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1、玉米19,kD醇溶蛋白启动子克隆与植物表达载体构建 摘要：从玉米自交系基因组中克隆了玉米19 kD醇溶蛋白基因启动子，将其连接到载体上。测序结果表明该序列与已报道序列同源性为，包含、启动子基本元件以及、 、 等参加调整玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式元件。将克隆的启动子取代质粒中的 启动子，胜利构建了由启动子驱动报告基因的植物表达载体。利用土壤杆菌介导法将构建好的重组质粒转入烟草中，为进一步探讨该启动子组织特异性表达奠定了基础。 关键词：启动子；土壤杆菌介导法；植物表达载体 中图分类号：文献标识码：文章编号：0439114132775-05 ， ， ， ， ， ： ， gy ， ， ， ， s ，
2、 ， ， ， p； ， was laid ： ； ； 随着植物基因工程的不断完善，人们须要目的基因精确高效地在受体植物特定部位表达，但组成型启动子使基因表达分散而造成目标部位表达量不足，难以满意要求，因此克隆专一的组织特异性启动子成为目前植物基因工程探讨的重点。玉米醇溶蛋白是玉米种子贮藏蛋白的主要成分，占总蛋白的。依据醇溶蛋白一级结构的相像性可分为、 种，其中醇溶蛋白由个基因组成的基因家族编码，包括 和 的醇溶蛋白。由于玉米醇溶蛋白基因的表达具有严格的时空特异性，在种子发育过程中，其表达严格限定在胚乳组织中，一般授粉后 起先表达，因此本试验从玉米基因组中克隆了 醇溶蛋白基因的启动子序列，对其结
3、构和功能进行分析，以期构建种子特异性启动子，为玉米种子生物反应器的探讨奠定基础。 材料与方法 材料和试剂 玉米自交系、烟草均来自山东省农业科学院高新技术中心。大肠杆菌、土壤杆菌、植物表达载体均由山东省科学院中日友好生物技术探讨中心保存，克隆载体、各种限制性内切酶和 连接酶购自kr公司，其他化学试剂为国产分析纯，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 启动子的扩增与克隆 以玉米自交系品种幼苗为材料，利用法提取玉米基因组。依据等发表的启动子序列，设计一对特异引物： ；： 。以玉米基因组为模板，扩增该基因起始密码子上游约 的调控序列。体系为 ，包括 ， ， ， s ，基因组模板 ，酶 ， 。反
4、应程序为： 预变性， ； 变性 ， 退火 ， 延长 ，个循环； 延长 。 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分别纯化后，与克隆载体在 连接酶作用下 保温过夜，构建重组质粒。将连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，经、酶切鉴定后，将阳性转化子送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并保存菌种。 融合表达载体的构建 将重组质粒和分别用 和 进行双酶切，在 连接酶作用下， 连接反应过夜，连接反应产物转化大肠杆菌OP感受态细胞，利用及酶切方法筛选阳性转化子，并进行测序鉴定，得到植物表达载体 ，表达载体构建过程如图所示。 土壤杆菌介导的烟草转化 采纳液氮冻融法将重组植物表达载体 转入土壤杆菌中，采纳碱裂解
5、法提取重组土壤杆菌的质粒，鉴定转化子。表达载体p 中基因上游含有 启动子，因此将其转入土壤杆菌，作为分析启动子活性时的阳性比照，设计部分基因的引物对其进行鉴定。 挑取土壤杆菌阳性重组子于含抗生素的 液体培育基中， 过夜培育，转接到 培育基中， 接着培育至为左右，用刀片将烟草无菌苗叶片边缘部分切去并弃中脉，切成约 大小作为土壤杆菌侵染外植体，在土壤杆菌菌液中侵染 ，其间不断摇动，侵染后的外植体用无菌滤纸吸干菌液置于分化培育基上， 暗培育 ，转入筛选分化培育基中。 光照培育约周后，将烟草愈伤组织及部分抗性芽转入簇新培育基中继代培育，待抗性芽长至 左右切下转入生根培育基中。待根系发育良好进行室内移栽
6、，随机选取株长势良好的植株提取其叶片总，和琼脂糖凝胶电泳检测其是否含有启动子，并设立阴性比照、阳性比照。 结果与分析 启动子的扩增、克隆和序列分析 以玉米自交系基因组为模板，依据所设计的引物进行扩增，可特异地扩增到约 的条带，与目的片段大小一样。将启动子纯化产物连接到上得到重组质粒，进行 和 双酶切鉴定，可切出大小约 的条带，与启动子片段大小一样，证明 产物已连接到，将重组质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 测序结果表明得到的启动子长度为 ，与报道序列同源性为，其末端紧邻该基因起始密码子，与报道序列相比缺失了 ，缺失序列位于启动子的可变区，不属于保守序列，不同玉米品系之间均有差异；
7、另外整个序列有个碱基发生了变更，包括个碱基的突变和个碱基的插入或缺失。采纳 启动子数据库进行功能预料，结果表明该序列存在处核心启动子区域，并且得分较高，初步推断此克隆序列具有启动子结构。 为了分析序列差异是否发生在启动子功能元件和重要调控区域，通过和数据库对启动子进行顺式调控元件分析。发觉该序列含有 和 启动子核心元件，属于典型启动子。该启动子序列中还具有胚乳表达特异性元件，如、 、 等参加调整玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式元件。序列分析结果表明，在 和 以及启动子调整基因特异表达的调控区域没有发生碱基的改变。此外，该序列中还发觉了调整植物生长发育的一些应激元件，例如光反应元件、；抗氧化元件；抗
8、逆反应顺式作用元件、；代谢调控元件等顺式元件，这些元件可能在植物的生长发育和器官发育中起重要作用。 含启动子的植物表达载体 构建的植物表达载体经扩增得到片段大小约为 的产物，通过 与 双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，也得到大小约为 的启动子片段，与预期结果相符。表明启动子已插入到表达载体中，测序结果也显示重组表达载体已构建胜利。 将重组载体与阳性比照质粒通过冻融法转化土壤杆菌，鉴定转化子。结果表明，在转重组质粒的土壤杆菌中扩增到了约 的片段，说明已经胜利转化土壤杆菌；而在转质粒的土壤杆菌中扩增到了约 的片段，表明也已经胜利转化土壤杆菌。 转基因烟草的获得 烟草叶盘经土壤杆菌侵染周后，外殖体快速生长
9、，四周已经起先形成愈伤组织；而没有经土壤杆菌侵染的阴性比照，在含相同浓度卡那霉素的筛选培育基上叶盘没有长大，叶盘四周也没有愈伤组织形成。 连续继代培育周以后，外殖体分化出大量的愈伤组织及抗性芽，结果表明，筛选分化培育基中抗生素和生长素的浓度及其配比可以满意烟草叶盘选择分化的须要。将抗性芽转入生根培育基中，一个月后根系发达，可以进行室内移栽。 随机选取株生长良好的植株提取其叶片总，以基因组为模板利用启动子的特异引物进行扩增，经检测株转的烟草抗性苗有株是阳性植株，转化率达到，而阴性比照没有扩增到条带。 探讨 玉米醇溶蛋白的表达具有严格的组织特异性，被严格限定在种子胚乳中，是探讨组织特异性启动子的良
10、好材料。依据 玉米醇溶蛋白启动子保守序列，设计特异引物从玉米自交系中扩增启动子片段，扩增到长约 的片段。将该片段连接克隆载体并测序后，该序列与报道序列同源性为。通过生物信息学方法对该序列进行序列分析和功能预料，该序列具有两处核心启动子区域，一个位于转录起始位点上游 位置，另一个位于 位置，区域得分分别为、，这与等的报道一样。在序列结构上，克隆序列含有、 、 等多个种子或胚乳表达特异性调控元件。因此，在理论上，所克隆启动子序列具有种子特异性启动子的潜在功能。 试验选用p质粒作为基本载体，用置换表达载体中的 启动子，构建植物表达载体，因为质粒的 启动子下游连接报告基因，基因在许多植物中没有内源活性
11、，并且其检测方法灵敏、快速、稳定、线性好，便利下一步对启动子表达状况的探讨。构建好的表达载体可以用于下一步植物转化和再生，探讨启动子活性，也可以用于其他转基因植物探讨。 玉米醇溶蛋白基因启动子在外源植物中的表达调控是个很困难的问题，还须要利用克隆的玉米 醇溶蛋白基因启动子对其表达部位、表达周期以及表达强度进行探讨。相对于组成型启动子而言，种子贮藏蛋白基因启动子具有很强的组织和发育特异性，可避开外源基因在转基因宿主植株中非特异表达所造成的能量负荷和物质奢侈。因此，利用种子特异性的启动子来启动外源基因以保证外源基因的高效表达，可用于改良农作物品种和性状以提高产品质量，目前人们已经起先利用转基因植物
12、作为新型的生物反应器来生产有意义的次生代谢物、蛋白质、糖类和脂类等。 参考文献： 王昌涛，梁粤，王欢，等 玉米启动子的克隆及功能鉴定 沈阳农业高校学报，： 梁华，马崇烈，赵倩，等 玉米醇溶蛋白基因启动子的克隆及活性分析 生物工程学报，： 闫新甫 转基因植物 北京：科学出版社， ， ， ， ， ， ： ， ， ： ： ， ， ， ， ，： ， ， ， ， ： ，： ， ，： ， ， ， ： ， ， ， ， ，： 魏琦超，周蕾，杨贤松，等 种子贮藏蛋白的基因启动子及其应用探讨概述河南农业科学，： 马三梅，王永飞 种子特异性启动子的探讨进展种子， ： 范三红，金伟波，郭蔼光，等 小麦高分子量谷蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定 西北农林科技高校学报， ： 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文 第15页 共15页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页第 15 页 共 15 页