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1、宏基因组技术在筛选未培养微生物中新型酶的研究进展 摘要：介绍了宏基因组文库的构建及酶基因的筛选方法，对瘤胃、土壤及其他环境中微生物宏基因组文库的构建和酶基因的筛选探讨进行了综述，同时就宏基因组技术在未培育微生物探讨中的应用进行了展望。 关键词：宏基因组；新型酶；未培育微生物 中图分类号：文献标识码：文章编号：0439114183673-04 in from ， ， ， ： were described， ， ， ： ； ； 自然界中大多数微生物不能通过传统的分别培育技术获得其纯培育，从而导致环境微生物中的多样性基因资源难以被发觉。近年发展起来的宏基因组学技术，是继纯培育技术、现代分子生物学技术
2、之后的一门新技术，它是通过干脆提取特定环境中全部微生物的总基因组，并克隆到相宜的微生物宿主中，然后筛选出目的克隆与基因的方法。构建宏基因文库是开发未培育微生物基因资源的一条有效途径。 宏基因组技术探讨方法 样品总的提取 样品总的提取方法有：干脆提取法与间接提取法。干脆提取法是将样品干脆悬浮于裂解缓冲液中，然后再提取。此方法简便，成本较低，但由于机械损伤较大，因而所获得的片段较小。间接提取法是采纳较温柔的方法，将分别出来的菌体用低熔点琼脂糖等包埋来进行的提取。该方法可以获得片段较大的，但是成本高，可能会在微生物分别时有丢失的现象。 宏基因组文库的构建 构建文库的关键在于选择相宜的载体和宿主。依据
3、所需构建的文库基因片段大小，载体大致分为种：适用于克隆片段小于 及单基因的克隆和表达，如。适用于插入片段在 左右，如、。可以获得多基因簇调控的微生物活性物质的代谢途径。适用于外源片段为 ，如。该载体携带大量外源基因，可以发觉更多的功能基因及更困难的代谢途径。依据转化效率、重组载体在宿主中宏基因的表达等因素来选择相宜的宿主。目前已经构建的宏基因文库所用的广泛性宿主均为 ，另外假单胞菌、链霉菌也可以作为宿主。 宏基因组文库的筛选 基于序列的筛选：用已知功能基因的保守序列来设计杂交探针或引物，再通过杂交或 扩增筛选宏基因组文库，获得目标片段序列。其优点是适用于具有保守序列的功能基因的筛选、鉴定分类学
4、标记的序列分析。其缺点是必需对相关功能基因序列有肯定的了解并且目标基因有肯定的保守区域，所以较难发觉新型的活性基因， 也很难获得其全序列，筛选出来的基因相像性比较高。 基于功能的筛选：功能驱动的宏基因组文库的筛选是依据文库中的一些阳性克隆能表达的性状这一特性来进行筛选，利用其在特定筛选培育基上的表观特性进行筛选。先获得具有生物活性的阳性克隆，再进行亚克隆鉴定，然后通过对插入序列片段的测序和生物学分析，从而获知相应的基因信息。其优点是可用于检测酶的新基因或获得新的生物活性物质。其缺点是阳性克隆的筛选主要依靠于功能基因在宿主菌中的表达，而许多异源基因在特定宿主中表达效率不是很高，从而会导致筛选工作
5、的失败。 宏基因组技术与新型酶筛选 瘤胃微生物宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选 目前，国内外已构建牛、羊等反刍动物瘤胃微生物宏基因组文库，已筛选出多种酶基因。 土壤宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选 土壤中含有丰富的微生物资源，宏基因组技术将会推动人们对土壤微生物的代谢、多样性的探讨。到目前为止，土壤宏基因组技术在新型酶筛选方面已得到广泛运用。 其他环境宏基因组文库构建及新型酶基因的筛选 除上述环境外，还有很多环境都包含着很多不被人所知的微生物，如极端环境、海绵、表面水、人的唾液等；宏基因组技术能帮助人们有效地相识微生物，同时获得更多的新型酶，将其广泛应用到工业生产中。 展望 宏基因组学技术
6、利用免培育方法，变更了以往微生物纯培育技术的弊端，为全面调查和挖掘未培育微生物的多样性及开发利用其资源供应了一种有效手段。利用宏基因组技术筛选新型酶基因被证明是一种行之有效的方法，在新型的工业用酶及生物活性物质的筛选等方面，效率远远超过其他方法，并且具有广袤的前景，是基因工程探讨的一个主要方向。宏基因组技术使分子生物产业投入到工业应用中，为工业的发展供应了一个前所未有的机遇。但是该技术在筛选新型酶的应用中还存在不足之处。比如总提取中会有部分片段丢失；筛选的技术须要改进：对于序列分析法来说，测序的速度和费用的问题对该技术的影响还比较大。功能分析法须要高通量的筛选方法，其中最重要的是提高异源基因的
7、表达和从巨大的文库中有效地筛选目标克隆；筛选酶时依靠于宿主表达，有些酶或许为胞内酶，无法释放到胞外，有些酶分泌过多会导致细胞死亡。因此，须要不断探究和改进。 参考文献： 强慧妮，田宝玉，江贤章，等宏基因组学在发觉新基因方面的应用生物技术，： ， ， ， ： ， ， ， ：A ，： ， ， ： ，：- 冯国栋，许艳艳 ，吕丹青，等 一个新型湖羊瘤胃木聚糖酶基因的克隆和鉴定 科技通报，： ， ， ， ， ，：- 赵圣国，王加启，刘开朗，等 奶牛瘤胃微生物元基因组文库中脂肪酶的筛选与酶学性质 生物工程学报，： ， ， ， ，： ， ， ， ，：- 赵圣国，王加启，卜登攀，等 奶牛瘤胃微生物文库中脲酶
8、克隆的筛选与分析 中国农业高校学报，： ， ， ， ， ，：- 郭鸿，封毅，莫新春，等 水牛瘤胃宏基因组的一个新的葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及其表达产物的酶学特性 生物工程学报，： 谭婉新，刘利，胡亚林，等 一个新的内切葡聚糖酶基因的克隆、表达及其表达产物的酶学特性 广西农业生物科学，： ， ， ， ，：- 朱雅新， 王加启，马润林，等 荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组 文库的构建与分析 微生物学报，： ， ， ， ，： 赵广存，段承杰，庞 浩，等牛瘤胃未培育细菌中一个葡萄糖苷酶基因 的克隆及鉴定 西南农业学报，： 蒋承建，阎 冰，申佩弘，等 一种来自于土壤宏基因组文库的基因的鉴定 生物学杂志，：
9、 ， ， m ，： ， ， ， m ， ，： ， ， ， ，： 黄循柳，黄仕杰，郭丽琼，等 宏基因组漆酶基因片段的克隆与分析土壤学报，： ， ， ， fi ，： 魏萍，宋文刚，郝岗平 泰山土壤宏基因组中耐热半乳糖苷酶基因的克隆、表达及性质 微生物学通报，： 唐敏，洪葵 富集培育促进宏基因组途径获得聚酮酶基因的探讨 安徽农业科学，： ， ， ， ，： ， ， ， fi ， ，： 胡婷婷， 蒋承建，梁璇，等碱性土壤微生物基因的克隆和多样性分析遗传，： ， ：G ，： ， ， ，： ， ， ， ， ， ，：- ，OWIEN， fi ，： ， ， ， ， ，： ， ， ，： 郭巧玲，杨祥胜，赵晶，等
10、深海沉积物宏基因组文库中产蛋白酶克隆的筛选及性质分析 应用与环境生物学报，： 张映京 南极中山站沉积物宏基因组文库的构建及碱性蛋白酶基因的克隆、表达和性质分析厦门：厦门高校， ， ， ， ，： ， n e m l r ，： 唐咸来，车志群，李双喜，等 沼气池宏基因组文库中未培育微生物葡萄糖苷酶基因的克隆与鉴定 广西植物，： ， ， ， ，： 张戌升，李志勇，缪晓玲 基于皱皮软海绵宏基因组的基因筛选的探讨 微生物学报，： 吴杰，李志勇，张戌升 海绵宏基因组文库构建及抗菌肽功能基因的初步筛选 生物技术通报，：， 张鹏，段承杰，庞浩，等 堆肥未培育细菌的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆和鉴定 广西科学，：， ， ， ， ，： ： ，： ， ，： 第18页 共18页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页