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1、DNA及基于DNA链替换反应的分子计算肖石燕梁好均DNA and DNA computation based on toehold-mediated strand-displacement reactionsXiao Shi-Yan Liang Hao-Jun引用信息Citation: Acta Physica Sinica , 65, 178106 (2016) DOI: 10.7498/aps.65.178106在线阅读View online: http:/dx.doi.org/10.7498/aps.65.178106当期内容View table of contents: http:/
2、you may be interested in基于虚拟开车环境的自闭症儿童脑电样本熵Sample entropy of electroencephalogram for children with autism based on virtual driving game物理学报.2016, 65(10): 108701 http:/dx.doi.org/10.7498/aps.65.108701基于频率切片小波变换和支持向量机的癫痫脑电信号自动检测Automatic seizure detection of electroencephalogram signals based on freq
3、uency slice wavelet transformand SVM物理学报.2016, 65(3): 038703 http:/dx.doi.org/10.7498/aps.65.038703基于AdaBoost算法的癫痫脑电信号识别Recognition of epilepsy electroencephalography based on AdaBoost algorithm物理学报.2015, 64(12): 128701 http:/dx.doi.org/10.7498/aps.64.128701基于自适应模板法的脑电信号转移熵分析Transfer entropy analysi
4、s of electroencephalogram based on adaptive template method物理学报.2015, 64(8): 088701 http:/dx.doi.org/10.7498/aps.64.088701改进的相对转移熵的癫痫脑电分析Analysis on relative transfer of entropy based on improved epileptic EEG物理学报.2014, 63(21): 218701 http:/dx.doi.org/10.7498/aps.63.218701物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65
5、, No. 17 (2016) 178106专题:软物质研究进展DNA及基于DNA链替换反应的分子计算 肖石燕1)梁好均1)2)y1)(中国科学院软物质化学重点实验室,能源材料化学协同创新中心,中国科学技术大学高分子科学与工程系,合肥230026)2)(合肥微尺度物质科学国家实验室,合肥230026)(2016年5月26日收到; 2016年6月15日收到修改稿)DNA是生物遗传信息的载体,同时也是一种理想的生物相容材料.单链黏性末端(toehold)协助的链替换反应是DNA常温纳米技术的基础.利用DNA的碱基互补特性和碱基序列的可编程性,人们可以基于DNA链替换反应构建分子机器并对其运转进行精
6、确调控,实现各种复杂分子计算.本文回顾了近年来DNA结构和力学性质方面的研究进展,探讨DNA链替换反应的微观理解,介绍DNA分子计算领域的最新成果,以及它在DNA恒温自组装等方面的应用.关键词: DNA力学性质,链替换反应,分子计算,自组装PACS: 81.16.Fg, 87.85.d, 87.10.Tf, 87.14.gk DOI: 10.7498/aps.65.1781061引言脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)是生物遗传信息的载体,它是由腺嘌呤(adenine,A)、胸腺嘧啶(thymine, T)、胞嘧啶(cytosine, C)、鸟嘌呤(guanin
7、e, G)四种碱基通过氢键互补配对,以脱氧核糖(五碳糖)为骨架形成的双螺旋生物大分子(图1).这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成.DNA的骨架由脱氧核糖和磷酸基团通过磷酸二酯键相连构成并排列在外侧,配对的碱基则通过 作用堆叠在分子内部.目前,人们对DNA结构的认识主要基于X射线晶体衍射数据. B-DNA通常被认为是生理环境中存在的最普遍的DNA构型.标准B-DNA的横截面宽度为2 nm,一个螺旋周期为3.4 nm,包含10.5个碱基对;两条反平行单链形成两个沟槽:大沟宽度约2.2 nm,小沟宽度约1.2 nm.与离子等其他分子作用时,大小沟槽的结合位点和结
8、合强度存在显著的差异.与DNA作用的特异性蛋白,可以通过大小沟槽与特定序列的DNA片段结合,从而完成相应的生理功能.除B-DNA外, A-DNA和Z-DNA是另外两种较为常见的构型.显然, DNA具有精细的内部结构.同时,作为一种生物大分子,长链DNA又是一种高分子.当DNA链长超过1000个碱基对(bp)时,人们采用蠕虫链模型(worm-like chain, WLC)来描述DNA1.正常生理条件下, DNA持久长度的测量值约为50 nm,即150 bp的长度.当DNA足够长,我们可以忽略碱基序列,而视其为结构均一的大分子;不过在真实的生理条件中, DNA生物功能的完成往往与其短链尺度上的结
9、构和柔顺性相关.这对DNA物理性质的描述提出了挑战,因此,我们需要谨慎考虑WLC模型在这个尺度上是否适用.研究DNA的物理性质,不仅可以加深我们对DNA认识,同时也为其在生物化学领域中的应用打下基础.DNA的碱基互补特性,使其功能不只局限于作为遗传物质,同时也是一种理想的生物相容材料.在DNA双链上保留一定长度的单链结合位国家自然科学基金(批准号: 91427304, 21434007, 21574122, 51573175, 21404098)和国家重点基础研究发展计划(批准号:2012CB821500)资助资助课题.通信作者. E-mail: 2016中国物理学会Chinese Phys
10、ical Society http:/178106-1物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106点(toehold端,即黏性末端),即可以与具有互补端的DNA双链相结合,从而启动分支迁移反应.基于DNA碱基互补配对特性, Seeman于1982年提出将经特殊设计的DNA序列通过自组装构建纳米器件2,为复杂DNA纳米器件的设计和构造提供了思路.经过数十年的努力,人们已经可以构建各种复杂的纳米结构,为DNA纳米器件的进一步应用打下了基础.与此同时, Mirkin等将具有黏性末端的DNA接枝到金纳米粒子表面3;4,并通过连接链(linker)将
11、两种不同的金纳米粒子连接在一起,从而实现DNA修饰的金纳米粒子的聚集反应.最近几年,人们基于这种方法构造了金纳米粒子的三维有序结构,取得可控有序组装的突破5.图1碱基、核苷酸、单链和双链DNA结构图6Fig. 1. Chemical model of DNA6.早期的DNA纳米器件构造是将长、短链DNA严格退火实现的.在细胞生理环境中,生物大分子是在恒温条件下组装形成纳米器件,完成生物功能,并能针对细胞或者外部环境调整其组装过程和组装结构.鉴于恒温DNA纳米技术在生物医学和生物纳米材料领域中的重要意义,近年来, DNA在特定环境中的恒温自组装受到了广泛的关注.DNA恒温自组装的基础是toeho
12、ld调控的链替换反应. Toehold在反应中的作用是为DNA链分支迁移反应提供立足点. Toehold协助的链替换反应使人们能够在恒温条件下构建DNA分子机器和复杂DNA反应网络,从而实现特定的计算功能.在本文中,我们回顾了DNA物理性质、DNA链替换反应以及DNA分子计算等方面的发展历程,介绍了本领域的重要研究方向和主要问题,并探讨未来的可能发展趋势.2 DNA的结构和力学性质2.1 DNA的结构和力学性质长度只有十几至几十个碱基对的DNA,其自身构象的柔顺性和构象转变,以及DNA和蛋白质相互作用是核小体内DNA-组蛋白作用的关键.因此, DNA自身结构和构象转变受到了科学家们的广泛关注6
13、.近年来Olson和Zhurkin7和Orozco等8采用全原子分子动力学(MD)方法对溶液环境中DNA弯曲和构象转变做了大量的研究工作.尤其需要提到的是,北京大学孙育杰、苏晓东和哈佛大学谢晓亮等通过单分子全内反射荧光显微镜实验表明两个不同的DNA结合蛋白可以影响各自对DNA的结合能力,而且其变化随着两个蛋白之间DNA链的长度同时增强或变弱,呈现周期性变化,这个周期大约是10个碱基对,正好是DNA的一个双螺旋周期,并且这种效应的大小会随着两个蛋白之间的距离增加而衰减.他们证明这种效应是由蛋白质结合到DNA上导致的DNA双螺旋的构象变化即DNA的别构效应引起的9. Yin等10通过实验结合理论研
14、究了双链DNA错配碱基打开闭合的过程,并发现其打开的时间寿命为10 ms.这些研究工作大大加深了我们对DNA结构和构象转变的认识.描述DNA长链特征最重要的参量是持久长度.细胞环境中带正电的金属离子,比如Na+,Mg2+, Ca2+等,会在DNA分子周围形成致密的反离子层.鉴于离子环境对DNA刚性的重要影响,不同离子环境和离子浓度中DNA的持久长度是人178106-2物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106们关注的重要问题.通过光散射11 13、流动双折射14;15、光镊16等手段,人们发现当NaCl浓度小于生理浓度(约0.1 M)时,
15、随着浓度的降低(到约1.0 mM), DNA持久长度从50 nm左右增加到100 nm左右,各种研究方法测量得到的持久长度和离子强度的关联性都比较一致.当离子浓度较高,尤其是当离子浓度高于0.1 M NaCl时,部分实验数据表明离子浓度的增加对DNA持久长度影响非常微弱17 19;而另外一些结果11 15;17则表明在大约1.0 M NaCl浓度中, DNA持久长度降低到30 nm左右.前面的实验结果与Odijk, Skolnick和Fixman(OSF)的理论20;21一致,即当一价离子浓度高于0.05 M左右时, DNA持久长度与离子浓度关联极为微弱.而后面的实验数据很好地符合了Manni
16、ng的理论预测22.不论在实验和理论上,DNA持久长度在高离子浓度下的分歧暴露出人们对DNA物理性质理解的不足:静电排斥作用和碱基对之间的 堆叠作用是如何决定DNA刚性.在OSF理论中,认为DNA骨架的静电排斥作用会因为环境中的离子屏蔽而被减弱,因此, DNA刚性主要由碱基对间的 作用决定,静电作用在其中的贡献很小. Manning的理论则正好相反,通过计算中性DNA “null isomer”模型的持久长度,他提出在生理环境下, 堆叠作用仅仅贡献DNA整体持久长度的约14%.人们也尝试从实验上去回答这个问题,但是很遗憾,实验结果进一步加大了人们在这个问题上的分歧.此外,人们尝试采用多尺度分子
17、动力学模拟(见图2)研究了DNA刚性的来源. Manning的DNA “null isomer”模型为人们理解DNA刚性提供了很好的研究思路,即通过DNA中性化模型分离静电作用,从而有针对性地研究静电排斥作用对DNA结构和力学性质的影响. 2002年, Olson和Manning23通过12个碱基对长度的全原子分子动力学模拟发现,如果将双链DNA一侧的六个磷酸基团电荷减少,会导致DNA自发弯向中性一侧(弯曲角度达到711).同时发现,甲基磷酸基团将会显著地影响DNA的大小沟结构. 2008年美国密苏里大学Tan和Chen采用“tightly bound ion”理论研究了离子-DNA作用对DN
18、A弯曲的影响24.他们发现DNA弯曲能和弯曲取向与金属离子的价态、离子半径和浓度密切相关. 2014年,中国科学技术大学梁好均课题组25采用全原子动力学模拟,发现DNA中性化对DNA构象柔顺性的影响具有序列依赖性.武汉大学谭志杰课题组26 28研究了一价和多价金属离子对单链核酸结构和持久长度的影响,发现离子价态对链塌缩的显著影响;并通过全原子分子动力学和Monte Carlo方法研究发现6个碱基长度的短链DNA有显著的弯曲和拉伸柔顺性. 2011年,来自美国北卡大学教堂山分校的Savelyev和马里兰大学Papoian采用分子重整化群粗粒化方法(MRG-CG)建立了DNA的粗粒化模型29,通过
19、分子动力学模拟计算正常DNA和中性DNA分子的持久长度,他们声称正常DNA和中性DNA的持久长度相差约17 nm,即静电作用对持久长度的贡献约为35%30.这个研究结论与OSF和Manning的理论预测都存在较大的差异.鉴于粗粒化DNA模型对DNA分子结构细节的忽略,尤其是对DNA序列差异性描述不够充分31,采用全原子方法在更长的时间尺度和更大的空间尺度上对这个问题进行研究依然非常必要.S V图2多尺度DNA分子模拟方法6Fig. 2. Nucleic acid systems that represent the range of scales amenable to various com
20、putational andtheoretical methods6.178106-3物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106(a)(b)Donor Acceptort =0 minDonor Acceptort=20 minCy3kloopingkunloopingCy5NeutravidinBiotinPEGL Rt t10 nm 012840(c) (d)1.00.5WLCWLC, simulated-InG(; 5 nm)Bend angle /rad1.5图3 (a)使用生物素将被能量共振转移供体(Cy3)和受体(Cy5)分子
21、修饰的DNA分子连接在表面上;实验初始时,处于缓冲液中的系统没有金属离子存在以保证DNA处于打开状态,即(b)左图;然后加入浓度为1 M的NaCl溶液, (b)右图为20 min时的供体和受体荧光图;比例尺为5 mm; (c) DNA的原子力显微镜(AFM)高清扫描图; (d) DNA弯曲角度与其概率分布对数取负做图,红点为实验结果,虚线为WLC理论结果,黑色实线为WLC模型对应的模拟原子力显微镜(AFM)结果; (a)和(b)为Vafabakhsh和Ha的实验结果46, (c)和(d)为Wiggins等的实验结果44Fig. 3. (a) DNA molecules labeled usin
22、g Donor (Cy3) and acceptor (Cy5) were immobilized on the surface viabiotin-neutravidin interaction; (b) uorescence images representing donor and acceptor channels are shown before(left panels) and 20 min after adding high salt (1 M NaCl) buer (right panels), scale bar, 5 mm; (c) high-resolutionAFM i
23、mages of DNA chain; (d) negative logarithm of the observed probability distribution function. (a) and (b) arethe experimental results taken from the studies of Vafabakhs and Ha46, (c) and (d) are the experimental studiesperformed by Wiggins et al. 44.2.2短链DNA刚性及其理论模型从高分子物理的角度,对由N个长度为l0的链段组成的大分子, Kra
24、tky-Prorod (KP)模型32认为其能量可以用EKP = Bl0N 1i=1(1 ti ti+1)= Bl0N 1i=1(1 cos i)表示,其中B = lPkBT为弹性模量, ti为第i个链段的取向, lp为持久长度, kB为玻尔兹曼常数, T为温度, i为相邻链段夹角.如果l0 ! 0, N ! 1,且DNA线长度为L = Nl0,则有EWLC = B2 L0(dt/ds)2ds:WLC模型虽然没有考虑DNA的复杂结构,却很好地描述了长链DNA分子的性质.但是, WLC模型能否适用于长度小于100 bp的DNA链段,最近引起了人们的关注和争议33;34. 2005年前后, Clo
25、utier和Widom35;36在长约100 bp的双链DNA片段成环反应实验研究中发现,其首尾相连成环的速率是WLC模型预测值的35倍.为了解释这个出乎意料的现象,人们开始寻找可能的理论178106-4物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106和实验证据.人们首先研究DNA纽结(kink)结构在其中的可能作用.早在1975年, Crick和Klug37就提出,短链DNA成环时, DNA的弯曲并不是均匀的,而可能发生kink从而大大降低成环能;而后在核小体的晶体结构中也确认了kink结构的存在38 40.因此人们尝试在理论上引入kink从
26、而解释短链DNA的柔顺性.他们建议,如果在DNA链段碱基堆叠强度较弱的部分,碱基对在保持配对的情况下以一定的可能性发生kink41,局部单链(bubble)42或者碱基对发生破缺而打开(open-ing)43,从而导致短链DNA表现出更强的柔性.在WLC模型中, DNA链段之间的弹性能是基于弹簧势,即EWLC = 12kBT(lP/l) 2i:Wiggins等44提出更柔的势能函数,即ELSEC( ) = j jkBT,来描述DNA链段之间的弯曲,并建立了LSEC模型.其中 为调控参数,如果链段长度设为l = 2:5 nm,则 = 6:8. 2014年, Cao等45将WLC模型推广至C-WL
27、C模型以期望描述DNA在短链尺度上的柔性.WLC模型是否适用于短链DNA的争论依然在继续. Wiggins等44采用AFM研究短链DNA弯曲的实验数据表明, DNA自发大角度弯曲远超WLC的预测(图3(b). 2012年, Vafabakhsh和Ha46将长度小于100 bp的DNA短链中部固定在芯片表面上,然后使用单分子荧光共振能量转移(smFRET)研究其成环的速率.研究结果再一次证明了DNA在短链尺度上不同寻常的柔性46(图3(a).同时,也有学者尝试通过实验证明WLC模型在描述短链DNA柔顺性的可行性.Du等47尝试从技术角度否认Cloutier和Widom的短链DNA成环实验结论.
28、Mastroianni等48通过大量的X-射线小角散射实验以期望证明WLC模型在短链尺度上同样适用,并宣称其结果证明WLC模型可以描述链长为1/3lp到2/3lp的DNA的构象涨落. 2007年, Mazur 49采用MD模拟计算了短链DNA自发弯曲角度分布,宣称短链DNA的模拟数据是完全支持WLC模型的,而不支持Wiggins等关于短链DNA的AFM实验数据44以及为解释AFM数据提出的SEC模型41.但作者同时也表示, DNA分子力场有可能导致数据不够准确49. 2014年, Mazur 50采用AFM测量了长度短至1个螺旋周期的DNA弯曲, AFM数据表明WLC模型完全适用于长度大于3个
29、螺旋周期(即10.5 nm)的DNA.3 DNA链替换反应3.1 DNA链替换反应的基本原理单链DNA通过碱基互补配对形成双链DNA分子.利用DNA链间这种特殊的相互作用, DNA在生物体内能够有效进行遗传信息的储存和复制51.同时作为一种生物相容材料,由于其精确的碱基互补配对、可预测和热可逆碱基相互作用、相对简单的化学合成和修饰以及序列可编程等特性,DNA分子被广泛地用于DNA纳米结构和纳米器件的构建、生物传感、药物输送等.基于DNA碱基互补配对的特异性, Seeman 2于1982年提出将经特定设计的DNA序列通过自组装构建纳米器件.基于这种想法,人们通过合理设计,将长短链DNA严格退火,
30、从而构建一维、二维52;53和三维复杂纳米结构和纳米器件54 58.在细胞生理环境中,生物大分子是在恒温条件下组装形成纳米器件,并能针对细胞或者外部环境调整其组装过程和组装结构.鉴于恒温DNA纳米技术在生物医学和生物纳米材料领域中的重要意义,近年来, DNA在特定环境中的恒温自组装受到了广泛的关注59;60.DNA恒温自组装的基础是toehold调控的链替换反应61. toehold调控的链替换反应的具体过程如图4.图4(a)是双链DNA图示方法;图4(b)是toe-hold协助的DNA分支迁移和链替换过程图. Toe-hold协助的链替换反应类似于化学反应中的置换反应,反应物为具有toeho
31、ld黏性末端t 的t -x 链与链x组成的双链复合物complex-1和单链t-x.具体反应过程为:单链t-x作为侵入链(in-vading strand),其toehold黏性末端t与complex-1的t 结合;然后,启动侵入链的x链段分支迁移反应逐步替换complex-1的结合链x;最终的生成物为t-x与t -x 结合形成的新复合结构complex-2以及单链x. Toehold在反应中的作用是为DNA链分支迁移反应提供立足点从而促进反应顺利进行.因此, toehold端的长度在一定程度上决定了DNA链替换反应速率.随着toehold长度增178106-5物理学报Acta Phys. S
32、in. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106长,反应速率加快;当toehold端达到6个碱基时,溶液DNA链替换反应速率达到极大值.通过改变toehold长度和序列,反应速率的差异可以达到106倍.为了更有效地调控DNA链替换反应, 2009年,美国加州理工学院的Zhang和Winfree62引入了toehold exchange反应方案.它的具体反应方案如图5.(a)(b)ToeholdInvading strandComplex 1 Complex 2t x xxxt图4 (a) DNA双链结构表示法; (b) toehold协助的链替换反应过程图Fig. 4. (a
33、) Graphical representation of double strand DNA with a toehold; (b) the process of toehold-mediated strand displacement.SS YXmnImn JmnLmn图5 Toehold exchange反应原理示意图Fig. 5. The principle of DNA toehold exchange reaction.图5是toehold exchange反应原理示意图.Toehold exchange反应与图4所示的链替换反应方案的差异在于侵入链X在完全结合复合链S后,原来与S
34、结合的Y链还有一部分链段( m)结合在S上,但因 m序列较短,序列间结合强度较小,在环境热扰动下会自动脱落.相比于单纯的toehold协助的链替换反应, toehold exchange反应有两个很明显的优势: 1) toehold exchange反应会在产物L(m;n)上产生新的toehold黏性末端 m,作为下一步链替换反应的toehold,从而为复杂反应网络的构建提供可能; 2) toehold exchange方案弱化了链替换反应动力学与热力学之间的关联.对图4中的反应,反应动力学与热力学之间有很强的关联,即侵入链toehold末端结合能越强,反应越快.但是在toehold exch
35、ange反应中,同时增强暴露和隐藏的toehold端(分别为 n和 m)的结合强度可以加速正逆反应的速率,但是整体反应的热力学趋势却变化很小.这就为DNA链替换反应网络和自组装反应过程调控提供了更多的方式.为定量地描述toehold exchange反应, Zhang和Winfree建立了链替换反应的三步反应模型,在稳态假设基础上,推导得到了toehold exchange双分子反应(BM)模型的反应速率:k( m; m; n)kr( m)kfkbkr( n)kr( m) + kr( n)kb + kr( m)kb:但是这个速率常数公式与实际实验测量值之间有比较大的差异.这是因为, 1) BM
36、反应模型中并没有考虑到toehold exchange反应存在中间态;2)模型要求反应物X(m;n)和S的浓度必须足够小,即C Ccrit = 0:1kfkr( n)kr( m) + kr( n)kb + kr( m)kbkr( m) + kb:上式中的各参数为toehold exchange反应各步骤的反应常数,具体可见图5,其中kf1 = kf2 = kf.178106-6物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 1781063.2 DNA链替换反应的微观理解和速率调控DNA链替换反应是DNA常温组装技术的基础,并已经被大量应用于DNA纳米器件的
37、构建61.但是,目前人们对DNA链替换反应的微观物理机理缺乏了解,并难以精确调控其反应速率63.DNA链替换反应速率的精确调控是复杂反应网络设计和广泛应用的基础和关键64. DNA的结构和功能与溶液环境密切相关.在考虑温度效应下,溶剂-DNA相互作用对DNA分子结构和杂交的影响,以及溶剂分子在DNA结合和链替换过程中的参与机理尚未得到深入研究.通常,人们认为DNA链替换反应的分支迁移过程是一个随机的无规行走.研究表明, DNA链替换反应的分支迁移过程的每一步行走都要跨越一定的能垒Gs,并具有序列相关性63;而不是通常人们所设想的随机无规行走.但到目前为止,在理论和实验上都没有获得精确的Gs数值
38、.在反应速率调控方面,牛津大学Turbereld等65在toehold和分支迁移链段之间引入空白链段(spacer)以及在分支迁移链段引入错配66的方式来调节DNA链替换反应速率.加拿大滑铁卢大学Liu等67;68通过在溶液中加入醇类等有机小分子来调节DNA beacon的杂交速率.他们发现,有机小分子使DNA熔融温度Tm下降,同时加快DNA杂交过程.华中科技大学夏帆等发现醇类可以促进DNA的链替换反应69.当把DNA接枝到芯片表面时,可以通过控制芯片表面DNA的接枝密度、表面曲率、调节DNA自身链长度、溶液pH值和离子浓度等方式调控DNA链替换反应速率70.另一方面,科学家们尝试通过理论和模
39、拟的手段研究DNA链替换反应的微观机理. Zhang和Win-free62以及Yurke和Mills71对DNA链替换反应过程速率的早期讨论并未涉及反应的微观机理,Srinivas和Winfree于2013年提出了IEL模型(in-tuitive energy landscape model),以期望从最基本的DNA结合能数据计算得到DNA链替换反应速率63. DNA链替换反应速率的理论计算依赖于人们对DNA结合能的准确计算.目前,人们最常用的DNA结构预测和结合能计算软件是NUPACK72.除此之外, SantaLucia等在2000年和2004年针对不同相邻序列结合能、发卡结构、错配以及环
40、状(loop) DNA结构等情况提出了完整的热力学参数73;74. Pyshyi和Ivanova75以及Protozanova等76分别对碱基堆叠作用能和双链DNA中间单链断裂位点(nick site)提出了自己的解决方案.DNA粗粒化模型的发展77也为人们研究DNA杂化过程的微观机理提供了可能. 2009年,de Pablo等采用3SPN模型78;79研究DNA杂化过程发现,双链的杂化过程与DNA碱基序列相关80.对重复序列DNA链,只要有连续四个碱基发生配对,就可以通过“slithering”机理完成杂化;对随机序列DNA链,杂化过程遵循更为严格的机理,两条互补单链要么完全配对,要么以单链
41、存在,即两条单链DNA某片段碰撞结合从而使整个DNA链段迅速完成杂化.采用相同的模型,天津大学何学浩课题组研究了受限条件下双链DNA的螺旋解开和恢复的过程,他们发现受限越强,熔融温度越高81. 2013年, Ouldridge等采用oxDNA82;83讨论了DNA杂化动力学过程84.他们发现,两条单链DNA的部分互补碱基随机结合配对之后,通过“拉链”(zippering)方式完成其他部分杂化.杂化反应的启动需要23个碱基完成互补配对以抵抗热力学扰动.模拟结果揭示,如果初始结合位点不在双链完全结合时的对应位置, DNA将通过“pseu-doknot”和“inchworm” internal di
42、splacement两种方式最终实现双链完全互补.模拟结果同时解释了DNA杂化速率的序列差异.基于oxDNA模型,人们研究了DNA发卡的形成85, DNA镊子83,四臂DNA的形成86以及其他DNA分子机器的运行机理87.4 DNA分子计算和DNA恒温自组装4.1 DNA计算和复杂反应网络的设计和实现DNA具有绝大多数生物分子所不具备的碱基互补特性和序列可设计性,使其可以被用来设计各种复杂的分子机器和反应网络以实现特定的功能,比如信号放大和DNA计算等,从而为“智能”药物设计提供一种可能的解决方案. DNA计算最早由美国南加州大学Adleman教授提出,他于1994年利用DNA计算方法解决了著
43、名的数学难题“七顶点哈密尔顿路径”88.借助于限制性内切和连接酶89;90,或者DNA发卡结构91 93等,178106-7物理学报Acta Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106人们成功构建了类似于电子计算机的逻辑运算元件. 2000年, Yurke等61提出了toehold引导的DNA链替换反应.他们采用三条链,构建了DNA镊子,利用链替换反应并在燃料链的驱动下,使镊子“闭合”和“打开”,成功实现了DNA分子机器的运行.加州理工学院的Zhang等94基于toeholdexchange反应建立了第一个DNA催化反应体系.2006年, Seelig等9
44、5基于链替换反应构建了OR,AND和NOT逻辑门,并实现了信号放大和反馈,Seelig等的工作表明了采用DNA构建大型逻辑运算模块的可能性. 2007年, Zhang等94基于链替换反应构建了分子机器反应网络. 2011年, Qian和Winfree96采用可逆链替换反应设计了一种新的逻辑门,可以压制信号从而过滤噪音.在此基础上,他们采用130条DNA链构建了极为复杂的逻辑电路并实现了四位二进制数的开方运算.同年,他们利用DNA实现了神经网络计算97.该研究组还利用DNA反应设计了模拟生物化学体系的转录振荡系统98;并在理论上论证了DNA模拟复杂化学反应网络的可能性64. 2015年,湖南大学
45、和美国弗罗里达大学谭蔚泓课题组借助于酶和DNA分子机器模拟了生物体适应性免疫反应过程99.DNA序列的可编程性使人们可以利用DNA链替换反应设计基元反应,并作为程序语句用于构建复杂反应网络(类似于“程序”)实现特定的功能. 2010年, Soloveichik等64从理论上论证了利用DNA构建化学基元反应的可能性(图6(b).2013年, Chen等100基于DNA链替换反应,设计了A + B ! C, A + B ! C + B, A + B ! C + 2B等基元反应,并在此基础上设计并实现了由三个基=ABB*A*(a)(b)Catalyst CProduct DDNA tile=1 mS
46、ubstrate SFuel FIntermediate By-productBy-product0510Time/hD/nM20, 10 and 10 nM1 2 30F, S, C20, 10 and 3 nM20, 10 and 1 nM20, 10 and 0 nM_Buffering moduleTime/hConcentration/nMUnscaled1.5115T105 /M/s1/300 /s1/300 /sScaled0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.55101520Ideal chemical reactions DNA reaction modul
47、es Simulation of ideal and DNA reactionsIdeal DNA图6 (a) DNA tile组装原理图60,在这个体系中,通过循环放大反应释放大量产物链D,参与体系组装; (b)采用DNA实现Lotka-Volterra化学震荡的理论模型64Fig. 6. (a) Structural and dynamic DNA nanotechnology60; (b) Lotka-Volterra chemical oscillator designed usingDNA strand displacement reactions64.178106-8物理学报Act
48、a Phys. Sin. Vol. 65, No. 17 (2016) 178106元反应构成的反应串联.目前,虽然Winfree等64从理论上论证了采用DNA链替换反应构建Lotka-Volterra等化学震荡反应的可行性,但是最终在实验上实现依然存在极大的挑战.另一方面,人们也尝试采用计算机模拟的方法来推动和协助DNA反应网络的设计.比如Phillips发布了DSD程序包,可以通过求解ODE方程的方法和蒙特卡罗方法模拟基于DNA设计的电路逻辑门,以及其他多种DNA复杂反应101;102. DNA反应网络的设计和成功构建依赖于DNA链替换反应速率的设置.但是,人们目前无法直接从碱基对的配对和堆叠作用等最基本热力学参数推导得到DNA链替换反应速率.因此, DNA反应网络的理论设计一直是受到人们的关注并亟需得到解决的重要问题.基于DNA链替换反应的一个重要问题是泄露(Leak).由于DNA纯度和常温下的热力学扰动等原因, DNA复合双链可能在没有催化链存在的条件下即与环境中的互补链直接发生替换反应,取代初始配对