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1、 麦类作物学报 2007, 27(3):475 -478 Journal of Triticeae Crops 小麦幼叶 DNA微量快速提取方法的改进 x 董建力、王敬东 惠红霞 张增艳 2 (1.个 夏农林科学院农业生物技术研究中心 .个 夏银川 750002; 2.中国农科院作物科学研究所，北京 100081) 摘要：为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要，以小麦幼叶为材料，探索了在液氮和无液氮条 件下提取 DNA方法的改进。结果表明，改进提取法 I (用液氮 ） 中，水浴中加 KC1抽提一次便可得到质量较 好的 DNA， 且液氮用量是常规提取法的 1/40 1/30;改进提取法 II
2、(无液氮 ） 中，水浴后加 KC1比水浴前加 KC1及不加 KC1的 RNA含量和杂质含量低， 026。 /OZ)2S。比值大， DNA浓度和纯度有所提高。两种改进方法 提取的 DNA经琼脂糖凝胶电泳检测都能得到质量较高的 DNA图谱，又经 SCAR PCR扩增均能得到 2条片 段大小相同的条带。 关键词：小麦；幼叶； DNA提取 ;PCR 中图分类号： S512. 1;S336 文献标识码 ： A 文章编号： 1009 1041(2007)( 0475 04 Improvement of the Method for Rapid DNA Extraction from Wheat Leafl
3、et DONG Jian li1, WANG Jing dong1, HUI Hong xia1, ZHANG Zeng yan2 (1. Agricultural Bie tech Lab. of Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Yongning, Ningxia 750005, China； 2. Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, China) Abstract： In orde
4、r to find out a quick wheat DNA extracting method for the molecular marker analysis of large quantity samples, the wheat leaflets were used as experimental materials to study the DNA extracting method with and without liquid N2. The result showed that adding KC1 into the extracting solution once aft
5、er incubating in water bath could result in better quality DNA and only 1 /40 1 /30 liquid N2 of conventional method was needed by the improved extracting method I (with liquid N2). In improved method II (without liquid N2)， adding KC1 after incubating in water bath led to low content of RNA， less i
6、mpurities and bigger ODiea /ODi value and higher concentration and purity of DNA. High： quality DNA bands could be observed when the DNA extracted by the two improved methods was analyzed by means of agarosegel electrophoresis, and two bands with same molecular weight were got by SCAR PCR amplificat
7、ion. Key words： Wheat； Leaflet； DNA； Extraction method； PCR 植物 DNA提取是分子标记选择中最重要、 最基本的操作。为了分离出高质量、高纯度的植 物基因组 DNA,许多学者用 SDS(十二烷基硫酸 钠）、CTAB(十六烷基三乙基溴化铵）等方法，以 水稻、小麦、大豆等作物的嫩叶为材料提取 DNA, 尽管分离的 DNA质量、纯度都较高，符合外源 DNA导入和 PCR检测的要求，但此法要用液氮 冷冻，操作步骤复杂，影响了分子标记技术的普及 和推广。不用液氮也可以直接从向日葵、大豆、玉 米、小麦种子中提取 DNA11-51。 不用液氮从小 麦
8、、棉花叶片中提取 DNA也有报道 6 其方法 是在研体中研磨，需叶片较多，提取过程所需时间 *收稿日期 = 2006 08 15 修回日期 ： 2006 1&27 基金项目：宁夏自然科学基金项目 （ B00t 2004), 作者简介：董建力 （ 1956-),男，副研宄员，主要从事小麦生物技术育种研宄。 .476 . 麦 类 作 物 学 报 第 27卷 较长。在分子标记辅助选择技术普及后，人们需 要更简单、易行的提取 DNA的方法。笔者在传 统植物基因组 DNA提取方法的基础上综合了几 种 DNA提取方法的优点，探索了从小麦幼叶中 微量、快速提取 DNA的方法，旨在为 PCR扩增 和重要农艺性
9、状基因的分子标记辅助选择育种提 供可行的方法。 1 材 料 与 方 法 1. 1试验材料和试剂 1. 1. 1试验材料以中国农科院作物科学研宄 所提 供 的 含 有 基 因 的 小 麦 Pm97033为材 料。 1.1.2 试剂 DNA 提取液 100 mmol/L Tris HC1 pH 8. 0, 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L ED TA, 2%SDS, pH 8. 0。氯仿 /异戊醇 （ 24 :1)、 异丙醇、乙醇 (70%和 100%)、 TAE缓冲液 :0.04 mmol/L Tris 乙酸， 0 001 mmol/L EDTA。 TE 缓冲液 ： 10 m
10、mol/L Tris Cl， 1 mmol/L EDTA pH 7.0。 琼脂糖 (0.8%和 1.2% )、 溴化乙锭。 1. 2 实验仪器 电泳仪 (DYY 10C型，北京六一仪器厂 ）； 电 泳槽 （ DYCp 31型，北京六一仪器厂 ） ； Smart SpecTM 3000核酸蛋白测定仪 （ BIG RAD Lab, Inc，USA); Eppendorf 5415D 离心机 ； UVP GDS 8000 凝胶成像系统 ;PCR 仪 （ PTG 200TM Peltf er Thermal Cycler, M J Research, Inc, USA);家 用微波炉；微量加样器 ;水
11、浴锅 ;低温冰箱；电子天 平。 1. 3 试验方法 1. 3. 1 DNA提取 （ 1)常规提取法 :取适量小麦 鲜叶片，在研体中倒入液氮超低温下研磨，研磨成 发白色粉末状取适量置于灭菌的 1. 5 mL离心管 中，力卩 600 ML 提取液 （ 100 mmol/L Tris HC1 pH 8.0， 100 mmol/L NaCl， 50 mmol/L EDTA， pH 8. 0, 2%SDS), 65 C水浴约 1 h,中间每隔 5 10 min摇一次。然后将离心管插入碎冰中 20 min。 加入 600 ML氯仿 /异戊醇 （ 24 : 1),轻摇混匀放 20 30 min 后 1 20
12、0 r/min 离心 20 min.取上清 液于离心管中，加入 0. 6倍体积的异丙醇，混匀并 在4 C冰箱静置 20 min,使 DNA充分析出， 10 000 r/min离心 10 min,弃上清液，用 70%乙醇将 团状 DNA冲洗 2次，再用无水乙醇冲洗 1次后 充分干燥，加 100 ML TE溶解 ,4 C冰箱保存。 (2) 改进提取法 I :取三叶期小麦大小相近的 第二叶，电子天平称鲜重，放入 1. 5 mL离心管 中，并放入有冰的保温盒。向保温盒倒入液氮将 离心管淹没 (如样品少可放在小烧杯，再放入保温 盒，倒液氮后烧杯不会裂 )，盖上保温盒盖。片刻 后用镊子取出离心管用锥型玻璃
13、棒在离心管中研 磨成发白色的粉状为止，加预热的提取液 (65 C) 600 ML, 65 QR浴约 20 min,中间每隔 2 3 min 摇一次。水浴后加 5 mol/L KC1 100 PL， 轻摇混 匀 4 C冰箱静置 5 min,加 600 ML氯仿 /异戊醇 (24 : 1)，轻摇混匀在 4 C冰箱静置 5 min后12 000 r/min离心 8 min,取上清液于离心管中，加 0. 6倍体积的预冷异丙醇，混匀静置 5 min, 10 000 r/min离心 5 min， 弃上清液，用 70%乙醇将 团状 DNA冲洗 2次，再用无水乙醇冲洗 1次后 充分干燥，加 100 ML TE
14、溶解， 4 C冰箱保存。 (3) 改进提取法 II:取小麦三叶期大小相近的 第二叶，电子天平称鲜重，放入 1. 5 mL离心管 中，用锥型玻璃棒在 1. 5 mL离心管中研磨，磨成 糊状后加预热的提取液 (65 C) 600 ML,下一步分 三个处理，即水浴前加 5 mol/L KCL 100 PL、 水 浴后加 5 mol/L KC1 100 PL及不加 KC1(对照 ） 。 65 C水浴 10 min,中间每隔 2 3 min摇一次。 4 C冰箱静置 5 min,加 600 PL氯仿 /异戊醇 （ 24 :1)，轻摇混匀 4 C冰箱静置 5 min后 12 000 r/ min离心 8 m
15、in,取上清液于离心管中，再进行二 提 (加 600 ML氯仿 /异戊醇，轻摇混匀后 10 000 r/min离心 5 min),取上清液于离心管中，加 0. 6 倍体积的异丙醇，混匀静置 5 min, 10 000 r/min 离心 5 min,弃上清液，用 70%乙醇将团状 DNA 冲洗 2次，再用无水乙醇冲洗 1次后充分干燥，加 100 PL TE溶解 ,4 C冰箱保存。 1. 3. 2 DNA样品检测 （ 1)凝胶电泳图谱检 测 :用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量，紫 外凝胶成像仪拍照。 （ 2)DNA浓度和纯度检测： 用美国产 BIG RAD核酸蛋白测量仪对 DNA样 品
16、做浓度和纯度检测。 （ 3) PCR检测： PW21基 因的 SCAR弓丨物序列为 Pm21C: 5， -CACTCTG CTCAAACCTTGCAGG 3 和 Pm21D： 5， CACTCTCCTCCACTAACTGAAG 3 ，上述弓丨 物序列由张增艳博士提供，上海生工生物工程有 限服务公司合成。 PCR扩增在 Peltier Thermal Cycler PTG 200上进行。反应体系为 25 PL: 10 X buffer 2. 5 ML， 25 mmol/L MgCh 1. 5 ML， 10 第 2期 董建力等：小麦幼叶 DNA微量快速提取方法的改进 .477 . mmol/L d
17、NTPs 0 5 卩 L， 引物 Pm21D、 Pm21E 各 1 PL(60 ng/PL)， DNA 样品 2. 0 PL(50 ng/ 卩 L)， 5 U/ML TaqE 酶 0 2 卩 L， ddH2 15. 8 卩L。 扩增体系的操作在冰上进行。反应条件 ： 96 C 变性 5 min,随后进行 40个循环，即 94 C 5 min, 55 C 退火 1 min, 72 C 2 min， 然后 72 C延伸 1 min， 4C 保存。 PCR扩增产物用 1.2%琼脂糖凝 胶电泳，溴化乙锭染色，紫外凝胶成像仪拍照。 M. Markers;l、 2.常规法 ;3、 4.改进提取法 I ;5
18、、 6.改进提 取法 II M. Markers； 1 and 2. Traditional method； 3 and 4. Modified extraction method I ? 5 and 6. Modified extraction method II 图 2不同方法提取的 DNA经 SCAR PCR的扩增结果 Fig. 2 SCAR PCR results of DNA extracted by different methods 7、 9)的 026Q值均大于水浴后加 KCl的值（材料 4、6、 8、 10)，说明水浴前加 KC1提取的 DNA含量 局于水洛后，但水洛后加 K
19、C1的 Q 28。 和 /?320值 小于水浴前加 KC1的，且 026。 /01)28()值均大于 水浴前加 KC1的，说明水浴后加 KC1比水浴前加 KC1的 RNA含量和杂质含量低， DNA浓度和纯 度相对较高。不加 KC1的 (材料 1、 2,对照 ） OD260 值虽然较高，但 D28Q和 OD32Q值均高于水浴前和 水浴后加KC1， 且 626 /OZ)28Q值均小于水浴前和 水浴后加 KC1， 说明不加 KC1比水浴前和水浴后 加 KC1提取的 DNA中含 RNA和杂质多。 2.3 PCR检测效果 为检测改进方法提取的 DNA是否满足 PCR 的要 求 ，本 研 宄 特 意 用
20、含 有 基 因 的 小 麦 Pm97033为材料提取 DNA。 对改进提取法 I、 II的 DNA样品进行了 SCAR特异标记分析（图 表 1 KC1对提取 DNA质量的影响 Table 1 Effect the KC1 on the quality of extracted DNA 材料 Materials 叶鲜重 Weight of leaf(g) 水浴前加 KCl (L) Before water bath 水浴后加 KCl (ML) After water bath OD 260 OD2S0 OD 320 含量 Content (ng/L) OD 260 / OD 280 1 0. 1
21、13 2. 057 1. 008 0. 054 2057045 2.0421 2 0. 107 2. 204 0. 959 0. 081 2203.57 2. 2979 3 0. 136 100 2. 062 0. 835 0. 033 2061. 50 2.4686 4 0. 100 100 0. 589 0. 236 0. 029 588. 54 2.4936 5 0. 091 100 2. 094 0. 790 0. 041 2093.70 2.6512 6 0. 110 100 0.480 0. 175 0. 012 480. 09 2.7445 7 0. 082 100 1.429
22、0. 569 0. 016 1429. 48 2. 5128 8 0. 093 100 1. 216 0.437 0. 014 1216.40 2. 7816 9 0. 100 100 1. 651 0. 597 0. 021 1651.33 2. 7683 10 0. 121 100 1. 278 0.448 0. 020 1178. 30 2.8527 2 结 果 与 分 析 2.1 DNA样品的凝胶电泳图谱 DNA样品的 0. 8 %琼脂糖凝胶电泳结果如 图 1。从图 1可看出，常规提取法和改进提取法 I、改进提取法 II都能得到条带清晰、亮度相近的 的 DNA片断，说明改进提取法 I、
23、 II提取的 DNA质量较好。从泳道来看拖尾可能是由于本 方法未用 RNase处理，因此底部有少量的 RNA 和杂质存在。 1、 2.常规法 ;3、 4.改进提取法 I ;5、 6.改进提取法 II 1 and 2. Traditional method； 3 and 4. Modified extraction method I ； 5 and 6. Modified extraction method II 图 1不同方法提取的小麦幼叶 DNA电泳图谱 Fig. 1 DNA from wheat leaflets by different methods 2. 2 KCl对 DNA质量的影
24、响 从表 1可以看出，水浴前加 KC1(材料 3、 5、 478 麦 类 作 物 学 报 第 27卷 2)，用 1对特异引物 Pm21D、 Pm21E对 DNA样品 进行PCR扩增，从图 2中看到，常规提取法和改 进提取法 I、改进提取法 II都能扩增出 2条完全 相同的特异带，其中上面一条目的基因带的片段 为 1 400 bp(箭头所示）。说明尽管此方法对 RNA的去除并不彻底，但少量的 RNA对 PCR扩 增结果无大的影响。 3 讨论 改进提取法 I (用液氮 ） 用叶片少，磨碎得既 快又好。水浴后加 KC1有利于除去多糖和色素等 一些干扰 PCR效果的物质，抽提一次便可得到质 量较好的
25、DNA。 说明操作过程中水浴和静置时 间缩短对提取 DNA没有明显的影响，此方法提取 DNA的质量 好、耗时少，每次 50个叶片 （ 50个材 料）的液氮用量是常规提取法的 1/40 1/30。每 次提取的样品越多越省液氮。用液氮提取 DNA 在小麦全生育期均可进行，特别适合较老的叶片。 有研宄认为，氯仿的残留易在 PCR反应时影 响 Taq酶活性 w。为了减少对 Taq酶活性的影 响，改进提取法 II中（无液氮 )采用不加氯仿，直接 用锥型玻璃棒在 1. 5 mL离心管中研磨，磨成糊状 后加预热的提取液，并在水浴后加 KC1， 经两次抽 提得到了质量较好的 DNA， 说明不加氯仿对提取 DN
26、A没有影响。关键是要快速磨细，时间不宜 长，磨细后要立刻加提取液，以防 DNA降解。每 加一次试剂后要轻摇混匀。此方法提取 DNA不 用液氮和有毒试剂氯仿，操作简单、快速、经济、质 量较好，特别适合小麦幼苗期大批量 DNA提取。 本研宄结果表明，水浴后加 KC1比水浴前加 KC1及不加 KC1的 RNA含量和杂质含量低， 0/)26 /028。比值大， DNA浓度和纯度有所提高。 两种改进提取法经琼脂糖凝胶电泳检测均能得到 质量较高的 DNA图谱，又经 SCAR： PCR扩增均 能得到2条片段大小相同的条带。说明此方法提 取的 DNA中虽然含有少量的 RNA和杂质 ，但能 够满足 SCAR分析
27、的要求。此方法是否满足要求 更高的 PCR分析还有待研究。 关于模板 DNA浓度和含量的问题，许多学者 已经做了一定的探讨，认为 RNA的存在不影响扩 增结果 本结果也证实了这一点。由于本研宄 采用微量提取 DNA， DNA量少不能满足在紫外 分光光度计上测量的要求，本研宄用核酸蛋白测 量仪 （ 美国产 )，只需取 DNA母液 10PL稀释 20 倍就可得出、 CZ)28 、 0/)32 、 DNA 含量（ ng / PL) 及 。比 值 的 结 果 。目 前 用 该 仪 器 测量 DNA浓度和含量尚未见报道。从本试验中 还看到，许多 DNA样品 026。 /0/)28()的比值大于 2. 0
28、,但经 PCR扩增均有比较清晰的目的条带。 根据本研宄中 PCR扩增结果，初步认为用该仪器 测量DNA浓度在 50 300 ng /PL可用于 PCR 分析。提取的 DNA样品能否满足 PCR扩增主要 看电泳检测结果，但浓度过大或过小对 PCR扩增 都有直接影响。 参考文献： 11刘杰，熊艳文，刘公社，等 .向日葵种子不同部位微量提取 DNA用于 PCR的研宄 J.西北植物学报 .2001, 21 (4): 615 619. 2 杨少辉，张丽娟，段会军，等 .大豆种子 DNA的提取方法 J 大豆科学， 2003,22(2): 151 153. 3 郭景伦，赵久然 ,尉德铭，等 .玉米单粒种子
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