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1、饲料中粗蛋白质检测方法附 录 A （规范性附录）饲料中粗蛋白测定方法 GB/T 6432—1994 本标准参照采纳 ISO 59831979动物饲料氮含量的测定和粗蛋白含量计算。A.1 主要内容与适用范围 本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。本标准适用于协作饲料、浓缩饲料和单一饲料。A.2 引用标准 GB 601化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备 A.3 原理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸汲取后，再用酸滴定，测出氮含量，乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白含量。A.4 试剂 A.4
2、.1 硫酸（GB 625）：化学纯，含量为98%，无氮。A.4.2 混合催化剂：0.4g五水硫酸铜，6g硫酸钾或无水硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀。A.4.3 氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40%水溶液（ M / V ）。A.4.4 硼酸（GB 628）：化学纯，2%水溶液（ M / V ）。A.4.5 混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。A.4.6 盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定。A.4.7 0.1mol/L盐酸（HCL）标准溶液：8.3mL盐酸（GB 622），分析纯，注入1000mL蒸馏水中。A.4.8 0.2mo
3、l/L盐酸（HCL）标准溶液：1.67mL盐酸（GB 622），分析纯，注入1000mL蒸馏水中。A.4.9 蔗糖（HG 31001）：分析纯。A.4.10 硫酸铵（GB 1396）：分析纯，干燥。A.4.11 硼酸汲取液：1%硼酸水溶液1000L，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10L，0.1%甲基红乙醇溶液7L，4%氢氧化钠水溶液0.5L，混合，置阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。A.5 仪器设备 A.5.1 试验室用样品粉碎机或研钵。A.5.2 分样筛：孔径0.42mm（40目）。A.5.3 分析天平：感量0.0001g。A.5.4 消煮炉或电炉。A.5.5 滴定管：酸式（A级），10、
4、25mL。A.5.6 凯氏烧瓶：250mL。A.5.7 凯氏蒸馏装置：常量干脆蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。A.5.8 锥形瓶：150、250mL。A.5.9 容量瓶：100mL。A.5.10 消煮管：250mL。A.5.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白测定仪。A.6 试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至 200g，粉碎后全部通过 40 目筛，装于密封容器中，防止试样成分的改变。A.7 分析步骤 A.7.1 试样的消煮 称取试样 0.5g1g（含氮量 5mg80mg）精确至 0.0002g，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入 6.4g 混合催化剂与试样混合匀称，再
5、加入 12mL 硫酸和 2 粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热,起先小火，待样品焦化，泡沫消逝后，再加强火力直至呈透亮的蓝绿色，然后再接着加热，至少 2h。A.7.2 氨的蒸馏 A.7.2.1 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却，加入60L80L蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有25L硼酸汲取液和2滴混合指示剂的锥形瓶内。然后当心地向凯氏烧瓶中加入50L氢氧化钠，轻轻摇动凯氏烧瓶，使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出体积为100L。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，接着蒸馏1min2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形内，然后停止蒸馏。A.7.2.2 半微量蒸馏法 将试样消
6、煮液冷却，加入 20mL 蒸馏水，转入 100mL 容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入装有 20mL 硼酸汲取液和 2 滴混合指示剂的锥形瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指标剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。精确移取试样分解液 10mL20mL 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加 10mL 氢氧化钠溶液，当心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏 4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开汲取液面，再蒸馏 1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流
7、入锥形瓶内，然后停止蒸馏。A.7.2.3 蒸馏步骤的检验 精确称取 0.2g 硫酸铵，代替试样，按 7.2.1 或 7.2.2 步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为 21.19%±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。A.7.3 滴定 用 7.2.1 法蒸馏后的汲取液马上用 0.1mol/L 或 0.02mol/L 盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。A.8 空白测定 称取蔗糖 0.5g，代替试样，按 5 测定步骤进行空白测定，消耗 0.1mol/L 盐酸标准溶液的体积不得超过 0.2mL。消耗 0.02mol/L 盐酸标准溶液体积不得超过 0.3mL。A.
8、9 分析结果的表述A.9.1 计算见下式：式中：V 2 ——滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL； V 1 ——滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL； C ——盐酸标准溶液浓度，mol/L； m ——试样质量，g； V——试样分解液总体积，mL； V ′ ——试样分解液蒸馏用体积，mL； 0.0140——与 1.00ml 盐酸标准溶液c（HCL）=1.000mol/L相当的、以克表示的氮的质量。6.25—&m
9、dash;氮换算成蛋白质的平均系数。 3.饲料中粗蛋白的测定 1 适用范围 本方法适用于协作饲料、浓缩饲料和单一饲料中粗蛋白含量的测定。2 原理 各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如 CuSO 4 ，K 2 SO 4 或 Na 2 SO 4 或 Se 粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在肯定处理下也包括硝酸态氨）都转变成 NH 4 + 并与 H 2 SO 4 化合成（NH 4 ）2 SO 4 ，而非含氮物质，则以 CO 2↑，H 2 O↑，SO 2 ↑状态逸出。消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液汲取并与之结合成为四硼
10、酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用 HCl 标准溶液（ 0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，依据不同的饲料再乘以肯定的系数（通常用 6.25 系数计算），即为粗蛋白质的含量。其主要化学反应如下：1、2NH 4 （CH 2 ）2 COOH+13H 2 SO 4 →（NH 4 ）2SO 4 +6CO 2 +12SO 2 +16H 2 （丙氨酸）2、（NH 4 ）2SO 4+2NaOH→2NH 3 +3H 2 O+2Na 2 SO 43、4H 3 BO 3 + NH 3 →NH 4 HB 4 O 7 +5H 2 O4、NH 4 HB 4 O 7 +HCl+5H 2
11、 O→NH 4 C1+4H 3 BO 3本法不能区分蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺、铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质表示之。3 试剂 3.1 硫酸：化学纯，含量为 98%，无氮； 3.2 混合催化剂：0.4g 硫酸铜，5 个结晶水，6g 硫酸钾或硫酸钠，均为化学纯，磨碎混匀； 3.3 氢氧化钠：化学纯，40%水溶液（m/V）； 3.4 硼酸：化学纯，2%水溶液（m/V）； 3.5 混合指示剂：甲基红 0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿 0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月； 3.6. 盐酸标
12、准溶液：0.1mol/L； 3.7 蔗糖：分析纯； 3.8 硫酸铵：分析纯，干燥； 3.9 硼酸汲取液：1硼酸水溶液 1000mL，加入 0.1溴甲酚绿乙醇溶液 10mL，0.1甲基红乙醇溶液 7mL，4氢氧化钠水溶液 0.5mL，混合，置阴凉处保存期为一个月(全自动程序用)。4 仪器设备 4.1 试验室用样品粉碎机或研钵； 4.2 分样筛：孔径 0.45 mm(40 目)； 4.3 分析天平：感量 0.0001 g； 4.4 消煮炉； 4.5 滴定管：酸式，10、25 mL； 4.6 凯氏蒸馏装置：常量干脆蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式； 4.7 锥形瓶：150、250 mL； 4.8 消煮管：
13、250 mL； 4.9 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。5 分析步骤5.1 全量法 5.1.1 试样的消煮 称取试样 0.20.5g（玉米、小麦称 0.71.0g；豆粕称 0.4g；鱼粉、羽毛粉称 0.3g），精确至 0.0002g，放入消化管中，加 2 片消化片（硒粉和硫酸钾混合物，市场上有成品）或 6.4g 混合催化剂，13 ml 浓硫酸，于 420下在消化炉上消化至消化管内呈现蓝色时接着消化 40min。取出冷却后加入 30 ml 蒸馏水。5.1.2 氨的蒸馏 采纳全自动定氮仪时，按仪器本身常量程序进行测定。采纳半自动定氮仪时，将带消化液的消化管插在蒸馏装置上，
14、以 30 mL 硼酸为汲取液，加入 2 滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要浸入装有汲取液的锥形瓶内，然后向消化管中加入约 50 mL 氢氧化钠溶液至消化管内液体呈黑色，进行蒸馏。汲取液体积达到 150 mL 时，停止蒸馏，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。5.1.3 滴定 用 0.1 mol/L 的标准盐酸溶液滴定汲取液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。6 空白测定 称取蔗糖 0.5g，代替试样，进行空白测定，消耗 0.1 mol/L 盐酸标准溶液的体积不得超过 0.2 mL。7 分析结果的计算和表述 计算见下式：蛋白质（%）= 式中：V 2 滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL；V
15、 1 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL； c盐酸标准溶液浓度，mol/L； m试样质量，g 0.0140与 1.00 mL 盐酸标准液c(HCl)=1.000 mol/L相当的、以克表示的氮的质量。 6.25氮换算成蛋白质的平均系数。8 重复性当粗蛋白质含量在 25%以上时，允许相对偏差为 1%。当粗蛋白质含量在 10%25%之间时，允许相对偏差为 2%。当粗蛋白质含量在 10%以下时，允许相对偏差为 3%。9 留意事项 9.1 消化要在通风橱中进行。9.2 定氮仪不能漏气。10 结果精确度的保证和评价 10.1 结果精确度的保证 10.1.1 假如是新的可调整电炉可适当调整其温度，消化时间
16、据实际状况而定。10.1.2 每次做空白试验较正装置。10.1.3 定期做测定回收率试验 详细方法：精确称取 0.2g 硫酸铵，代替试样，用全量法氨的蒸馏中的步骤进行操作，测得硫酸铵含氮量为 21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。10.1.4 蒸馏后的液体不能放置太长时间，要刚好滴定。10.1.5 消化温度应限制在 400420内。消化器控温器应良好，电阻丝应运用专用配套电阻丝，拉伸应匀称，使炉内温度匀称。10.1.6 蒸馏完毕应先取下接受瓶，然后在关闭电源，以免酸液倒流。10.2 精确度的评价 10.2.1 测定回收率 10.2.1.1 加硫酸铵检测回
17、收率，假如合格，说明蒸馏装置不漏气和盐酸标准溶液溶液标定正确。详细方法见 10.1.3 定期测回收率试验。10.2.1.2 用已知含氮量的样品标准物（如含氮量在 1.30%1.40%之间的玉米粉）用半微量法或举荐法测定其含氮量，和标准物质含氮量进行比对，要求测定结果在要求范围之内。此方法可以评价整个过程的精确度。10.2.2 试验室比对 和国家认证的试验进行同样品试验数据比对。此方法可以评价整个过程的精确度。分公司对饲料中粗蛋白数据可疑样品应送集团质检中心复测。本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第11页 共11页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页