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1、理学其它相关论文 -牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白 fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（一） 论文关键词：牙龈卟啉单胞菌 菌毛 大肠杆菌表达系统 融合蛋白 固定化金属螯合亲和层析 论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌（ Porphyromonas gingivalis, Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（ fimbriae）是 Pg 的重要致病因子，可介导 Pg 附着于口腔内各种组织细胞的表面，以有利于Pg 在体内进一步的粘附
2、和侵袭；可引发炎症反应和免疫反应。并且菌毛具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性 牙周炎的治疗效果还不理想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。 研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达 FimA 蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗 FimA 蛋白的多克隆抗体提供实验基础。 研究方法： 1. 以大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 为宿主菌，用 IPTG 诱导 fimA表达，通过 SDS-PAGE 和 Western blot 来验证蛋白的表达结果，并进行蛋白表达形式分析。 2. 大量诱导表达融合蛋白，用 Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS-PAGE 和 W
3、estern blot 来验证纯化产物，纯化 产物经透析复性后用 BCA 法蛋白定量试剂盒作蛋白含量测定。 研究结果： 1. 经 IPTG 诱导表达后，工程菌在 SDS-PAGE 上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约 41kDa）， IPTG 浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当 IPTG 浓度为 2 mmol/L，诱导时间为 3 h 时蛋白表达量最大；当 IPTG 浓度为 1 mmol/L，诱导时间为 1 h 时蛋白表达量最小。 6His-FimA 表达产物经 SDS-PAGE 后，转移至硝酸纤维素膜， X 线片感光，在 X 线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，
4、而空质粒 pET-15b 对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。 2. 表达产物经 Co2+柱亲和层析， SDS-PAGE 上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。 6His-FimA 纯化产物经 SDS-PAGE 后，转移至硝酸纤维素膜， X 线片感光，在 X 线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS 全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经 BCA 法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的 FimA 蛋白浓度为 0.96 mg/ml。 主要结论：用本课题组前期构建的 f
5、imA基因的原核表达质粒 pET-15b-fimA，在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中诱导表达后， fimA 基因能够得到正确表达。表达产物经 Co2+柱亲和层析，可以得到带 6His 标签的 FimA 融合蛋白。 1 绪论 慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的 发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提高国民健康
6、水平具有重要意义。 疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到 DNA 疫苗，由于技术不断改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。 慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis, Pg)是其 主要可疑致病菌 1。菌毛是 Pg 表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白 (fimbrillin， FimA)是其主要亚单位，能够介导 Pg 对宿主组织的粘附与入侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚 1-3，还能刺激炎性因
7、子的产生 4。多菌毛 Pg 野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验发现，用 FimA 免疫大鼠可减轻由 Pg 引起的牙槽骨破坏 5，将抗 FimA 的单克隆抗体用于口腔被动免疫，可以抑制该菌在口腔的定植 6。因此，可以将 FimA 作为防治牙周炎疫苗抗原。 Pg 菌毛的单体 是 FimA，由单拷贝 fimA 基因编码。 fimA 基因全长 1290 bp，开放读框包括 1044 bp，编码 347 个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域（如刺激 T 细胞和 B 细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等）位于氨基酸序列的31 331aa 不等，各个位点之
8、间可相互交叉或覆盖。近年来由于分子生物学和免疫学的发展， fimA 基因已被克隆和测序，对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。 根据国内外研究进展，在前期已构建 fimA 原核表达质粒的基础上，本研究拟在大肠杆菌 BL21（ DE3） pLysS 中表达 FimA 融合蛋白，并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化，为后续实验制备抗 FimA 蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的 DNA 疫苗提供实验基础。 2 文献回顾 牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，在我国有很高的发病率 7。牙周炎累及牙齿数目多，预后差，是造成牙齿缺失的主要原因。
9、随着我国进入老龄化社会，牙周炎的预防将成为突出的保健问题。世界卫生组织已将牙周组织健康列为健康人的十项标准之一 7。探索预防和治疗这种严重危害人类口腔健康的疾病的方法，对于改善我国人民 的口腔健康水平，提高人们的生活质量有着重要意义。 大量的实验研究、流行病学资料和临床观察表明 7，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子，是造成牙周组织破坏的必须因素。牙周菌斑中绝大多数细菌为口腔固有菌丛，对宿主无不良影响，仅少数细菌与牙周炎的发生、发展密切相关。其中牙龈卟啉单胞菌（ Porphyromonas gingivalis, Pg）是目前获得公认的一种牙周致病菌，它是牙周
10、病，尤其是成人慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势病原菌，而健康龈沟内很少 7, 8。目前 牙龈卟啉单胞菌也是牙周微生物学领域重点研究的厌氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系统性疾病的研究中，血清学、动物模型、细胞培养的研究证实 9-11 Pg 感染与心脑血管疾病的发生有关，而且有学者报道 12Pg 的感染与低体重婴儿的分娩也有关。 Pg 含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占据重要地位，而且与 Pg 在口腔的定植有关，为 Pg 的优势抗原之一。另外，因其具有广泛的生物学活性而成为牙龈卟啉单胞菌研究的一个热点。 菌毛（ pili， fimbriae）是位于
11、革兰氏阴性菌 Pg 菌体表面的一种弯曲的、单股的丝状物，长 0.3 1.0 m，直径为 3.5 5.0 nm，遍布细菌表面，多者每菌可有数百根，由菌体表面伸向细胞外。其化学组分是一种蛋白质，与细菌的运动无关。 2.1 菌毛的致病机制 2.1.1 介导 Pg 附着于口腔 Pg 附着于宿主组织表面是其定植于口腔的关键，也是其致病的先决条件。Pg 可选择性的直接附着于口腔内特定部位组织的表面，或识别已经附着在组织表面的细菌，然后间接的附着于组织表面。 1）菌毛可介导 Pg 附着于口腔内各种组织细胞的表面 菌毛可介导 Pg 黏附于 龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；唾液中的重要蛋白质成分（如
12、富脯蛋白 PRP、富脯糖蛋白 PRG、富酪蛋白 PRT）；乳铁转运蛋白，细胞外基质蛋白（ ECM）（如玻连蛋白和纤维连接蛋白）。人细胞外基质蛋白通过与 FimA 受体配体的结合在细胞外信号转导中起重要作用。菌毛对基质蛋白有很强的亲和力，而且明显抑制玻连蛋白 /纤维连接蛋白与其受体 3 和配体 5（在中国仓鼠卵巢 CHO 细胞株中过度表达）的相互结合。在牙周组织中，菌毛可能通过细胞外基质蛋白受体 /配体途径阻断细胞外信号转导。 菌毛还可介导 Pg 黏附于牙龈 上皮细胞、牙周袋上皮细胞、人口腔上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，附着并凝集人或羊的红细胞等。Umemoto13构建了无菌
13、毛的 Pg 突变株，发现其对人口腔上皮癌细胞的黏附性和侵袭性均降低，接种小鼠后引起牙槽骨丧失的量也减少。其他学者构建了不表达菌毛的 Pg 缺陷株，发现它们黏附和侵袭人牙龈成纤维细胞 14、上皮细胞 15、内皮细胞 16和树突状细胞 17的能力也降低，甚至不能黏附。这些研究结果说明菌毛在 Pg 黏附于口腔上皮细胞的过程中起重要作用。 此外，研究发现 Pg可黏附于唾液覆盖的 羟基磷灰石（ hydroxyapatite coated with saliva， sHAP），这种黏附活动常被作为研究 Pg 与口腔内唾液覆盖的各种组织细胞黏附活动的模型。 Lee18等的研究发现， Pg 与羟基磷灰石之间的
14、这种黏附活动需要菌毛参与，而且抗菌毛的抗体能完全抑制这种黏附作用。学者们 14, 16通过同源重组技术灭活 fimA 基因后，发现突变株与 sHAP 的黏附能力降低。这些研究结果提示 FimA菌毛蛋白在 Pg黏附到唾液覆盖的口腔内各种组织表面的过程中起重要作用。 2）在菌斑形成的早期，菌毛可介导 Pg 黏 附于附着在获得性膜表面的细菌，间接的附着于组织表面 细菌之间的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。链球菌是最先定植于牙齿表面的主要细菌， Pg 通过菌毛与链球菌细胞表面的甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（ GAPDH）高亲合力、高特异性的结合而与链球菌发生共聚，这种相互作用在 Pg定植于牙周袋的过
15、程中可能起重要作用。此外菌毛还参与 Pg 与放线菌、福赛氏类杆菌之间的黏附过程。 3）有关黏附机制的研究 现在已经明确 Pg 黏附于口腔的过程为一种特异性识别过程，菌毛可能为特异性配体，与宿主细胞膜上的特异性受体相互作用 7。部分 Pg 菌毛可识别的黏附受体现已明确，如 integrins7,19、上皮细胞的细胞角蛋白 1420、巨噬细胞（ MCs）上的 TLR2 和 CD147。菌毛通过上皮细胞的 integrins 促进 Pg与牙龈上皮细胞的黏附，抗 integrins 的抗体能抑制 Pg 的黏附和侵袭 19。Pg 菌毛通过单核细胞上的 TLR2、 CD14 和 CD11a/CD18，诱导
16、外周血单核细胞 IL-6 mRNA 的产生、细胞因子的分泌、 p38 促有丝分裂蛋白激酶磷酸化和 NF- B 的活化。小鼠腹膜巨噬细胞的实验研究表明， 2 integrins（ CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬细胞与 Pg 菌毛黏附的细胞受体；而且链（ CD18）在信号转导中起关键作用。 综上所述，菌毛可介导 Pg 黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白 PRP、富脯糖蛋白 PRG）；乳铁转运蛋白、细胞外基质蛋白；宿主细胞（如牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞，巨噬细胞等）；口腔内的细菌（如链球菌、放线菌、福赛氏类杆菌）。借助于菌毛黏
17、附于这些物质， Pg 可在口腔内进一步定植、侵袭、诱导炎症反应的发生。 2.1.2 引发炎 症反应和免疫反应 Pg 附着于口腔内组织细胞后，其抗原成分和毒性产物等可引发白细胞的趋化、吞噬等炎症过程，造成表面组织的损伤 其中 Pg 菌毛能与脂多糖一起激活宿主的防御机制、诱导多种炎性细胞因子的产生；此外细菌及其产物还通过上皮细胞或者细胞间质进入表层下组织，在组织内繁殖，甚至扩散至全身。 1） Pg 菌毛的白细胞趋化作用 牙周炎再现了一种重要的中性粒细胞介导的破坏宿主组织细胞的模型。牙周炎的优势病原菌 Pg 产生的毒力因子主要就是用于调节中性粒细胞的反应。其中Pg 菌毛能诱导多种可趋化白细胞至炎症部
18、位的细胞因子的分泌。 Pg 菌毛可诱导内皮细胞表达趋化因子 IL-8（ Interleukin-8）和单核细胞趋化蛋白 -1（ monocyte chemoattractant protein 1， MCP-1）：感染了野生型 Pg的人脐静脉血管内皮细胞持续低剂量的表达 IL-8 和 MCP-1，而 Pg 的 fimA 基因突变株则不能诱导 IL-8 和 MCP-1 产生。同时，抗菌毛的特异性抗体也能阻断上述因子的产生。这些提示 IL-8 和 MCP-1 的产生是由菌毛特异性引起的。 IL-8 和 MCP-1 都是诱导白细胞到免疫反应部位的有效的趋化因子。 MCP-1又称单核细胞趋化激活因子（
19、 monocyte chemoattractant activating factor, MCAF），它作为趋化因子超家族的一个主要成员，可以由机体多种细胞合成和分泌（如人牙龈上皮细胞），是重要的炎性细胞因子，在机体对入侵的病原微生物的炎症反应和免疫反应中，起重要调节作用。 MCP-1 的主要生 理作用是特异性的趋化中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚集 , 同时还有激活巨噬细胞的功能。而且炎症部位的细胞因子如 IL-1、 TNF-等可以刺激机体的免疫细胞及其他细胞表达 MCP-1，该过程中所产生的 MCP-1 能进一步特异性的趋化巨噬细胞和单核细胞向病损部位聚集。中性粒细胞和巨噬细胞向炎症部位聚
20、集，是炎症反应中的一个重要过程。巨噬细胞是参与牙槽骨代谢的重要的免疫细胞，被激活的巨噬细胞能产生大量的骨吸收性细胞因子。也有学者认为巨噬细胞是破骨细胞的前体细胞，在破骨细胞分化因子的存在下，体外培养的巨噬细胞可以向破骨细 胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一个重要病理特点，是病变进程、发展和愈后的一个重要指标。这些提示 Pg 菌毛能通过免疫细胞及其他细胞产生的 MCP-1 间接的趋化巨噬细胞向炎症部位聚集，增加破骨细胞的数量，促进破骨细胞的分化和成熟，进而促进牙槽骨的吸收。 Pg菌毛可诱导内皮细胞表达粘附分子 ICAM-1、 VCAM-1和选择素（ selectin）：Pg 菌毛诱导人脐静脉内皮
21、细胞表达细胞内黏附分子 -1（ intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1）、血管细胞黏附分子 -1（ vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1）以及 P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上调上述分子的表达，而 Pg 的 fimA 基因突变株或含有抗 Pg 菌毛蛋白抗体的血清与人脐静脉内皮细胞共培养时，不能诱导上述分子的表达。 内皮细胞通过上述分子 selectin， ICAM-1 和 VCAM-1 可诱导和趋化血液循环中的白细胞黏附至内皮细胞。其中选择素是
22、血管粘附分子大家族中的一大类成员，根据表达部位可分为三类 21：表达于活化的内皮细胞表 面的 E-selectin；表达于白细胞表面的 L-selectin；表达于活化的血小板和内皮细胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反应发生过程中， selectin 通过与其相应配体结合介导白细胞（中性粒细胞、 T-和 B-淋巴细胞以及单核细胞等）与血管壁（特别是毛细血管后静脉）接触，并使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中。 ICAM-1 也可促进白细胞黏附、移动和趋化至炎症部位。血液循环中的单核细胞和白细胞黏附和趋化至内皮细胞，然后穿过内皮细胞在局
23、部聚集是炎症反应 的重要过程。 Pg 菌毛通过诱导内皮细胞所表达的 selectin、 VCAM-1 和 ICAM-1，趋化单核细胞和白细胞至炎症反应的局部，可能在牙周病中起重要作用。 2） Pg 菌毛诱导多种炎性细胞因子的产生 （ 1） Pg 菌毛诱导外周血单核细胞产生炎性细胞因子 IL-1、 IL-6、 TNF-和化学趋化因子 IL-8，诱导 p38 促有丝分裂蛋白激酶磷酸化，刺激单核细胞诱导的细胞核因子 - B（ nuclear factor kappa B， NF- B） p50 和 p65 亚单位的活化（通过 TLR 信号转导途径），从而诱导高滴度的 NF- B 依赖性细胞因子的释放
24、。 NF- B 是细胞中一个重要的转录调节因子，是 Rel 家族的成员，几乎存在于所有细胞中，在免疫反应、应激反应、细胞凋亡及病毒复制的调节中起主导作用，可在炎症部位高度表达，提示其在免疫反应和炎症反应中起着关键作用。受 NF- B 调节的炎性细胞因子有：肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor， TNF-和 TNF-）；粘附分子（ ICAM-1， VCAM， E-selectin）；白介素（ IL-1， IL-2，IL-6， IL-8， IL-12）；集落刺激因子（ CSF）（粒细胞 -CSF，粒细胞和单细胞 -CSF）； -干扰素（ INF-）等。因此， NF- B 是多
25、种促炎症基因高度转录的必须因子。同时，由 NF- B 调节的产物，如 TNF-和 IL-1又能激活 NF- B，这就意味着存在一个能放大且延续炎症反应的复杂的调节环路。 （ 2） Pg 菌毛还能通过 TLR2 信号途径诱导小鼠腹膜巨噬细胞产生 RANTES、INF-、 IL-17、 VCAM-1、血管内皮细胞生长因子，诱导 MCP-1 mRNA 的强表达。CD18 可能在相关的信号转导机制中起重要作用。 Pg 菌毛可诱导巨噬细胞样细胞株 U937 表达 IL-1 ， IL-8， IL-12 和 TNF-。 fimA 基因正常表达的 Pg 菌株能诱导单核细胞来源的树突状细胞表达炎性细胞因子 TN
26、F-、 IL-6，免疫调节细胞因子 IL-10 和趋化因子 IL-8，而 fimA 基因的突变菌株 Pg DPG3 就不能诱导上述细胞因子的表达。而且用菌毛蛋白刺激单核细胞来源的树突状细胞，能在自体混合淋巴细胞反应（ MLR）和自体的 CD4+ T 细胞中诱导以 IFN-为主要细胞因子的 Th1-型免疫反应。 关于菌毛诱导各种炎性细胞因子的产生的机制， Hajishengallis22的研究表明：体内免疫系统 的 Toll-like receptors（ TLRs）和其他模式识别受体（ pattern-recognition receptors， PRRs）组成了一种功能性受体复合物，识别并对
27、病原菌相关模式分子（ pathogen associated molecular patterns， PAMPs）起反应。在这种相互作用中，菌毛作为一种病原菌相关模式分子与宿主细胞的模式识别受体复合物相结合。 CD14 和 CD11b/CD18 是一种募集性受体， TLRs 则是一种信号转导受体。 TLR2 和 TLR4 与介导菌毛活化细胞有关，其他的模式 识别受体如 CD14 和 CD11b/CD18 与介导细胞对菌毛的识别有关。菌毛通过激活 TLR 信号转导途径，诱导单核细胞产生炎性细胞因子 IL-1、 IL-6、 TNF-和化学趋化因子 IL-8，并诱导抗原呈递细胞中协同刺激性分子 CD
28、40、 CD80 和 CD86 表达的上调。此研究结果也提示菌毛对宿主免疫系统有潜在的“危害”。 3） Pg 菌毛诱导多种与调节骨代谢有关的细胞因子的产生，改变牙槽骨的代谢，诱导骨的吸收 Pg 菌毛所诱导产生的细胞因子如 IL-1、 TNF-是骨重建中重要的局部调节因子，在牙槽骨的吸收破坏中起重要 作用，可促进结缔组织基质的降解，刺激骨的吸收，与牙周炎密切相关 1； IL-1、 IL-8、 TNF-等细胞因子还可通过自分泌和旁分泌途径，刺激更多的 IL-1、 IL-8、 TNF-的产生，使炎症加重和扩大，引起组织的进一步破坏。提纯的菌毛蛋白还能浓度依赖性的诱导肝细胞生长因子HGF/SF 的产生
29、。 HGF/SF，也名为趋化因子 SF，由间充质细胞产生，主要作用于上皮细胞，与刺激破骨细胞的活化有关。 Evans23研究发现表达菌毛的 Pg 能诱导无菌鼠牙槽骨丧失，而不产生菌毛的 Pg 诱导无菌鼠牙槽骨丧失的能力显著降 低，而且用提纯的菌毛蛋白免疫无菌鼠可预防 Pg 所导致的牙周组织的破坏。这也证实了菌毛与牙槽骨的吸收密切相关。 4） Pg 菌毛抑制单核细胞和巨噬细胞的凋亡 单核细胞和巨噬细胞的凋亡可能与慢性炎症性疾病密切相关。在缺乏生长因子的培养液中， Pg 菌毛蛋白可抑制人单核细胞 THP-1 的凋亡。这种抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗体所完全抑制。菌毛可激活细胞外信号传导激酶（ sig
30、nal-regulated kinase， ERK），刺激细胞内依赖细胞周期的蛋白激酶抑制剂 p21 的表达，从而阻断单核细胞和巨噬细胞的凋亡，提示菌毛可 阻断单核细胞和巨噬细胞的凋亡，是慢性炎症性疾病牙周病的一种重要的调节分子。 5） Pg 菌毛诱导免疫反应 慢性牙周炎与牙龈卟啉单胞菌感染不成熟树突状细胞（ dendritic cells，DCs）、诱导真皮下 DCs 和基底膜中成熟的 DCs 数量的增加有关。 Jotwani24的研究证实 fimA 基因正常表达的菌株 Pg381 与 fimA 基因的突变菌株 PgDPG3 相比，能更高效进入单核细胞来源的树突状细胞（ monocyte-d
31、erived dendritic cells， MDDCs）中，诱导 DCs 的成熟。 Pg381 感染 MDDCs 后，能诱导高水平的自体混合淋巴细胞反应，诱导 Th1-型免疫反应。用菌毛蛋白刺激 MDDCs，也能诱导DCs 成熟，而且成熟的 MDDCs 还能诱导自体同源性 CD4+T 细胞的增殖， -干扰素（ gamma interferon， IFN-）的释放。这些结果提示 Pg 菌毛可能在诱导 MDDCs吞噬 Pg 和诱导 Th1-型免疫反应中起重要作用。 Amano25报导在牙周炎病人体内能检测到高滴度的抗菌毛的特异性 IgG 和IgA 抗体。 Condorelli26报导在牙周炎病
32、人 71.7%活动性位点和 58.7%非活动性位点的龈沟液（ gingival crevicular fluid ， GCF）中能检测到抗 Pg 菌毛的特异性 IgA 抗体，而在健康对照组的所有位点的 GCF 中均不能检测到抗菌毛的特异性 IgA 抗体。这些流行病学研究的结果表明 Pg 菌毛具有良好的免疫原性，能在体内诱发免疫反应。 Pg 菌毛所诱导的免疫反应具有保护作用： Evans23等用提纯的菌毛蛋白和一种人工合成的 20 个氨基酸的菌毛多肽免疫无菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特异性抗体滴度较用全菌免疫后鼠血清中的抗体滴度高 3 4 倍。当给无菌鼠口腔接种 Pg 后，菌毛免疫鼠的牙 周组织未受
33、到破坏。 Yanagita27以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍乱毒素 CT 为免疫佐剂），能在黏膜效应组织（包括鼻腔通道，颌下腺）的 CD4+T 细胞诱导 Th1-/Th2-型免疫反应。而且颌下腺产生的抗原特异性的 IgA多克隆抗体可抑制 Pg黏附于上皮细胞，减少上皮细胞细胞因子的产生。提示菌毛是一种有潜力的研制牙周炎疫苗的候选免疫原。 6） Pg 菌毛诱导泡沫细胞的形成 有学者报导 Pg 的感染与动脉粥样硬化 28的发生有关。动脉粥样硬化是一种由血管壁开始的慢性炎症性反应，其中泡沫细胞的形成是其重要特点。Giacona28研究证实人体巨噬细胞在感染野生型 Pg 后，形成泡沫细胞的量明显增加，但
34、是感染 fimA 基因的突变菌株 Pg DPG3 后没有明显的变化，提示菌毛是Pg 诱导泡沫细胞形成的必须因素， Pg 菌毛可能与动脉粥样硬化的发生有关。 2.2 有关 fimA 基因表达调控的研究进展 Pg fimA 基因的表达途径有以下三种 29（按照表达和装配系统分类）：陪伴 /引导分子途径系统、第二分泌系统、核化依赖聚合系统。 fimA 基因表达的初始产物具有非常长的前序列。 Pg 蛋白酶参与 fimA 基因的翻译后处理、转运和装配 29。 fimA 基因的表达还受到以下因素的影响。 1）局部理化环境对 Pg fimA 基因表达的影响 研究表明 30， Pg fimA 基因的表达及菌毛
35、依赖性表型的活性均受到温度、离子浓度等环境条件的影响。 龈下区的温度并不恒定，常随牙齿部位及炎症程度而变 31，健康龈下区温度一般在 34 37，而炎性牙周袋内温度 可达 39。 Xie 等 32通过 fimA启动子 -lacZ 受体基因融合研究环境因素对 Pg fimA 基因表达的影响时，发现当龈下区温度由 34升至 39时， Pg fimA 基因表达可减少至 1/10。 Murakami 等33, 34的研究同样证实温度升高时，基因 fimA 的表达水平降低。 Amano 等 35报导温度从 37提高到 39时， Pg 对唾液成分和链球菌的黏附能力降低， Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性发
36、生改变。温度影响 DNA 的超螺旋结构，改变组蛋白与 DNA 结合的活性 36，从而降低基因转录的速度 37。 Pg 根据温度的变化来调整 fimA 基因表达的水平，可能是在机体感染 Pg 早期， fimA 基因表达水平较高，有利于 Pg 黏附及侵入牙周组织；随着炎症程度加重、牙周袋形成和局部温度升高，菌毛的产生受 到遏制，从而使菌毛的某些功能特性发生改变，而有利于 Pg 的生存。 基因 fimA 的表达还在转录水平受氯化高铁血红素浓度的调节 38。铁在 Pg的生长繁殖和毒力中起关键作用， Pg 以血红素的形式吸收铁 39。 McKee40等发现， Pg 在氯化高铁血红素过量时，毒力增强。在氯
37、化高铁血红素不足时， Pg生长速度降低， Pg 菌体表面菌毛数量减少 40，血凝素基因 hagB 和 hagC 的 mRNA表达水平降低 41，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶样蛋白酶等的数量及其致病毒力均明显增加 42, 43。为进一步阐明氯化高 铁血红素在调节 fimA 基因表达中的作用， Xie 等 38研究了 fimA 基因的转录活性，结果显示在缺乏氯化高铁血红素的情况下， fimA 启动子活性降低 50%，表明氯化高铁血红素可以对Pg fimA 基因表达起正调控作用。但是这种调控作用不如温度变化对其影响的程度明显。虽然在氯化高铁血红素缺乏时， Pg 的生长速度降低，但此时 fimA
38、启动子活性降低与 Pg 生长速度的降低并没有直接的联系 38， fimA 启动子的活性并不依赖于 Pg 的生长阶段。氯化高铁血红素调节 Pg fimA 基因表达的具体分子机制仍不清楚，许多受离子调控的基 因在其启动子区均存在“离子盒”，而在 fimA启动子区并没有与此具有同源性的区域结构 44。推测可能是由于 Pg 多种致病因子基因的表达共同受到氯化高铁血红素的调节所致。 影响 Pg fimA 基因表达的局部理化环境还包括血清、唾液、渗透压、 Ca2+浓度以及 pH 值等。 关于 Pg 如何感受到环境的变化，并把这种信息传递给细胞的机理并不完全清楚。但是研究发现信号转导系统的两种成分 FimS
39、-FimR 与 Pg fimA 基因的表达有关 45。 FimS 是一种组氨酸蛋白激酶基因的等位基因， FimR 是反应调节基因的等位基因 45。 FimS 和 FimR 的分裂会导致菌毛形成量的明显降低。 fimA 基因的表达可能受到 FimR 反应调节器的正调控 46。 FimR 调控包括 fimA 基因位点周围的 5 个成串的基因 fimA cluster 在内的多个基因的表达。染色体免疫沉淀反应和电泳分析表明，菌毛蛋白黏附到 fimA cluster 中的第一个基因的启动子区域。突变菌株的基因表达分析表明， fimA 基因转录过程包括多个步骤，FimR 基因上调 fimA cluste
40、r 中的第一个基因的表达，而此基因编码一个在 fimA基因的表达中起关键作用的调控蛋白。 2）其他口腔微生物对 Pg fimA 基因表达的调控 牙菌斑是一种附着了各种细菌的生物膜，这些菌斑微生物之间可以通过细胞间信号转导机制互相影响。 Pg 通过与获得性薄膜中的唾液分子 25或者先前定殖的细菌如口腔链球菌 1相接触而定殖于牙菌斑生物膜中，然后与牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是， Pg 不能聚集于链球菌突变株或者 S.cristatus这一底层的上面 47。针对这一现象的进一步研究揭示链球菌 S.cristatus CC5A能明显降低 Pg的 fimA基因的表达水平，其浓度与 fimA基因表
41、达水平呈负 相关，浓度升高时甚至可使 fimA 启动子活性下降 1/248。但是，在实验中尚未发现菌斑中的其他细菌，如纤细链球菌 G9B和 M5、血链球菌 10556、变形链球菌 KPSK2、内氏放线菌 NC-3、齿垢密螺旋体 GM-1 以及具核梭杆菌 10953 等对 fimA 基因的表达具有这种调控作用 49。 目前的研究结果认为， S.cristatus CC5A 与 Pg 之间的这种信号转导开始于Pg 受体对 CC5A 信号的识别 47。信号分子是链球菌 S.cristatus 细胞膜表面的一种分子量为 59kDa 的 CC5A 蛋白，与其他革兰氏阳性菌分泌的短信号肽有明显区别 49。
42、菌毛自身并非受体， fimA 基因突变的 Pg 株与 CC5A 蛋白的结合与野生型 Pg 菌株与 CC5A 蛋白的结合没有区别。这些结果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的许多细菌并不影响 fimA 启动子转录的活性，不影响 Pg 菌毛的产生，因而能够与 Pg 相互共存。但是， S.cristatus CC5A 能特异性地使 Pg fimA表达水平降低，从而影响菌毛的产生，阻止 Pg 在菌斑内的进一步的繁殖。 3） Pg 自身产物对 fimA 基因表达的调控 目前，定点诱变试验表明 50，在 fimA 基因上游区域存在一个 70-识别的RNA 聚合酶结合位点，研究证明，调节蛋白能够与此位点特
43、异性的结合，从而影响 RNA 聚合酶的功能。 Xie 等 48发现有三种蛋白可结合于 fimA 基因，分别是菌毛蛋白、赖氨酸蛋白酶（ Kgp）以及精氨酸蛋白酶（ Rgp）的翻译后处理片段。 将外源 fimA 启动子 -LacZ 受体插入携带 fimA 突变基因的 Pg 菌株内，结果发现插入的外源性 fimA 启动子不能活化， fimA mRNA 表达水平低；但若仅使 fimA结构基因上游区域产生突变，则不影响启动子的活性， fimA mRNA 的表达水平与野生型菌株相同 48。提示 fimA 基因在表达过程中，表达产物可作为调节蛋白与自身启动子上游区的 RNA 聚合酶结合位点结合，从而正反馈性
44、调节 Pg fimA基因的表达。 Pg 的半胱氨酸蛋白酶（ Rgp 和 Kgp）也参与调节 fimA 基因的表达。有研究51报道当 rgp 表达水平较低时， Pg 表面菌毛数量减 少。 rgpA 和 kgp 基因失活的 Pg 菌株 YPP1 和 YPP2 与野生型 Pg 相比， fimA mRNA 表达水平明显降低 52。Pg 381 的 rgp A 基因突变的变异株不表达菌毛， rgpB 基因变异菌株表达的菌毛水平较野生型菌株低 48。 Tokuda53等也证明 rgpA 单基因突变菌株的 fimA mRNA 表达水平下降，表达的菌毛蛋白很少，通过 Western 印迹分析不能检出菌毛蛋白，
45、其表面的菌毛通过电镜也无法观测到。菌株 Pg 33277 的 rgpA 和 rgpB双基因缺陷变异菌株则不表达菌毛 48。这些研究结果均证明蛋 白酶可在转录水平直接影响菌毛蛋白的产生。此外，在菌毛蛋白翻译后修饰加工的过程中， Pg蛋白酶还参与到对菌毛蛋白 N-末端氨基酸的修饰加工。 这些资料均表明包括菌毛蛋白、 Rgp 和 Kgp 蛋白酶在内的几种 Pg 来源的蛋白都是 fimA 基因表达调控系统的组成部分，它们能够与 fimA 基因的上游区域结合，从而影响 fimA 基因的 mRNA 表达水平。 综上所述，影响 Pg fimA 基因表达的因素有：局部理化环境，包括温度、氯化高铁血红素的浓度、
46、血清、唾液、渗透压、 Ca2+浓度以及 pH 值等；牙菌斑中的细菌如 S.cristatus CC5A； Pg 自身产物，如菌毛蛋白、 Rgp 和 Kgp 蛋白酶等。如能对 fimA基因的表达过程详细研究，在 fimA基因转录的过程中加以某种干预，使 Pg 菌毛蛋白的转录、翻译水平降低，或者使 fimA 基因翻译后的修饰加工过程受到干扰，使菌毛所介导的 Pg 的黏附、侵入降低，病理性作用减少，就有可能降低 Pg 相关性牙周炎的发病率和严重性，这也是未来的一个研究方向。 2.3 有关 fimA 基因分子克隆的研究进展 Dickinson 等 541988 年首次克隆并测序了 Pg381 fimA
47、 基因。 Fujiwara 等551993 年克隆并测序了 9 种 Pg 菌株的 fimA 基因，结果揭示这 9 种 Pg 菌株的fimA 基因覆盖 1044 1083 bp，所编码的多肽分子量为 37,527 38,239，菌株之间有一部分相同的序列，同时具有大量的不同序列。 Fujiwara55首次按照fimA 基因核苷酸序列的不同，将 Pg 分为 4 种基因型。 Sharma 等 561993 年首次用表达载体 pET-lld，大肠杆菌 BL21 表达了 Pg 2561 的部分菌毛多肽（氨基酸 10 337）。 Washington 等 571993 年用表达载体 pET-lld，大肠
48、杆菌 BL21 表达了 Pg 381 fimA 的一部分片段（ 1 kb）（ fimA基因全长为 1044bp）。 Sharma 等 581996 年首次构建了表达部分菌毛多肽的重组链球菌 一种活载体疫苗。以 pUC13Bg12.1 为模板，将编码 Pg 2561 FimA 蛋白部分肽段（ N-末端 55 14590 个 aa和 C-末端 233 322 残基 89 个 aa）的基因， PCR 扩增后，定向插入到链球菌（ Streptococcus gordonii） M6 基因（ emm6.1）的 Kpn I-Hind III 位点，获得融合表达质粒 pSMB55，然后转染于口腔链球菌（ S. gordonii GP251）中，制备为一种以细菌为载体的基因工程减毒活疫苗。在链球菌 M6 蛋白（氨基酸 1 122和 302 441）的锚定区，表达菌毛多肽（氨基酸 55 145和 233 322），形成一种融合蛋白。此链球菌所表达的菌毛多肽可竞争性的抑制 Pg 结合于唾液覆盖的羟基磷灰石上。而且将此疫苗菌株口腔内免疫无菌鼠后，可诱导血清中特异性