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1、精选优质文档-倾情为你奉上1.基因工程（DNA重组技术/基因拼接技术）基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。2.DNA重组技术的基本工具、 “分子手术刀” 限制性核酸内切酶（限制酶）A、作用限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并在使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开B、限制性内切酶的切割方式：在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 沿着中心轴线切
2、开DNA，切口是平末端。大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，SmaI识别CCCGGG序列:他们识别的核苷酸序列不同,但是切点都是在GC之间。C、比较有关的DNA酶（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。 （4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的
3、缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。.DNA连接酶“分子缝合针”（1）DNA连接酶的分类：E.coliDNA（大肠杆菌）连接酶和T4DNA（T4噬菌体）连接酶。（2）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键（平末端较弱）。.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”（1）分子运载车的分类：质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。（2）运载体使用的目的：是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。是利用
4、它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。（3）作为运载体必须具备的条件：在宿主细胞中保存下来并大量复制 有多个限制性内切酶切点 有一定的标志基因，便于筛选3.基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、基因的结构：基因是有遗传效应的DNA片段(注：RNA病毒为RNA)，分为编码区和非编码区。编码区：能转录出mRNA，原核生物中也就是能编码蛋白质的区段非编码区：不能转录出mRNA，也不能编码蛋白质的区段（）原核细胞基因的结构非编码区中存在调控遗传信息表达的核苷酸序列:编码区上游的RNA聚合酶结合位点，即启动子，可控制RNA聚合酶的结合。RNA
5、聚合酶是一种蛋白质，能识别并结合调控序列中的结合位点，能催化DNA转录为RNA编码区下游有终止子，可控制RNA聚合酶的停止、脱落。（2）真核细胞基因的结构二 基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取：A目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。B获得目的基因的方法（1）从基因文库中获取目的基因：基本概念的理解：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围
6、大小的DNA片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因。这种基因文库叫基因组文库。有些基因文库比较小，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如cDNA文库（用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物cDNA文库。）怎样提取：根据目的基因有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体的位置，基因的转录产物mRNA以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。利用PCR
7、技术扩增目的基因：原理：DNA双链复制的基本原理前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。条件：a.四种脱氧核苷酸b.DNA的两条链为模板c.热稳定DNA聚合酶(Taq酶）d.一对引物（一小段单链DNA或RNA，一般2030个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对）e.温度控制和缓冲液PCR技术扩增过程:a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNAb、复性（55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的DNA链人工合成:反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模
8、板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因转录成的mRNA 单链DNA双链DNA（目的基因）根据已知的氨基酸序列合成DNA法:蛋白质中氨基酸的序列mRNA中的碱基序列DNA碱基序列目的基因目的基因2.基因表达载体的构建:基因工程的核心目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。：基因表达载体的构成：目的基因 启动子：位于基因首端，RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录基因 终止子：位于基因尾端，使转录在所需要的地方停下来标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用D
9、NA连接酶把两者连接。目的基因与运载体结合（以质粒为运载体）条件：同种限制酶、DNA连接酶、目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞：（1）将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（2）常用的受体细胞：动植物细胞（受精卵）、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等（3）方法：4.目的基因的检测与鉴定：基因工程的应用：1. 动物基因工程：动物感受器（乳腺反应器、膀胱反应器）2. 植物基因工程：抗虫棉（Bt毒蛋白基因苏云金芽孢杆菌）3. 基因诊断4. 基因治疗蛋白质工程：（生产自然界中没有的蛋白质）预期蛋白质功能设计蛋白质分子结构推测氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列合成DNA表达相应蛋白质专心-专注-专业