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1、理学其它相关论文 -牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白 fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（二） 5）金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性 在基因工程技术中，表达的重组蛋白多以包涵体形式存在，蛋白质经常会错误折叠而丧失活性，这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体，然后控制变性剂除去的速度，有时需要添加适当的氧化 /还原试剂，蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种，分别是稀释复性、透析复性和层析复性。 （ 1）稀释复性：直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单，适于小规模使用，但只适于浓度极低的蛋白质复性，否则会有大量聚集体形成。 （ 2）透析复性：采用
2、透析膜通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度。这种方法速度慢、耗时长，不适合大规模使用，有时易形成无活性蛋白聚集体。 （ 3）层析复性：使蛋白质可逆吸附在固相介质上，例如离子交换层析介质、金属螯合亲和层析介质等，可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。金属螯合亲和层析 (IMAC)是一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下，组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力，所以可在 IMAC 介质上同时实现复性与纯化 112-116。蛋白质吸附在 IMAC 介质后，先逐步降低变性剂的浓度，使蛋白质折叠，然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于 TNF 蛋白，使
3、用 IMAC 获得了 90%的复性收率 73。 2.6 小结 大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的 20 多年中，用各种载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合标签不但可提高重 组蛋白的产量，还可增强重组蛋白质的可溶性。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。随着金属螯合亲和层析技术的不断发展和改进，目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。 本课题组已成功构建了 Pg 菌毛蛋白 fimA 基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，本研究在此基
4、础上，拟将此质粒在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中表达，然后用固定化金属螯合亲和层析技术得到纯化的 FimA 蛋白，为下一步获取免疫血清、进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的免 疫疫苗提供实验基础。 3 实验一 fimA 在大肠杆菌中的表达 3.1 实验材料与仪器 3.1.1 菌珠 1）大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS：北京天根生化科技有限公司。该菌株基因型为： F-， ompT， hsdSB(rB-mB-)， dcm(DE3)， gal， pLysS， Cam r，该菌珠所带pLysS 具有氯霉素抗性。此质粒含有表达 T7 溶菌酶的基因， T7 溶菌酶能降低目的基因的背景表达
5、水平，但不干扰 IPTG 诱导的表达。适于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 2）携带有 pET-15b Vector 和 pET-15b-fimA 的大肠杆菌 TOP10（本课题组前期实验获得）。其中 pET-15b Vector：原核表达载体，双链环状 DNA，由 5708 bp 组成，含有可插入外源基因的多克隆位点（ MCS）、 Amp 抗性基因、 T7 lac、T7 promoter、 lac operator、 T7 terminator、 N-末端 His-Tag（ 6 个组氨酸）。是一种组氨酸融合表达载体，这 6 个组氨酸标签便于用钴柱纯化或以抗组氨酸抗体筛选。 pET-15b 载体读
6、框及多克隆位点见图 3.1，其克隆、表达区见图 3.2。 图 3.1 原核表达载体质粒 pET-15b 图谱 图 3.2 pET-15b 载体克隆、表达区 3.1.2 主要试剂 1） DNA Marker VI：北京天为时代科技有限公司 2）预染蛋白质 Marker：北京天根生化科技有限公司 3）细菌 LB 培养基（胰蛋白胨、酵母提取物）： Promega 公司 4）琼脂糖（ Agarose）：上海生工生物技术有限公司 5）琼脂粉（ Agar powder）：上海化学试剂公司 6）脱氧胆酸钠：上海亚培生物科技有限公司 7）丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基二乙胺（ TEMED）、十二烷基磺酸钠 (S
7、DS)、二硫苏糖醇（ DTT）、异丙基 - -D-硫代半乳糖苷（ IPTG）、 Tris 碱、甘氨酸、溴酚蓝： Amresco USA 8）考马斯亮蓝（ Brilliant Blue R-250）：上海绿岛科技发展有限公司分装 9） ECL 底物化学发光试剂盒： Pierce Biotechnology USA 10）质粒小提试剂盒：北京天为时代科技有限公司 11）硝酸纤维素膜（ NC 膜）：浙江省台州市四甲生化厂 12）一抗（ Anti-his antibody，小鼠单克隆抗体 IgG2b）：北京天根生化科技有限公司 13）二抗（ Goat anti-Mouse IgG， (H+L)， Pe
8、rpxidase Conjugated）： Pierce Biotechnology USA 14）脱脂奶粉：完达山乳业股份有限公司 15）其他生化试剂如溴化乙锭（ EB）、冰醋酸、甲醇、过硫酸铵、无水乙醇、NaCl、 CaCl2、 MgCl2、氨苄青霉素、氯霉素等，均为进口或国产试剂 3.1.3 实验仪器 1）自动双重纯水蒸馏器 SZ-93：上海亚荣生化仪器厂 2）超纯水设备 Elix3+Mil-GB：法国 Millipore 公司 3）电子分析天平 AA-250： Denver Instrument Company 4）恒温磁力搅拌器 78HW-1：杭州仪表电机厂 5）电热恒温干燥箱 PH
9、030：上海市实验仪器厂有限公司 6）数控超声波清洗器 KQ-500DE 型：昆山市超声仪器有限公司 7）全自动高压灭菌锅 HV-50：日本 HIRAYAMA 8）塑料薄膜封口机 SG-200 型：上海凯明电子机械有限公司 9）紫外线消毒灯 ZSZ：北京海淀空后高温复合材料厂 10）生物型洁净工作台 BCM-1000A：苏净集团安泰公司 11）微量移液器 Research 单道 /多道： Eppendorf 12）恒温培养箱 HH.B11.420-BS：上海安亭 13）大型摇床 QYC-211：上海福马实验设备有限公司 14）空气浴震荡器 HZQ-C：哈尔滨市东明医疗器械厂 15）离心机（台式
10、低速） TDL-40B：上海安亭科学仪器厂 16）离心机 Sigma1-15（台式高速）和 Sigma3K18（台式高速冷冻）： Sigma 17）离心机（超微型） E-Centrifuge： Wealtec 公司 18）微量振荡器 ZW-A：江苏常州国华电 器有限公司 19）石英定时器 SDD-2 型：北京市长风仪器仪表公司 20）电子恒温水浴锅 DK-98-1：天津市泰斯特有限公司 21）精密 DRY BLOCK 加热器 HGT24： T&D 22）酸度计 420A： Thermo Orion 23）核酸电泳仪 EPS-301： Amersham Biosciences 24）电泳槽 DY
11、CP-31D：北京六一 25）紫外可见光分光光度计 Ultrospec 3300： Amersham Biosciences 26）凝胶成像系统 Dolphin-Doc： Wealtec 公司 27）台式电脑：联想 28）扫描仪 ScanMaker 5900：中晶科技 29）冷冻干燥系统 Lyph-Lock 12 Liter： Laboconco 公司 30）普通冰箱 NR-B22S1：无锡松下冷机有限公司 31）低温冰箱 925 型： Forma Scientific 32） STD3101-1 蛋白电泳仪： Amersham Biosciences 33） Hoefer MiniVE Ve
12、rtical Electrophoresis System： Amershem Biosciences USA 3.2 实验方法 3.2.1 从大肠杆菌 Top10 中提取质粒 pET15b 与 pET-15b-fimA 从 -70 冰箱中取出携带有 pET-15b 和 pET-15b-fimA 的大肠杆菌 TOP10 菌珠，将细菌分别划线涂布于含 Amp（ 100 g/ml）的 LB 固体培养基平板上，倒置平板， 37培养 12 16 h 后出现菌落。 从培养平板中挑选氨苄青霉 素抗性菌落，分别接种入 5m1 LB 培养基中 (含Amp l00 g/m1)， 37 振荡培养 16 h，质粒小
13、提试剂盒分别提取质粒 DNA。步骤如下： 1） 4， 12000 r/min 离心 OD 值超过 0.6 的菌液 2ml，弃掉上清，倒扣在滤纸上流尽残余的上清。 2）加 250 l 溶液 P1，充分振荡混匀至彻底悬浮。 3）加 250 l 溶液 P2，温和的上下翻转 6 8 次使菌体充分裂解。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不应超过 5 min。 4）加 350 l 溶液 P3，温和的上下翻转 6 8 次，充分混匀，此时会出 现白色絮状沉淀， 4， 12000 r/min 离心 10 min，收集离心后得到的上清。 5）将上一步所得的上清加入吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中）， 12000
14、 r/min 离心 30 s，弃去收集管中的废液。 6）加 500 l 去蛋白液 PD， 12000 r/min 离心 30 s，弃掉废液。 7）加 700 l 漂洗液 PW（已加入无水乙醇）， 12000 r/min 离心 30 s，弃掉废液。 8）加 500 l 漂洗液 PW， 12000 r/min 离心 30 s，弃掉废液。 9）将吸附柱 CB3 放回收集管中 ， 12000 r/min 离心 2 min，尽量除去漂洗液。 10）取出吸附柱 CB3，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100 l 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 65 70水浴预热），室温放置 15 min
15、，12000 r/min 离心 1 min。将 1.5 ml 离心管（ DNA 溶液）于 70保存。 取 5 l 质粒 DNA， 10 g/L TBE 琼脂糖凝胶 80 V、 40 mA 电泳检测 DNA。设立 marker 对照。待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，在紫外灯下观察拍照。 3.2.2 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞的制备 采用低温 CaCl2 制备感受态细胞的方法制备大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞。步骤如下： 1）从 37培养 16 20 h 的平板上挑取一个单菌落（直径 2 3 mm），转到一个含有 50 ml LB
16、液体培养基的 250 ml 锥形瓶中， 37， 220 r/min 振摇培养3 4 h，至 A600 大约为 0.6。 2）将细菌转移到一个高压灭菌、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0。 3） 4， 4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。 4）倒出培养液，将管倒置 1 min 使最后的痕量培养液流尽。 5）用 30 ml预冷的 0.1 mol/L CaCl2-MgCl2溶液（ 80 mmol/L MgCl2 ,20 mmol/L CaCl2）重悬细胞沉淀。 6） 4， 4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。 7）倒出
17、培养液，将管倒置 1 min 使最后的痕量培养液流尽。 8）用 2 ml 冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液重悬细胞沉淀。 9）加入高压灭菌后的 50%甘油，配成含甘油 20 25%的悬液，分装 100 l/支于 eppendorf 管中， 70冻存。 3.2.3 空质粒和重组质粒转化 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞 1）制备含 Amp（ 50 g/m1）的 15 g/L 琼脂 LB 固体培养基平板。 2）取冻存于 70的 E.coli BL21(DE3)pLysS 感受态细胞在流水下快速解冻（不可震动）。 3）将提取的空质粒和重组质粒各 10 l 分别加入
18、两支感受态细胞中，轻轻吹打混匀。 4）冰浴 30 min 后，置预热后的精密水浴锅 42热休克 90 s，立即移入冰水中放置 2 min。 5）分别加入 37预热后的 LB 液体培养基（不含抗生素） 500 l， 37摇床 150 r/min 温和振摇 60 min，使细胞复苏。 6）将离心管内容物混匀，分别吸取 100 l 已转化的感受态细胞加到两个含 Amp（ 50 g/m1）的 15 g/L 琼脂 LB 固体培养基平板上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。 7）将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板， 37培养 12 16 h。 3.2.4 从 E.coli BL21(DE3)pLy
19、sS 中提取质粒 pET15b 和 pET-15b-fimA 从培养平板中挑选氨苄青霉素抗性菌落，分别接种入 5 m1 LB 培养基中 (含Amp l00 g/m1)， 37振荡培养 16h，质粒小提试剂盒分别提取质粒 DNA。步骤如 3.2.1 中所示。 取 5 l 质粒 DNA， 10 g/L TBE 琼脂糖凝胶 80 V、 40 mA 电泳检测 DNA。设立 marker 对照。待溴酚蓝迁移至理想位置后，终止电泳，在紫外灯下观察拍照。 3.2.5 重组质粒 pET-15b-fimA 在 E.coli BL21(DE3)pLysS 内的诱导表达 在转化了质粒 pET15b 和 pET-15
20、b-fimA 的 LB 固体培养基上，各挑取一单克隆菌落，分别接种入 1 ml Amp+（ 50 g/ml）的 LB 液体培养基中， 37， 250 r/min振摇过夜。用 LB 培养基 1:100 稀释过夜菌（ 50 l:5 ml）， 37剧烈振荡培养2 h，待菌液浓度达 A5500.6 0.8 时，加入异丙基 - -D-硫代半乳糖苷（ IPTG），诱导的 IPTG 终浓度和诱导时间成梯度改变，以摸索最佳诱导条件： A 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 2 mmol/L， 30振摇 3 h； B 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG
21、 致终浓度为 2 mmol/L， 30振摇 2 h； C 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 2 mmol/L， 30振摇 1 h； D 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 1 mmol/L， 30振摇 3 h； E 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 1 mmol/L， 30振摇 2 h； E 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 1 mmol/L， 30振摇 1 h； F 管： pET-15b， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 2 mmol/L
22、， 30振摇 3 h； 以上 7 个菌种管中菌液置于 EP 管中， 4， 12000 r/min 离心 5 min 收集细菌沉淀，弃去上清；向沉淀中加入等体积的水和 2Loading buffer（ SDS 凝胶加样缓冲液），重悬后煮沸 10 min，离心 8 min； 取上清进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）分析。 SDS-PAGE：配制 12 分离胶和 5浓缩胶，按 Amersham Biosciences 公司蛋白电泳系统说明书灌制凝胶。取上述样品，每孔 30 1 上样。电泳在恒压下进行，浓缩胶中为 90 V，分离胶中为 120 V。电泳结束后，凝胶右下角做切角标记，
23、然后将凝胶放入表面皿，加入 5 倍体积的考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 1.0 g，甲醇 450 ml，冰醋酸 100 ml，蒸馏水 450 ml）， 35摇床上染色3 h。染色完成后，加入脱色液（甲醇 100 ml，冰醋酸 100 ml，蒸馏水 800 ml），35摇床上脱色至背景清晰，观察。 3.2.6 蛋白免疫印迹（ Western blot）鉴定蛋白的表达 在转化了质粒 pET15b 和 pET-15b-fimA 的 LB 固体培养基上，各挑取一单克隆菌落，分别接种入 1 ml Amp+（ 50 g/ml）的 LB 液体培养基中， 37， 250 r/min振摇过夜。用 LB 培
24、养基 1:100 稀释过夜菌（ 50 l:5 ml）， 37剧烈振荡培养2 h，待菌液浓度达 A5500.6 0.8 时，加入 IPTG： A 管： pET-15b-fimA， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 2 mmol/L， 30振摇 3 h； B 管： pET-15b， 1 ml，加入 IPTG 致终浓度为 2 mmol/L， 30振摇 3 h； 以上 2 个菌种管中菌液置于 EP 管中， 4， 12000 r/min 离心 5 min 收集细菌沉淀，弃去上清；向沉淀中加入等体积的水和 2Loading buffer，重悬后煮沸 10 min，离心 8 min。 取上清进行 SDS
25、-PAGE，电泳结束后将凝胶切取所需条带部分后进行 Western blot，具体步骤如下： 1）用转膜缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜（ NC 膜） 30 min。 2）铺膜：将海绵在转膜缓冲 液中完全浸润铺于阴极板，上铺三层用转膜缓冲液浸湿的滤纸，铺凝胶，铺 NC 膜，再铺三层滤纸，每层均需完全清除气泡，上面铺两层海绵，合上转印盒，内加转膜缓冲液高于海绵。 3）转印：电泳槽内加冰块，灌入转膜缓冲液， 300 mA 转印 65 min。 4） 封闭：转印结束后，将 NC 膜放入封闭液（ 10 g 脱脂奶粉溶于 100 ml TBST中，煮沸冷却）中，液面必须过膜，摇床上轻摇 4 h，保证膜的所有
26、部分同溶液接触。 5）洗膜：弃去封闭液， TBST 洗 3 次，每次 15 min。 6）一抗结合：按照抗体说明书，用 TBST 将抗 His 标签的抗体稀释 2000 倍，弃去 TBST，将膜放入一个自封袋内加一抗（ 0.1 ml/cm2 膜面积）排出气泡，封口， 4冰箱过夜。 7）洗膜：弃去一抗， TBST 洗 3 次，每次 15 min。 8）二抗结合：按照抗体说明书，用 TBST 将 HRP 标记的山羊抗鼠 IgG 稀释2000 倍，弃去 TBST，将膜放入一个自封袋内加二抗（ 0.1 ml/cm2 膜面积）排出气泡， 37恒温箱孵育 1 小时。 9）洗膜：弃去二抗， TBST 洗 3
27、 次，每次 15 min。 10）用吸水 纸吸干膜上的水分。 11）显色：按 ECL 底物化学发光试剂盒说明书配发光检测液，用吸管将配制的发光检测液转移到 NC 膜上，使其均匀覆盖，室温孵育 5 分钟。 11）暗室胶片曝光，显影，在胶片上显示目的条带：在暗室中取一张 X 片置于膜上，合上暗盒（暗盒上下各固定一张合适大小的发光纸，膜上下再各放置一张玻璃纸） ,曝光，显影，定影，晾干保存。 3.2.7 蛋白表达形式分析 1）取 100ml 转化了 pET-15b-fimA 的大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 诱导菌液于预先称重的离心管中 4， 5500 r/min 离心 15 min。 *注
28、意 *：步骤 2 4 在 4下进行。 2）弃去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液（ 50 mmol/L Tris-Cl pH 8.0， 1 mmol/L EDTA pH 8.0， 100 mmol/L NaCl），轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。 3）每克（湿重）菌体加入 4 l 100 mmol/L PMSF， 80 l 10 mg/ml 溶菌酶，搅动 20 min。 4）每克（湿重）菌体加入 4 mg 脱氧胆酸钠，继续搅动。 5）悬液 37放置，不时用玻璃棒搅动，待其变黏时，每克（湿重）菌体加入 20 l 1 mg/ml DNase。 6）裂解液
29、室温放置，直至不再黏稠（约 30 min）。 7）细胞裂解液 4高速离心 15 min。 8）倾倒去除上清，留置待用，此为上清 1，沉淀重悬于 9 倍体积的 4细胞裂解缓冲液（ 50 mmol/L Tris-Cl pH 8.0， 10 mmol/L EDTA pH 8.0， 100 mmol/L NaCl， 0.5%Triton-100）。 9）悬液室温放置 5 min。 10） 4高速离心 15 min。 11）倾倒上清，留置待用，此为上清 2。沉淀重悬于 100 1 水。 12）各取 10 l 上清 1、上清 2、沉淀，分别与 10 l 2SDS 凝胶加样缓冲液（ Loading Buff
30、er）混合，用 12分离胶和 5浓缩胶 SDS-PAGE 分析靶蛋白的分布。 3.3 结果 3.3.1 从 E.coli Top10 中提取质粒 pET15b 与 pET-15b-fimA 电泳结果示（图 3.3），在 5500 bp 附近和 5500 bp7000 bp 之间各有一单一条带，与预期大小 5708 bp 和 6755 bp 一致。 图 3.3 pET-15b 和 pET-15b-fimA 质粒电泳图 1： pET-15b 2： pET-15b-fimA M： Marker (从上到下 7000， 5500， 3500， 2000， 1000， 500 bp) 3.3.2 从 E
31、.coli BL21(DE3)pLysS 中提取质粒 pET15b 和 pET-15b-fimA 电泳结果示（图 3.4）在 5500 bp 附近和 5500 bp7000 bp 之间各有一单一条带，与预期大小 5708 bp 和 6755 bp 一致。 图 3.4 pET-15b 和 pET-15b-fimA 质粒电泳图 1： pET-15b 2： pET-15b-fimA M： Marker (从上到下 7000， 5500， 3500， 2000， 1000， 500 bp) 3.3.3 重组质粒 pET-15b-fimA 的诱导表达分析 重组转化菌按前述程序经 IPTG 诱导表达后，在
32、 41 kDa 处显示融合表达蛋白条带，而空质粒 pET-15b 在该处无特异条带（图 3.5）。融合表达蛋白大小与预期大小基本一致， IPTG 浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当 IPTG 浓度为 2 mmol/L，诱导时间为 3 h 时蛋白表达量最大；当 IPTG 浓度为 1 mmol/L，诱导时间为 1 h 时蛋白表达量最小。实验结果表明，牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA 的 1044 bp 编码基因在 E.coli BL21(DE3)pLysS 中已初步获得正确表达。 图 3.5 pET-15b-fimA 的诱导表达分析 1： pET-15b-fimA， 2 mmol/L IPT
33、G 诱导 3 h； 2： pET-15b-fimA， 2 mmol/L IPTG 诱导 2 h； 3： pET-15b-fimA， 2 mmol/L IPTG 诱导 1 h； 4： pET-15b-fimA， 1 mmol/L IPTG 诱导 3 h； 5： pET-15b-fimA， 1 mmol/L IPTG 诱导 2 h； 6： pET-15b-fimA， 1 mmol/L IPTG 诱导 1 h； 7： pET-15b, 2 mmol/LIPTG 诱导 3 h； M：预染蛋白质 Marker 3.3.4 蛋白免疫印迹（ Western blot）的结果 融合表达的目的蛋白 His-Fi
34、mA 带有 His 标签，因此， 6His-FimA 表达产物经 SDS-PAGE 后，转移至硝酸纤维素膜，以鼠抗 6His Tag 单克隆抗体为一抗，采用山羊抗鼠的种属特异性抗体为二抗， ECL 底物化学发 光试剂盒显色，在 X 线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒 pET-15b 对应位置未见特异条带（图 3.6）。实验结果表明，重组质粒 pET-15b-fimA 在 E.coli BL21(DE3)pLysS 中获得正确表达。 图 3.6 融合蛋白表达产物的 western blot 鉴定 1： pET-15b 2： pET-15b-fimA 3.3.5 蛋白表达形式
35、分析 诱导菌裂解后，分离上清（上清 1）和沉淀（沉淀 1），沉淀经处理后，将得到的上清（上清 2）和沉淀（沉淀 2）以及上清 1 一起走蛋白电泳分析，结果显示（图 3.7），表达的融合蛋白位于沉淀中，主要以不溶性形式存在于包涵体中。 图 3.7 FimA 表达形式分析 A：上清 2； B：上清 1； C：包涵体沉淀 M：预染蛋白质 Marker 3.4 讨论 研究蛋白质的功能及制备抗体，必须获得目的蛋白。获得目的蛋白的途径有两种，一是利用蛋白的物理、化学特性从生物体内直接提取、纯化；另一种是利用基因工程技术构建表达载体，使目的基因在体外宿主细胞中大量表达目的蛋白。与直接从生物体内提取、纯化生物
36、大分子相比，后一种技术既简便又高效。 基因工程又称重组 DNA 技术、遗传工程、分子克隆，指在体外对 DNA 分子按照既定的目的和方案进行剪切和重新连接，或将 DNA 分子中某个（些）位点进行人工替换或删除，改造基因结构，然 后利用转化、转染、感染等方法将重组的DNA 片段导入宿主细胞，使 DNA 片段得到扩增。将目的基因在受体细胞内表达，产生目的蛋白产物。基因工程为蛋白质的研究提供了极大方便，使那些表达量少，又难以纯化的蛋白质得以大规模制备，也使获得自然界并不存在的蛋白质成为可能 63,117。 为使重组 DNA 在宿主中表达，有原核细胞表达外源基因和真核细胞表达外源基因两种体系。真核表达系
37、统虽然有蛋白翻译后加工机会多 , 甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染 , 具有遗传稳定性和可重复性等优点，但是利用真核表达系统难以使基因得到高 效表达。基因高效表达是一个非常复杂的问题，它受DNA 拷贝数、转录有效性、 mRNA 的加工转运及稳定性、转译有效性以及蛋白质加工、分泌及稳定性等多方面因素的影响，而且高效表达不同基因之限速因素又不尽一致。目前 ,对真核生物基因表达的研究远远不如对原核生物的研究深入。其原因主要有：真核生物基因组成和形态结构复杂，难以直接测定基因产物和基因控制的生化过程；难以选择影响调控基因的突变体；难以通过改变外界环境条件来研究分析基因表达的变化；难以直接进行基因
38、操作等。与真核表达系统相比，原核表达系统具有培养简单、迅速、经济、表 达效率高、表达稳定和容易纯化等优点。大肠杆菌是最常用的原核表达体系，一个好的大肠杆菌表达体系应该满足以下几个标准 71：尽可能低的诱导前泄漏表达；快速简便的诱导方式；能够高效表达多种基因；易于进行克隆操作；能直接进行点突变和 DNA 序列分析而不要亚克隆，从而满足蛋白质工程研究的需要。 在现有实验条件和经济条件下，为了得到高表达量和生物学活性好的 FimA蛋白，本实验选用原核表达载体 pET-15b 在原核表达体系大肠杆菌中进行融合表达。融合表达是将外源目的基因与另一基因构建成融合基因进行表达。该表达 方式的特点有 71,1
39、18：由于转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制，因而融合蛋白通常较易获得高效表达。外源序列与大肠杆菌基因的融合导致其融合蛋白通常较天然的外源蛋白稳定。另外融合蛋白表达也是纯化重组蛋白较简单易行的方法。 融合蛋白（ fusion protein）是指表达的蛋白质或多肽的 N 末端由原核 DNA编码， C 末端是由克隆的真核 DNA 编码。这样表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起，故称为融合蛋白。在表达融合蛋白时，为了得到正确编码的表达蛋白，在插入外源基因时，其阅读框架应与原核 DNA 片段的阅读框架一致，这样，插入的外源基因在翻译时才不致产生移码突变。融合蛋白具有极大的应用潜力71：
40、靶蛋白附着于已知酶功能和 /或抗原组成的结构域，可以简化靶蛋白的标记与分离；靶蛋白与信号肽连接，可以将融和蛋白分泌到特定的细胞区；运载蛋白能保护靶蛋白免受原核宿主的蛋白酶解作用；运载蛋白可以改善靶蛋白的溶解性，防止形成不溶性包涵体。 在前期实验中，本课题组将克隆的 Pg 的 fimA 基因片段连接入 pET-15b 原核融合表达载体，按正确的读框插入多克隆位点，成功的构建了重组质粒pET-15b-fimA。 本实验将此重组质粒在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中诱导表达。表达产物经 SDS-PAGE 分析，在分子量为 41 kDa 处出现一条新生的蛋白带，与预期的融合蛋白大小相符。表达
41、产物经 Western blot 分析，在 X 线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒 pET-15b 对应位置未见特异条带。这些实验结果说明 fimA 基因在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 中得到了正确表达。 对于某一种特定蛋白质的表达，选择大肠杆菌系统时主要从以下几个方面考虑 71：蛋白质的大小：小的胞质蛋白和多肽（ 长度小于 100 个氨基酸残基）最好能通过标准肽键与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列通常能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解；并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位点进行切割，可以回收到具有
42、活性的靶蛋白。在任何系统中表达长度大于 100 个氨基酸残基的胞质蛋白质都非常困难。在大肠杆菌中，这些蛋白质常常不稳定而形成包涵体；在哺乳动物细胞中，困难在于如何将外源蛋白和它的内源同系物区分开来。蛋白质的需要量：如果只需要少量的靶蛋白，比如筛选系列点突变蛋白寻找酶的 活性位点，那么多数标准表达质粒都可以满足需要；而如果活性蛋白需要纯化和 /或蛋白质的需要量很大，就有必要试验不同的宿主载体系统和纯化方法，最终确定一个最适合大规模表达的方案。蛋白质是否需要保留活性：如果表达靶蛋白的目的只是用于产生抗体，就不一定要获得活性蛋白，而可以选择便于靶蛋白纯化的表达系统，不管其是以活性形式还是变性状态存在
43、，包涵体的形成对不溶性蛋白质的分离非常有利。如果靶蛋白是用于生物化学或细胞生物学研究，那么保持或恢复蛋白质的功能就非常重要，而是否易于纯化就是次要的了。有时表达产物本身就是活性的可 溶性蛋白，而多数情况下表达产物是不溶的，必须经过从包涵体中纯化、溶解和再折叠才能恢复活性形式。如果表达蛋白是用于结构研究，最好能以可溶状态表达。 本实验所用的 pET-15b 载体属于 pET 载体系列。这类载体是 Studier 等于1990 年首先构建的。在这种载体中，外源编码基因在多克隆位点插入，置于天然 T7 噬菌体 RNA 聚合酶启动子的控制之下，外源基因的表达受 T7 RNA 聚合酶调控。 T7 RNA
44、聚合酶的转录效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高 5倍，能够高效转录 mRNA、大量表达目的蛋白。 T7 RNA 聚合酶 /启动子表达系 统还有一个特点，就是需用不同的宿主菌进行外源基因的克隆和表达。特别是在外源基因表达产物是宿主菌的毒性蛋白时，在同一宿主菌进行克隆和表达会很困难，有时是不可能的。本课题组前期实验构建融合表达载体的过程中，用于克隆的宿主菌 TOP10 不表达 T7 RNA聚合酶，宿主菌的其他 RNA 聚合酶不识别 T7 RNA 启动子， fimA 基因得不到表达，不会对宿主菌造成影响，从而保证了 fimA 基因克隆的顺利进行。本实验用宿主菌大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 来表
45、达 fimA 基因。由于正常大肠杆菌并不表达 T7 RNA 聚合酶，为了能利用 T7 启动子表达外源基因，研究者已将 T7 RNA 聚合酶置于 lacUV5 启动子的控制下，整合到大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 染色体中，从而能诱导表达 T7 RNA 聚合酶 63。 本实验表达的 His-FimA 融合蛋白编码 353 个氨基酸（菌毛蛋白 347 个氨基酸， His 标签 6 个氨基酸），在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 进行表达时，经蛋白表达形式分析证实表达的融合蛋白位于包涵体中。蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达，常常导致形成相差显微镜下可见的细胞质颗粒或包涵体。包涵体是由外源
46、蛋白与周围杂蛋白或核酸等形成 的不溶性的凝聚体，含大部分的表达蛋白。这些由表达蛋白聚集成的包涵体很容易与可溶性蛋白和膜蛋白分离。高水平表达外源蛋白的细菌经离心浓缩后，可通过机械法、超声处理法或溶菌酶加去污剂的方法进行裂解。包涵体经离心沉淀后可用 Triton-100 和 EDTA 或用尿素洗涤。洗涤的目的是尽可能从聚集的外源蛋白中除去可溶的、粘附的细菌蛋白。目前还不能预测外源蛋白在大肠杆菌中高水平表达时以可溶形式存在，还是聚集成包涵体。根据蛋白质的大小、疏水性和荷电性等，很难预见其表达状态。同时，根据天然蛋白的四级结构进行判断也是不可靠的，因为 无论是单体蛋白还是寡聚体蛋白的亚基都能形成包涵体
47、。 本实验中表达 FimA 蛋白的大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 经离心浓缩后，经含有Tris-Cl 和 EDTA 的缓冲液重悬，然后用溶菌酶进行裂解。裂解后的细菌离心浓缩后，沉淀用含 0.5%的 Triton-100 的缓冲液来洗涤。经 SDS-PAGE 分析，结果显示表达的融合蛋白主要位于沉淀中，以不溶形式存在于包涵体中。 影响基因在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。虽然在 15 42之间都获得过成功表达，但表达某一种特定蛋白质的最佳温度范围则可能很窄，只有 2 4。IPTG 的浓度对表达水平影响非常大， 1 mmol/L 是一个起点，也是一个比较高的浓度。实验中，应在 0.01 5.0 mmol/L 的范围内改变 IPTG 的浓度，寻找最佳使用浓度。受实验条件限制，本实验在 30，用 2 mmol/L IPTG， 3 h 的条件来诱导靶蛋白的表达，靶蛋白能够得到正确的表达。如果条 件允许，应该选择不同的温度、不同的 IPTG 浓度和时间来摸索最佳诱导条件，以达到最优的表达效果。