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1、 1. 1.了解血球计数板的结构及计数了解血球计数板的结构及计数原理。原理。 2 2、掌握使用血球计数板进行微、掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。生物计数的方法。 测定微生物数量方法很多，通常采用的有显测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的于显微镜下直接计数的一种
2、简便、快速、直观的方法。方法。 血球计数板上刻有一长宽各为血球计数板上刻有一长宽各为1 1毫米的方形大格，其毫米的方形大格，其体积为体积为0.1mm0.1mm3 3。计数板有两种刻度，一种是每大格分为。计数板有两种刻度，一种是每大格分为1616个中格，而每中格又分个中格，而每中格又分2525个小格，每大格为个小格，每大格为16162525小格小格=400=400小格，而另一种，则是每大格分为小格，而另一种，则是每大格分为2525个中格，而每中个中格，而每中格又分为格又分为1616个小格，则每大格为个小格，则每大格为252516=40016=400小格（计数板小格（计数板上的标识为上的标识为XB
3、XBK25K25） 计数时，如果使用计数时，如果使用16格格25格规格的计数室，要按对格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即个中格（即100个个小格）的酵母菌数。如果使用小格）的酵母菌数。如果使用25 格格 16格规格的计数室格规格的计数室除了取其除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即即80个小方格个小方格)的酵母菌数。的酵母菌数。(6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的上方和左方线上的酵母细胞上方和左方线上的酵母细胞(或只计数下
4、方和右方线上的或只计数下方和右方线上的酵母细胞酵母细胞)。 (1)1625的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式： 酵母细胞数酵母细胞数ml=（100小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数 100）40010000稀释倍数稀释倍数 (2)25x16的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式： 酵母细胞数酵母细胞数ml=（80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数80）40010000稀释倍数稀释倍数 显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。片、吸管、吸水纸。1. 1. 镜检计数室镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，对计数板进行镜检。若有污物，则
5、用自来水冲洗，用电吹风吹干后则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能才能 进行计数。进行计数。2. 2. 加样品加样品 在血球计数板上盖上盖玻片在血球计数板上盖上盖玻片, , 用滴管用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴, ,菌液会菌液会自动进入计数室，静置自动进入计数室，静置5 5分钟。分钟。3. 3. 计数计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 2525个中格的个中格的取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复取计数板四角和中间位置的五
6、个中方格计菌数。重复计计2-32-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体的个数。菌体的个数。4.4.清洗血球计数板清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。须重复洗涤干净为止。第一个第一个中格中格第二个第二个中格中格第三个第三个中格中格第四个第四个中格中格第五个第五个中格中格第一次第一次测测 定定第二次第二次测测 定定第三次第三次测测 定定平平 均均 1. 1.使用血球计数板应注意什么问题使用血球计数板
7、应注意什么问题? ? 2. 2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施改进措施 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。 培养基是用人工的办法将多种营养物培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机
8、盐、生长因素以及某些特需的微量元无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素素外外还应具有适宜的酸碱度还应具有适宜的酸碱度pH值值、缓、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。冲能力、氧化还原电位和渗透压。 (1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10NaOH溶液、溶液、l0盐酸溶液、琼脂、水盐酸溶液、琼脂、水(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试纸、试纸、试管、分装漏斗、棉花。试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气灭菌锅、高压蒸气灭菌锅、烘箱。烘箱。 一、玻璃器皿的洗涤和包装一
9、、玻璃器皿的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等包装培养皿和移液管等。 2-1棉塞制作方法2-2移液管灭菌前的包装牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）（一）培养基配方：培养基配方： 牛肉膏牛肉膏2.5g 蛋白胨蛋白胨5.0g、NaCl2.5g、琼脂、琼脂10.0g、自来水、自来水500mL、pH7.27.4。 （二）（二）操作步骤：操作步骤： 1. 取一个取一个1000mL烧杯，装烧杯，装500mL蒸馏水。蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶
10、按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。解。注意：注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。适当补充因蒸发而损失的水量。 3. 调调pH值值：用：用10 NaOH调调pH至至7.27.4，用精密，用精密pH试纸对试纸对照。照。 4.过滤过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养
11、基，该步可热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。省略。 5. 分装分装：将培养基分装于：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入支试管，其余全部倒入250mL锥形锥形瓶中，分别塞上棉塞。瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染或瓶口上面造成污染(见图见图23)。分装量：固体培养基约为试。分装量：固体培养基约为试管高度的管高度的15，灭菌后制成斜面（图，灭菌后制成斜面（图24）。分装入锥形瓶内）。分装入锥形瓶内以不超过其容积的以不超过其容积的3/53/5为宜。半固体培养基以试管高度的为宜。半固体培养基以试管高度的
12、1/3为为宜灭菌后垂直待凝。宜灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口注意不要污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。，挂上标签，注明何种培养基。 7. 灭菌备用灭菌备用：灭菌条件：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力（相当蒸汽压力0.103MPa）培）培养基灭菌后必须在养基灭菌后必须在37下恒温培养下恒温培养24h，确定无菌生长，方可，确定无菌生长，方可使用。使用。图23培养基分装 图24 斜面制作 1.取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸蒸馏水，放馏水，放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒菌块或土壤颗
13、粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。扎，待灭菌。 2.另取另取5支支18mm180mm的试管，分别装的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。材料。 加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌干热灭菌和和湿热灭菌湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至节至160并维持并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处
14、，待温度把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到降到50左右，才能将物品取出。左右，才能将物品取出。 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为温度计指示温度为100时关闭排气阀；或当排时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。
15、出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。 5. 当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭菌器内的温度为121)即开始灭菌，使其维持即开始灭菌，使其维持1530min。对。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2) ，延长时，延长时间。间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。品，排出锅内剩余水。 7. 待培养基冷却后置于待培养基冷
16、却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。 即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。菌。 操作方法：操作方法： a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每次在次，每次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进重复进行。行。 b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢
17、萌发成营养体，以便下次蒸煮时未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。杀灭。 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在放在 37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。用于除菌的滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器 1.配制培养基有哪几个步骤配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意在操作过程中应注意些什么问题些什么问题?为什么为什么? 2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培 养基进行无
18、菌检查？养基进行无菌检查？ 3.3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖汽才能打开锅盖? 1.掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。 2.掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。 无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移套、无菌移液管液管1mL2支、支、10mL1支。支。 营养琼脂
19、培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或瓶，活性污泥或土壤或湖水湖水1瓶，无菌稀释水瓶，无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。 其它：接种环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。一、细菌的纯种分离一、细菌的纯种分离 1. 取样取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。 2. 稀释水样稀释水样 将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上无菌水排列好，用记号笔依次编上101、 102、103、104、105、106。在无菌操作条。在无菌操作条件下，用件下，用10mL的无菌移液管吸取的无菌移液管吸
20、取10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入编号为加入编号为101无菌水无菌水(内含玻璃珠内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三中，将移液管吹洗三次，用手摇次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌浓度的菌液。用液。用1mL无菌移液管吸取无菌移液管吸取1mL 101浓度的菌液于编号浓度的菌液于编号为为102无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓浓度菌液。同样方法，依次稀释到度菌液。同样方法，依次稀释到106 。稀释液的制备稀释液的制备10mL试样 90mL蒸馏水 3. 平板的制作平板的制作 取取10套无菌培养皿编号，套无菌
21、培养皿编号， 104、105、106各各3个，另一个个，另一个为空气对照。为空气对照。 取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小的菌液浓度小的菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸取为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左左右时，右手拿装有培养基的锥形右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，
22、靠近火焰，将皿盖指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置分混匀，冷凝后即成平板，倒置于于30培养培养2448h，然后观察，然后观察结果。结果。 a:皿法皿法 b:倒平板倒平板 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖盖10min后盖上，倒置于后盖上，倒置于30培养培养2448h，然，然后观察结果。后观察结果。 1. 平板制作：平板制作：将融化并冷至约将融化并冷至约50的肉
23、膏蛋白的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。板。 2. 划线：划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线在平板上轻轻划线(切勿划破培养基切勿划破培养基)。划线完。划线完毕盖好皿盖，毕盖好皿盖，30培养培养2448h后观察结果。后观察结果。平板划线分离的划线
24、方法 左：连续划线法（1，2依次划线的起点）右：分区划线法（1，2，3，4依次划线的起点） 接种方法：常用的有接种方法：常用的有斜面接种法斜面接种法、平板接种法平板接种法、液体接种法液体接种法、试管深层固体培养基的试管深层固体培养基的穿刺接种法穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。种铲或接种锄、玻璃涂棒等。 左手平托两支试管，拇指压住两支试左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面白斜面(两支试管的斜面同时向上两支试管的斜
25、面同时向上) 。右手。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。 右手拿接种环，在火焰上先将右手拿接种环，在火焰上先将环端环端烧烧红灭菌，然后红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部将有可能伸入试管的其余部位位也过火灭菌。也过火灭菌。 将两支试管的上端并齐，靠近火焰，将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中棉塞仍夹在手中，然，然后让试管口缓缓过火焰。后让试管口缓缓过火焰。123 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却先冷
26、却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线由底部向上划线。抽。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。次烧红接种环，则接种完毕。456781.液体接种法液体接种法(从斜面菌种接入培养液从斜面菌种接入培养液)：用：用接种环接种环挑取斜面菌挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试环上的
27、菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。烧红灭菌。2.穿刺接种法穿刺接种法(从斜面菌种接入从斜面菌种接入(半半)固体培养基固体培养基)：用：用接种针接种针经火经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。灭菌，则接种完毕。1.稀释样品：方法同稀释平板分离法稀释样品：方法同稀释平板分离法2.倒平板
28、：将融化并冷至倒平板：将融化并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板冷凝后即成平板3.用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀4.将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。（四）液体培养基中的菌种接入液体（四）液体培养基中的菌种接入液体培养基培养
29、基 接种工具：无菌移液管和无菌滴管接种工具：无菌移液管和无菌滴管 移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌 用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接 到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。 1. 斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？针在无菌培养基上沾一下？ 2.2.用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？应从哪个浓度开始？为什么？ 1.了解总了解总大肠菌
30、群的数量指标在环境领域的大肠菌群的数量指标在环境领域的 重要性，掌握重要性，掌握总总大肠菌群大肠菌群的检验方法。的检验方法。 2.通过检验过程，了解通过检验过程，了解大肠菌群的生化特性。大肠菌群的生化特性。 用孔径为用孔径为0.45m的微孔滤膜过滤水样，的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数，算出每升水样中的典型大肠菌群菌落数，算出每升水样中含有的总大肠菌群数。含有的总大肠菌群数。 显微镜、锥形瓶、移液管、灭菌显微镜、锥形瓶、移液管、灭菌培养皿、培养
31、皿、小试管、试管（小试管、试管（18mm180mm）、）、吸管、吸管、接种环、试管架、过滤器、抽滤设备、无接种环、试管架、过滤器、抽滤设备、无菌镊子、滤膜菌镊子、滤膜 （孔径为（孔径为0.45m）、培养箱）、培养箱: 361、冰箱、冰箱: 04、天平。、天平。 革兰氏染色液一套：革兰氏染色液一套：草酸铵草酸铵结晶紫染液、结晶紫染液、革兰氏碘液、体积分数为革兰氏碘液、体积分数为95乙醇、番红乙醇、番红染液。染液。 蛋白胨蛋白胨 10g 酵母浸膏酵母浸膏 5g 牛肉膏牛肉膏 5g 乳糖乳糖 10g 琼脂琼脂 20g 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 3.5g 无水亚硫酸钠无水亚硫酸钠 5g左右左右 碱性品红乙
32、醇溶液碱性品红乙醇溶液(50g/L) 20mL 蒸馏水蒸馏水 1000mL pH： 7.27.4 灭菌条件：灭菌条件：0.072Mpa（1150C，1520min） 蛋白胨蛋白胨 10g 牛肉膏牛肉膏 3g 乳糖乳糖 5g 氯化钠氯化钠 5g 溴甲酚紫乙醇溶液溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL 蒸馏水蒸馏水 1000mL pH： 7.27.4 灭菌条件：灭菌条件：0.072Mpa（1150C，20min） 一、准备工作一、准备工作 1.滤膜灭菌滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。前两
33、次煮沸后需更换水洗涤前两次煮沸后需更换水洗涤23次，以除次，以除去残留溶剂。去残留溶剂。 2.滤器灭菌滤器灭菌: 用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用用121高压灭菌高压灭菌20min。 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，面向上，贴放在已灭菌的滤床上、，固定好滤器，将将333mL水样水样(如水样含菌数较多，可减少过滤水如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，注入滤器中，打开滤器阀门，在在-500Pa压力下抽滤。压力下抽滤。 水
34、样滤完后，再抽气约水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基平板上，滤膜截留细菌面在品红亚硫酸钠培养基平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入有气泡，然后将平皿倒置，放入37恒温箱内培恒温箱内培养养2224h。 挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、挑出符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。镜检。 紫红色，具有金属光泽的菌落。紫红色，具有金属光泽的菌落。 深红色，不带或略带金属光泽的菌落深
35、红色，不带或略带金属光泽的菌落淡红色，中心色较深的菌落。淡红色，中心色较深的菌落。 凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养基液，于接种乳糖蛋白胨培养基液，于3737培养培养24h24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。群阳性。 计算滤膜上生长的总大肠菌群数计算滤膜上生长的总大肠菌群数 将自来水中总大肠菌群数量计算出来将自来水中总大肠菌群数量计算出来 水中总大肠菌群数水中总大肠菌群数(个个/L)滤膜生长的菌落滤膜生长的菌落数数1000过滤水样量过滤水样量(mL)（滤膜上菌落数以（滤膜上菌落数以2060个个/片为
36、适宜）片为适宜） 1.检查饮用水中的大肠菌群有何意义？检查饮用水中的大肠菌群有何意义？ 2.2.实验过程中有什么问题，你认为原因何实验过程中有什么问题，你认为原因何在，如何克服？在，如何克服？ 1.了解不同环境条件下，空气中微生物的了解不同环境条件下，空气中微生物的分布状况；分布状况；2.学习并掌握检测和计数空气微生物的基学习并掌握检测和计数空气微生物的基本方法。本方法。实验目的实验目的灭菌培养皿、天平、称量纸、恒温箱、灭菌培养皿、天平、称量纸、恒温箱、培养基培养基实验器材实验器材牛肉膏牛肉膏 5.0g 蛋白胨蛋白胨 10.0g、NaCl 5.0g、琼脂琼脂 20.0g、自来水自来水 1000
37、mL、 pH 7.27.4灭菌条件灭菌条件:0.103Mpa（1210C、1520min） 可溶性淀粉可溶性淀粉 20g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO47H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO47H2O 0.5g 琼脂琼脂 20g 蒸馏水蒸馏水 1000mL pH 7.27.4 灭菌条件：灭菌条件：0.103Mpa（1210C，1520min）蔗糖蔗糖 30gK2HPO4 1gKCl 0.5gNaNO4 2gMgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g水水 1000mL pH 自然自然灭菌条件：灭菌条件：0.072Mpa（1150C，1520min
38、） 落菌法落菌法 (1)将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、将肉汤蛋白胨琼脂培养基、查氏琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基溶化后，各倒十五个平板，高氏一号琼脂培养基溶化后，各倒十五个平板，冷凝。冷凝。（2）在一定面积的房间内，按下图的）在一定面积的房间内，按下图的5点所示，每点所示，每种培养基每个点放三个平板，打开皿盖，暴露于种培养基每个点放三个平板，打开皿盖，暴露于空气中空气中30分钟或分钟或60分钟后盖上盖子。分钟后盖上盖子。（3）肉膏蛋白胨平板于）肉膏蛋白胨平板于37，倒置培养，倒置培养1天；查氏天；查氏琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒置于琼脂平板和高氏一号琼脂平板倒置于28培养分培养分别培
39、养别培养2448h各自计算其菌落数，观察菌落形态、各自计算其菌落数，观察菌落形态、颜色。颜色。实验步骤实验步骤 X X X X X测定空气微生物的测定空气微生物的5点采样法点采样法（4）计算每计算每m3空气中微生物的数量。空气中微生物的数量。 奥梅梁斯基曾建议：面积为奥梅梁斯基曾建议：面积为100cm2的平板的平板培养基，暴露在空气中培养基，暴露在空气中5分钟相当于分钟相当于10升空升空气中的细菌数。气中的细菌数。奥氏公式：奥氏公式：5t100A100010 NC = 根据落菌法，记录空气中微生物的种类和根据落菌法，记录空气中微生物的种类和相对数量，填写下表，推算出相对数量，填写下表，推算出1m3空气中细空气中细菌数。菌数。 空气微生物的测定结果空气微生物的测定结果观察结果与计算观察结果与计算