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1、. -第二章 蛋白质第一节 蛋白质的概念及其生物学意义一、什么是蛋白质？AA 借肽键相连形成的高分子化合物短杆菌肽含D-苯丙氨酸O 肽键：CNH 也叫酰胺键二、蛋白质的生物学作用或称功能分类物质吸收与运输、运动，调节代、储存养分、催化各种生化反响、分子间的识别支架蛋白、信息传递受体 复制酶、记忆、疾病防御 抗体。应用：固体酶的工业应用联于水不溶性树脂上、脱纺织品浆淀粉酶、生化制药，蛋白酶用于皮革的脱毛及软化等，都是利用蛋白质的催化作用，蛋白质生物芯片贮存信息量大，将多种蛋白质抗体固定、排列到玻璃板上，能检测各种疾病蛋白及其他基因表达蛋白，进展病原体与疾病诊断等。第二节 蛋白质的组成一、蛋白质的
2、元素组成： C50-55、H6-8、O20-30%、N15-18、S半胱aa0-4%有的还含有P酪蛋白、Fe、Zn、Mo钼Fe蛋白、Cu、I，特别是含N量都很接近，平均为16% 。所以，测出含N量 6.25100/16 蛋白质系数即可推测出蛋白质的含量凯氏定氮。二、蛋白质的aa组成通常只有20种，除Pro外均为 aa ，除甘氨酸外，都有D、L两种异构体碳原子为不对称碳原子所以有旋光性。投影式如下： COOH COOH H2N CH H C NH2 R R L D aa的分类方法：一氨基酸的种类分类一 根据侧链基团R的化学构造分为四类：第一类 脂肪族aa：侧链是脂肪烃链一氨基一羧基中性：一氨基一
3、羧基aa中共九种：H CH COOH CH2 CH COO CH2 CH COO NH2 OH NH+3 SH NH+3(Gly:G) (Ser:S) (Cys:C)CH3 CH COOCH3 CH CH COOCH3 CH CH COO NH+3 OHNH+3 CH3NH+3 (Ala:A) (Thr:T) (Val:V 支链aa)CH3 S CH2 CH2 CH COCH3 CH CH2 CH O(Leu: L支链aa)(Met:M) NH+3CH3 NH+3 CH3 CH2CH CH COO CH3 NH+3 (Ile:I支链aa)一氨基二羧基aa(酸性)及其酰胺OOC CH2 CH C
4、OOOOC CH2 CH2 CH COONH+3 NH+3(Asp:D) (Glu:E)O OH2N C CH2 CH COO H2N C CH2 CH2 CH COONH+3NH+3(Asn:N) (Gln:Q)二氨基一羧基aa碱性： NH2-COOHH3N+ CH2CH23 CH COO H2N C NH CH23 CH COO NH3+ NH2+ NH3+Lys:K(Arg:R)第二类 芳香族aa含有苯环的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Trp： CH2 CH COO HO CH2 CH COONH+3NH+3(Phe:F) 丙aa取代 (Tyr:Y)第三类 杂环aa：HC CCH2CH
5、 COOCH2 CH COOHN+ NH NH+3 N NH+3CHHis:H咪唑基 (Trp :W 吲哚基 苯并吡咯)第四类 脯氨酸，也称杂环亚氨基酸：由Glu复原、环化、再复原形成COO 四氢吡咯-2-羧酸NH2+(Pro:P)分类二 按侧链R基团的极性及在pH7左右时的解离状态分为：非极性：甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。不带电荷：带OH、SH、酰胺基极性 带负电荷酸性aa 带正电荷：Lys、Arg、His(碱性aa) . His等电点为7.59此外在蛋白质代中还有鸟aa、瓜aa尿素循环中、胱aa、羟脯aa、羟赖aa胶原蛋白的组分。甘aa的H介于极性与非极性之间，有时归入极性
6、不带电荷类中。 人和动物的必需aa：不能自身合成必须由食物获得。Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His*、Arg* (*半必需aa，儿童合成缺乏)二aa的性质1. 物理性质：无色结晶，易容于水，不容于有机溶剂，熔点高Gly：232,乙酸：16.6，分子间靠氢键缔合，这些特性说明是离子化合物。2. 两性解离及等电点：难点*COO加碱解离出H+带负电，加H+结合H+带正电，向阴极移动，在某一pH下带正、负电荷量相等。H3N+C H 由很酸向碱变化NH+3 CH COOH NH+3 CH COO R R R在电场中不移动，此时的pH称为aa的等电点pI。此时aa的溶解
7、度最小因为静电作用，pI与COOH和NH2的解离常数有关。K1：COOH解离为 COO + H+的解离常数；K2：H3N+解离为 NH2 + H+的解离常数。其pI可从pK计算或测定(用酸碱滴定法测定)。aa等电点的计算：只有一个解离基团的物质AH，其解离常数与pH的关系为pH=pK+lg(A-/AH).证明：AH A+H+ K=A-* H+/AH H+=K*AH/ A-=K/A-/AH-lg H+=-lgk-lgA-/AH即：pH=pK+lgA-/AHHenderson-方程。当有一半解离时，即 A-=AH时，pH=pK，即溶液的pH可由其溶质的解离常数与解离量计算而得，溶质的解离常数可查得
8、。pK：解离常数K的负对数。aa可看作二元弱酸酸性条件有两个可解离的H+其分步离解如下：K1+OH在充分酸的条件下 RCHCOOH RCHCOO + H+NH+3 NH+3R+ R0 K2RCHCOO RCHCOO + H+NH+3 NH2 R0 RR0H+R0H+R+ R+= K1= K1 R0=R+时K1=H+R-H+ K2R0K2= R = R0 H+ 用NaOH滴定到R0 = R时K2 =H+等电点时：aa处于两性离子状态，可有少量解离成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目和趋势相等。即：R=R+ 即 R0H+ / K1=K2R0 / H+ H+2= K1* K2H+2=K1K
9、2lgH+=pH；lgK1=pK1； lgK2=pK2两边取负对数得2lgH+lg K1lgK2即：pH= pK1 + pK2 / 2= pI分子的存在状态是多种多样的，但在一定条件下以某一状态为主。即aa的等电点pI就是两性离子(R0)两侧的pK值的平均值。基团的pK值可查得，故pI值可由二pK值计算得之。对于有三个解离基团的aa，如Asp、Lys只要取其兼(两)性离子两侧的pK值的平均值即得pI值。COOH COO COOCH NH+3 K1 CH NH+3 K2 CH NH+3 K3Asp=CH2CH2 CH2COOH COOH COOAsp+(R+) Asp0(R0) AspR等电点时
10、Asp主要以兼性离子R0存在，(R+)与R很小且相等等电状态为理想状态，pI为理论值。pI=pK1+pK2/ 2 同上赖COOH COOCOOCOO CHNH+3 K1 CHNH+3 K2 CHNH2 K3 CHNH2 CH24 CH24CH24 CH24 NH+3 NH+3 NH+3 NH2 R2+ R+ R0 RpI=Pk2+pK3/ 2 因R2+可忽略不计pI时可认为它是不存在的，否那么就不是等电状态了。NH2比NH2碱性强，结合H+能力大，结合后不易放出H+因受COOH影响小。3. 氨基酸的化学性质：与强酸、强碱都可生成盐铵盐与羧酸盐如 谷氨酸钠与水合茚三酮的反响 80-100的条件下
11、，首先使aa氧化脱羧脱氨形成醛，而本身被复原成复原型茚三酮，然后复原型茚三酮、氨和另一分子的水合茚三酮缩合形成蓝紫色的二酮茚二酮茚胺，这是aa 定性定量测定的根底，反响如下ONHOOOHOHOOHOOOONHOHOOO3H2O+ NH3 +二酮茚-二酮茚胺 紫兰色 吸收峰 570nm Pro、羟Pro生成黄色物质(因为无氨基)用于比色、测定、层析、电泳的显色剂。因为产生CO2 ，也可用CO2气体分析法测定aa只限于-氨基酸，肽和蛋白也有此反响，肽越大灵敏度越差。与亚硝酸的反响aa的NH2基被氧化成 OH，+NH3N被氧化成N2，HNO2N被复原为N2，等量进展。所以N2一半来自HNO2其他伯氨
12、基均可。生成N2的反响叫vanslyke斯莱克反响。可测N2量体积计算氨基的含量。用于测定蛋白质的水解程度。 与甲醛的反响：酸碱滴定没有适宜的指示剂因为等当点过高或过低。其氨基可与甲醛反响加成，生成N羟甲基或N，N二羟甲基aa。使NH+3变为NH2释放出H+。使溶液酸性增强，可用NaOH滴定之。与NH2的含量相当，即aa含量。这就是aa的甲醛滴定法，滴定到放出的H+被中和时的 pH为终点。RCHCOO RCHCOO+H+NH3 NH2 +HCHO RCHCOO NHCH2OH +HCHO RCHCOO N(CH2OH)2与2，4二硝基氟苯的反响胺与卤代烷的反响NH3的烷基化，生成黄色DNPaa
13、，不被酸水解。也可用之测肽和蛋白质的N端aa，反响后酸解得N端的DNPaa，有机溶剂提取别离，层析与标准氨基酸比照即可鉴定之。O2NFNO2NCH3O=S=OH3CClDNFB 丹磺酰氯 Sanger试剂 5二甲氨基萘磺酰氯O2N NF NO2O2NF NO2 R HR + H2NCHCOOH CHCOOH 因为丹磺酰aa有强烈的荧光，所以可用荧光光度计测定。均在试剂与NH2之间脱去卤化氢均称 Sangar反响。DNFB亦可与非氨基反响,如可生成：DNP-鸟氨酸。+aaS RNHCNHCHCOOHCONCNHCHSRN=C=S与异硫氰酸苯酯PITC的反响，称艾德曼反响Edman反响：弱碱性条件
14、下，形成苯氨基硫甲酰aa(PTC aa)，在无水酸硝基甲苯中与酸作用环化为苯乙酰硫脲氨基酸简称PTH或PTH-氨基酸。PTH在无水酸中极稳定。PTC基的引入使紧接着的肽键减弱，所以在无水酸中只切下之环化断裂同时发生PTHaa在紫外区有强吸收。Vmax=268nm.PTHaa可用各种层析技术别离，紫外分析测定与标准PTHaa比照即可知为何种aaN 末端，多肽、蛋白的N 末端aa也可与PITC反响，不断重复可得蛋白质aa顺序，多肽的aa顺序自动分析仪，即以此原理设计而成。一次可测60多个aa。7. 成肽反响：肽即氨基酸脱水缩合而成的化合物RCHCOOH + H2NCHCOOH RCHCONHCHC
15、OOH NH2 R NH2 R二肽、三肽含一个自由的氨基与羧基，还可缩合为多肽蛋白质 活性肽：谷胱甘肽GSH *Glu的r羧基Cys的氨基缩合成r肽键：SHCOOH O CH2 O HCH CH22C NH CH C NH C COOHNH2 2H H GSSG氧化复原酶的辅酶 SH催产素与加压素激素类：前者使子宫与乳腺平滑肌收缩二者只有两个aa不同：3Ile 3Phe8Leu 8Arg 所以有催产和促排乳作用，后者那么使血管平滑肌收缩使血压升高也使肾小球血管收缩形成尿减少也是血压升高的原因之一。所以也叫抗利尿激素，也与学习的记忆过程有关。均由下丘脑合成，神经垂体分泌入血H3N+S67 8 9
16、9肽O CysS TyrPheGlnAsnCysPro Arg GlyCNH2 升压素 C端Met 脑啡肽：许多有镇痛作用：C端Leu Leu脑啡肽已人工合成似吗啡有镇痛作用但不上瘾 5肽TyrGlyGlyPheMet 促肾上腺皮质激素ACTH 39肽，脑垂体分泌、 胆囊收缩素33肽，十二指肠分泌括约肌收缩，胆汁分泌减少引起厌食(减肥) 胰高血糖素(29肽，胰岛-细胞分泌)使糖原降解，血糖升高，与胰岛素相反。8 与荧光胺反响氨基：产物具有荧光 RN CHCOOH + CO2OOOO +aa OHO 荧光胺 荧光产物被390nm光激发，发射475nm的荧光ng级9. 与5，5/双硫基双2硝基苯甲
17、酸反响 测半胱aa Cys等的游离SH含量，生成含SH的硝基苯甲酸产物OD412nm有一吸收峰可测之Cys的含量。SNO2COOH SHOOCNO2SNO2COOHCH2 CH COO SH NH+3 + H Cys 5，5/双硫基双2硝基苯甲酸 硫代硝基苯甲酸 Cys与抗性有关 (吸收峰412nm)三aa制备与分析 可略制备： 蛋白水解：毛发水解H+ 胱aa、半胱氨酸 发酵：Glu菌发酵 Glu钠 化学合成： 酮酸 + NH3 aa 分 离：层析与电泳 第三节 蛋白质的构造蛋白质多肽链可分为四级构造。一、蛋白质的一级构造：其aa种类、连接方式及排列顺序，包括二硫键(共价键)。H2NCHCON
18、HCHCONHCHCONHCHCOOHR1R2R3RnNHCHCO称为aa残基 R成环那么无书写： N端(氨基末端)：有氨基的一端写在左边用H表示 C端(羧基末端)：有羧基的一端写在右边用OH表示连接方式：CONH。SS与稳定肽链的空间构造和生物活性有关如胰岛素：51aa分子质量573421A+30B 6 7 7 11 19 20 21 OH H H OH 研究方法：测定蛋白质的aa序列。Edman法一次只能测定60-70个aa残基的肽段 单条肽链测定如下：1.测定aa组成。酸解、碱解，可防止多肽链的aa丧失。测分子量确定aa个数 氨基酸残基的平均分子量为1202.测N、C末端aa 。DNFB
19、法等，确定肽链的数目，羧肽酶A释放除Pro、Arg和Lys的所有C末端残基，羧肽酶B只水解Arg和Lys为C末端残基的肽键，二者合用3.用两种以上的方法将蛋白质断裂为不同的肽段。如用不同的酶水解。4.别离各肽段，并测出它们的序列。Edman法5.根据各肽段的重叠局部推出蛋白质的全部aa排序。也可DNA测序后反推。关键是小肽段aa顺序的测定：Edman反响降解法与外肽酶酶解法。如：某十肽，用胰凝乳蛋白酶酶解得4个小肽：A1:AlaPhe；A2:GlyLysAsnTyr； A3:ArgTyr；A4:HisVal 胰蛋白酶酶解得3个小肽：B1:AlaPheGlyLys； B2:AsnTyrArgB3
20、:TyrHisVal.根据重叠构造拼接为： AlaPheGlyLysAsnTyrArgTyrHisVal(可直接Edman法)如果含两条以上的肽链先拆分成单链，假设含二硫键需先拆开：过甲酸氧化形成二个半胱氨磺酸(或用-巯基乙醇复原后用碘乙酸保护-形成羧甲基衍生物)：HCOOOH-CH2-S-S-CH2- -CH2-SO3H + -CH2-SO3H 含SO3H，分析时即知SS的位置可先水解成只含一个或少量SS的小肽段，以便确定SS的准确连接位置。二硫键位置确实定另取一份样品 + + -熏蒸一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从局部水解产物中别离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，
21、再与整个多肽链比拟，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易别离和鉴定，而且可在酸性条件下作用pH2，此时二硫键稳定。肽段的别离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进展第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度后在一样条件下进展第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，别离，测序，与多肽链比拟，即可确定二硫键位置。 提取 DNA测序后反推蛋白：蛋白质抗体 蛋白mRNA 反转录 cDNA测序反推见后一章。 第三节 蛋白质的构造多肽链
22、可分为四级构造。一、蛋白质的一级构造：其aa种类、(共价)连接方式及排列顺序，应包括二硫键。二、蛋白质的空间构造多肽链按一定方式盘绕折叠，形成立体空间构造各基团的作用力之故。也称蛋白质的构象或高级构造：指蛋白质分子中所有原子在空间的排列及肽链的走向，以一级构造为根底。肽键及肽键平面，双键性质不能自由旋转且比一般C-N键短，比C=N键长 O O O CCCNCCNC C=N O与H成反式 H H C H 亚氨基肽键中的4个原子CONH羧基与另一aa的氨基构成和与之相连的两个C原子都处于同一平面上。这个平面叫肽键平面，有局部单键的性质，只有C，C键可以旋转。多肽的主链由许多肽键平面构成，平面可以C
23、为顶点绕NC和CC键旋转，但受侧链基团的影响，只有少数的特定构造。所以肽链折叠有一定的限制，分为二、过渡、三、四级构造。1. Pr的二级构造：指多肽链本身的折叠与盘绕方式，驱使蛋白质折叠的主要动力来自各侧链基团及其与介质的相互作用H键维持系统的能量平衡。主要有螺旋构造、折叠、转角、无规那么卷曲四种。1螺旋构造：毛、发、羽毛中的角蛋白中的主要形式，多肽链盘绕成右手或左手螺旋是由肽键平面绕C相继旋转一定的角度形成的。典型的右手N 3.6aa残基为一圈，高0.54nm 0.54/3.6=0.15nm，3600/3.6=1000侧链R基伸向螺旋外侧相邻螺旋圈 C=O与亚氨基 NH氢间形成链H键，每个残
24、基的C=O 都与它后面的第四个 aa残基隔三隔aa残基形成H 键，氢键平行中心轴。 O H O H CNH C C NnS 3.613 (33)+4=133Rs：形成氢键封闭合环共价连接的原子数，几乎全为右手螺旋也有极少数左手螺旋。但整条肽链并非全是，如有Pro存在时，即中断无H可形成H键。带同电荷的aa出现在邻近位置上就会影响螺旋的形成，甘氨酸也不易形成螺旋。2 折叠构造： O=C C N C纵向排列形成片层 N-HN N N N C N平行(角蛋白) 反平行(丝心蛋白)折叠片层也可在同一肽链的不同局部之间形成。凸起：折叠的一股弯曲使一个氨基酸残基突出出来不形成氢键。3转角 出现在180回折
25、角处，此处Gly、Pro多侧链小才可形成，也叫发夹构造、回折、弯曲。 O H O H CNH C C NnS 310 (32)+4=1024自由回转无规那么卷曲：无规那么的松散构造。一种蛋白质中往往含几种二级构造2. 超二级构造与构造域：相邻的二级构造的组合体构象单元在空间上能与其它局部分开，、靠近、连接链连接平行的片层、曲折转角连接、回形拓扑构造曲折 左手超螺旋 希腊钥匙构象超二级构造无特定功能只有一定的组合规那么，在空间上能识别。构造域：是球蛋白的折叠单位，超二级构造进一步盘曲折叠成球状的，在空间上独立相对的、具有局部一定功能的构造，较小的蛋白可能只有一个构造域，这时构造域等于三级构造，超
26、二级构造与构造域在构造上很难区别后者比前者更复杂。构造域的类型：圆桶、螺旋束构造域后二者等转角相连3 78 62541 丙酮酸激酶 溶菌酶 肌红蛋白三级构造(单域)由两个以上构造域组合成三级构造可以是完整功能的蛋白质。 每个构造域都有其功能，三级构造是指多肽链的所有原子在空间的排列与分布，如肌红蛋白的三级构造一条多肽链，非极性侧链埋于分子部，极性基团分布在分子外表与水结合，所以具水溶性。有几个构造域常常就有几个功能区，构造与功能的统一。两条以上肽链才有四级构造：分子量大的蛋白多由几条多肽链组成，它们以非共价键结合成一个功能单位，执行一个特定功能，其中一条肽链就称为该蛋白的一个亚基Subunit
27、如血红蛋白由2、2亚基组成。1 2以共价键连接的肽链不能称为亚基，如胰岛素A、B链以两个SS键相连。四级构造：就是指亚基之间的连接及空间排列，不包括亚基部得空间构造，亚基单独存在无活性或活性很低，只有聚合成四级构造，才能有完整的生物活性。如血红蛋白只有2、2141、146aa=574个aa一起才能组成完整的功能单位。胶原蛋白：左手螺旋的多肽链缠绕成三股右手超螺旋的原胶原蛋白分子。胶原蛋白。三、蛋白质分子中的共价键与次级键非共价键一级构造由共价键维持：肽键酰胺键，二硫键；空间构造由次级键非共价键维持：氢、盐键离子键、疏水键、德华引力包括H键。二级构造主要是H键，三级构造主要是疏水力，盐键、氏力也
28、都起着重要作用维持特定构象。四、蛋白质分子构造与功能的关系 一级构造：构造决定功能，一样的功能有一样或相似的构造1. 不同动物的胰岛素小异差异在A链：8、9、10、30位aa残基。变化的aa不起决定功能作用；细胞色素C呼吸链的重要组分在动物间亲缘关系越近，差异越小，人与黑猩猩的差异小于人与鸡的差异。细胞色素C的构造中与之功能密切相关的部位在各种动物中都是不变的104个aa组成。2. 关键部位构造上的一点变化，就会引起功能的显著变化。如：镰刀型贫血病。只是血红蛋白2：141aa，2：146aa的链的第六位GluVal代替就使患者红细胞在缺氧时成镰刀状，易胀破、溶血，引起头晕、胸闷等贫血病症，都证
29、明Pr构造与功能的统一性。 构象与功能的关系构象：即空间构造。指取代基团，因为单键旋转所形成的不同立体构造。别构现象：构象改变功能也随之改变的现象。血红蛋白与O2的亲和力是很弱的，但其一个亚基与O2结合后引起的构象改变，亚基间次级键破坏，使其它亚基与O2结合力变大，结合速度变快。氧结合曲线成S型1 2氧饱和度氧饱和度P(o2) P(o2) 肌红蛋白的氧合曲线 血红蛋白的氧合曲线第四节 Pr的性质一、分子量大小：一般为1万100万主要测定方法：1. 超离心：在一定离心力下，分子量大沉降速度快。可用沉降系数来表示(正相关)。沉降系数：单位离心力下的沉降速度，cm/s/(cm/s2)单位S：斯威伯格
30、单位10-13秒2. 凝胶过滤：分子筛作用。分子量越大过滤速度越快，用标准蛋白作标准曲线与之比拟即可知未知蛋白分子量。3. SDS凝胶电泳：分子量与迁移率成反比，与标准样品比拟。因为SDS使各种蛋白的荷/质比均一样。大多数蛋白质与SDS按1:1.4(W/W)的比例结合 SDS：十二烷基硫酸钠二、Pr的两性电离与等电点Pr也是两性电解质：解离基团：末端的氨基与羧基、aa残基侧链上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、SH等。NH2PrCOOH NH+3 H+NH+3 H+ NH2 Pr Pr Pr COOH OHCOO OH COOpH pI pI = pH pHpI两性离子pI：使Pr所带的正电荷与负电
31、荷相等，静电荷为零的溶液pH值。此时在电场中不移动，溶解度最小。pI：决定与Protein的aa组成，碱性aa多那么pI大，否那么小。电泳：带电物质在电场中移动的现象叫电泳。方向：取决于所带电荷的性质(正负)后者又取决于溶液的pH值和蛋白质的氨基酸组成。速度：取决于所带电荷的多少(正相关)和分子的大小(负相关)荷质比混合蛋白的别离：电泳 自由界面电泳 电泳 纸上电泳 醋酸纤维薄膜电泳 区带电泳 凝胶电泳 圆盘电泳 平板电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳在pH8.6的电泳缓冲液中各蛋白最大pI为6.35-7.3滤纸电泳血清蛋白的电泳图如下：清蛋白 12球蛋白 +三、Pr的胶体性质大小：直径1100nm
32、，胶体颗粒：布朗运动、丁多尔现象、电泳现象、不能透过半透膜，具吸附能力分子大外表具电荷和非极性基团，可用玻璃纸、火棉胶等透析纯化去除小分子杂质，是生产上和实验室常用的纯化方法。稳定蛋白质溶液的因素不聚集成大颗粒而沉淀：水化膜层与电荷pHpI四、Pr的沉淀反响1. 加高浓度盐盐析：破坏蛋白质的水膜又中和其电荷。不同蛋白质所带电荷不同，所以，所需盐浓度不同，可分段盐析，NH42SO4半饱和，球蛋白析出；NH42SO4饱和，清蛋白析出分子量小pI低，只要pH 或pI可以认为所有的分子均带同样的电荷，所以，在一定pH下的盐析与分子量有关：越大越易沉淀，pI过低或过高中和其电荷所需盐浓度高。2. 有机溶
33、剂沉淀：极性有机溶剂与水的作用大于蛋白，破坏水膜，多同时调节pH使其接近pI(pI时消除了静电斥力)。多用乙醇。3. 重金属盐沉淀(pH 高于pI时)：蛋白质的重金属盐溶解度很小 。 沉淀4. 某些酸如：单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等生成不溶性盐而沉淀pHpI，并破坏分子氢键，使疏水性氨基酸残基移至分子外表，各分子靠疏水力结合。5. 加热变性沉淀：破坏分子氢键，疏水基团外露，与水亲和力减弱，水溶性降低，水化膜破坏。如制豆腐：加热大豆蛋白的浓溶液，并参加MgCl2盐卤使蛋白凝固。制取蛋白并保持其生物活性：盐析、低温下加有机溶剂沉淀，有机溶剂在高温或长时间接触会使蛋白质变性。五、蛋白质的变性：理化因素影响，使空间次级构造，理化性质和生物学性质改变(但一级构造并未破坏)的现象。变性蛋白质的特点：卷曲的肽链 伸展，构象破坏；生物功能丧失：酶的催化能力、血红蛋白的运O2能力、胰岛素调节血糖的功能。