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1、难治性癫痫患者致痫灶中CX43的表达 【摘要】 目的 探讨由CX43组成的缝隙连接在难治性癫痫患者致痫灶脑组织中的表达，犯难治性癫痫的临床探讨及治疗供应新的思路。方法 以24例行手术治疗的难治性癫痫患者为试验组，6例脑外伤急诊手术患者为比照组，采集其手术切除的致痫灶脑组织，应用免疫组织化学方法，视察CX43的表达并与比照组进行比较。结果 免疫组织化学方法检测显示试验组CX43的表达高于比照组(P0001)。结论 难治性癫痫患者致痫灶脑组织中CX43表达增高，提示CX43所形成的缝隙连接参与癫痫活动，可能在癫痫的发生、发展中发挥重要的作用。【关键词】 难治性癫痫;临床;脑皮质; CX431 资料
2、与方法11 一般资料 24例难治性癫痫手术患者中，男12例，女12例，男女比例1 1。年龄1758岁，平均(283111)岁，近3个月发作频率540次/月，平均(153118)，患者病程229年，平均(8378)。全部病例病史均在二年以上，经过两种或两种以上抗癫痫药物系统治疗，癫痫发作每个月4次以上，经影像学、头皮长程脑电图或颅内皮层脑电图监测明确致痫灶，具有手术指征者。全部患者均在皮层电极监测下行致痫灶切除手术，切除病灶有额叶、颞叶、枕叶、海马。术后病理证明为：脑组织皮质分层紊乱，神经元分布不均，胶质细胞增生。比照组脑外伤急诊手术6例患者，女2例，男4例，男女比例2 1。年龄1755岁，平均
3、(365168)岁，均无癫痫发作及癫痫病史。12 标本制作及脑组织中CX43表达的检测 采集试验组24例及比照组6例手术切除脑组织，切块并分别置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液和2%3%戊二醛中固定。免疫组织化学法检测(SP法)：标本行石蜡包埋、切片、脱蜡和水化后，用PBS(pH74)冲洗3次，3 min/次。对组织抗原进行热修复：pH60、001 mmol/L的柠檬酸抗原修复液中煮沸15 min。应用SP超敏试剂盒根据说明进行操作。应用DAB试剂盒配制DAB液，每张切片加101 l簇新配制的DAB溶液，显微镜下视察3 min。自来水冲洗，苏木精复染。自来水冲洗返蓝。切片经过75%、80%、95%、9
4、5%、101%酒精梯度脱水，二甲苯透亮，中性树胶封固。试验组与比照组分别于400倍光学显微镜下，随机选取5个视野，记录镜下阳性细胞数，取其均数。13 统计学方法 试验数据用均数标准差(xs)表示，两组间比较用独立样本t检验，检验水准a=005。统计分析用SPSS 130统计软件和Microsoft Office Excel 2003进行。2 结果免疫组化方法检测致痫灶脑组织CX43的表达 试验组及比照组脑组织中均检测到CX43的阳性细胞，主要分布在细胞膜和细胞浆，经DAB染色，神经细胞胞浆及胞膜显棕色，因不同脑区脑皮质细胞形态不同，故免疫反应阳性细胞的形态也不相同，癫痫患者脑皮质CX43抗体阳
5、性细胞数均明显增多，而正常脑皮质细胞胞浆及胞膜CX43抗体阳性细胞表达稀有(见表1，图12)，差异有统计学意义。缝隙连接是由邻近两个细胞细胞膜上相对应的半通道(hemichannel)对接而成，是目前所知细胞间惟一能干脆交换物质和信息的通道3。而细胞间通过GJ为途径干脆进行的细胞间的信息沟通成为缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)。GJ的基本结构单位是连接子(connexon)或称半通道。连接子是由六个缝隙连接蛋白寡聚成的一种中空的亲水性的环状六聚体结构4。GJ中的半通道直径约15nm，允许分子量小于10 kD和直径
6、小于15nm的小分子物质通过，如代谢分子、离子、其次信使(Ca2+，IP3，cAMP和ATP)及代谢产物如葡萄糖等通过5。CX是一类具有高度保守性的，由多基因编码的膜蛋白6。CX的组织分布具有肯定的特异性，而且不同CX组成的半通道可以相互配对排列组成不同种类的细胞间GJ。不同细胞细胞膜上GJ的种类及数目分布不同，其功能也不相同。数个至数千个GJ在细胞膜上成簇出现则形成缝隙连接斑(gap junction plaque)，GJ的数量确定着斑块的大小以及GJIC的强度7，8。有11 种CX在中枢神经系统中表达，分别为C26，C29，CX30，CX32，CX36，CX37，CX40，CX43，CX4
7、5，CX46及CX47 9。目前在中枢神经系统中探讨较多的为CX32及CX43，CX43在中枢神经系统表达最强，主要分布在星形胶质细胞上10，CX32在神经系统分布最多，主要在少突神经胶质细胞表达，同时在大脑皮质、海马的锥体细胞、颗粒细胞、中脑和基底节神经元中也有较多的表达11。有探讨表明，在癫痫发作敏感动物的脑皮质中，神经元数目削减，而星形胶质细胞数目明显增加，体积变大，突触增多，并且相邻星形胶质细胞之间GJ增多，与其相关的细胞因子也随之发生改变。几乎全部癫痫患者或动物模型脑组织中的星形胶质细胞，在形态、功能、数量上均有明显变更。最近探讨指出星形胶质细胞在中枢神经系统发挥重要的生理功能，如神
8、经元的同步放电、离子平衡、神经递质的调整、葡萄糖的代谢和调整血管张力等12，13。星形胶质细胞通过缝隙连接相互偶联，能够缓冲神经元兴奋时释放到细胞外的大量K+，维持了神经元细胞外环境的稳定14。现在越来越多的证据表明，功能失调星形胶质细胞在癫痫中发挥着关键作用12。CX43在星形胶质细胞上分布最多，其形成的缝隙连接，在胶质细胞间广泛存在。在很多癫痫的探讨中发觉，CX43表达上调及GJ偶联增加，Fonseca等视察采纳免疫荧光标记的胶原纤维酸性蛋白(GFAP)以及应用CX43抗体标记癫痫患者和健康人海马组织，发觉癫痫患者海马组织中，不但星形胶质细胞间GJ偶联进一步扩大，其CX43蛋白表达也明显增
9、加，提示上调星形胶质细胞CX43的表达能够进一步加重全面性癫痫发作。且CX43的表达强度受癫痫持续时间的影响，癫痫时间愈长，CX43的表达就愈多15。Nakase等16将敲除CX43基因的小鼠与CX43表达正常的小鼠在局灶性脑缺血后比较，发觉CX43缺乏的小鼠凋亡细胞增多，表明GJ对凋亡有抑制作用。CX43可能与致痫后脑组织重塑有亲密关系。由此我们可以推想星形胶质细胞上的GJ参加了癫痫活动，CX43对癫痫的发展中起到肯定作用。 第6页 共6页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页第 6 页 共 6 页