酸调硫酸调pHpH至至3.03.0）-甲醇（甲醇（9191）（流动相中）（流动相中L-L-苯丙氨酸及硫酸铜浓苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为度分别为0.008mol/L0.008mol/L和和0.004mol/L0.004mol/L）。）。流动相中流动相中L-L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，酸铜为二价金属螯离子，L-L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到
25、色氨酸对映体，共同形成配位络合布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。物对，然后在反相柱上拆分。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）色谱条件：色谱条件：色谱柱色谱柱 Chirex 3005 Chirex 3005手性色谱柱手性色谱柱 （R R）-1-1-萘基甘氨酸和萘基甘氨酸和3 3，5-5-二硝基二硝基 苯甲酸以共价键结合苯甲酸以共价键结合 流动相流动相 正己烷正己烷-二氯乙烷二氯乙烷-甲醇
26、甲醇该法的拆分机理为该法的拆分机理为“三点手性识别模式三点手性识别模式”。返 回病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、核磁共振光谱分析法三、核磁共振光谱分析法 核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新的内容，日益受到重视。的内容，日益受到重视。1 1定量参数：峰面积或峰高。定量参数：峰面积或峰高。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程
27、2 2定量的特点定量的特点：1 1）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。2 2）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物时，物需该化合物的纯品作为对照标准。时，物需该化合物的纯品作为对照标准。3 3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。4 4）方
28、法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，）方法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体。的立体异构体。病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3 3测定方法测定方法：选择一个合适的峰作为测量峰。：选择一个合适的峰作为测量峰。（1 1）内标法（绝对测量法）内标法（绝对测量法）内标法为内标法为NMRNMR定量分析最常定量分析最常用的方法，它与用的方法，它与GCGC的内标法相似，在样品溶液中，直接的内标法相似，在样品溶
29、液中，直接加入一定量内标物质后，加入一定量内标物质后，NMRNMR光谱测定，将样品指定基团光谱测定，将样品指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量（经精密称重时，则样品的绝对重量（WuWu）可由下式求得：）可由下式求得：百分含量百分含量病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（2 2）相对测量法相对测量法 当不能获得样品的纯品或合适的内标当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积（A A1 1/n/n1 1）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（A A2 2 /n/n2 2）进行比较，按下式计算：）进行比较，按下式计算：样品相对百分含量样品相对百分含量返 回