《1株海洋来源产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其对木质纤维材料的降解能力.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1株海洋来源产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其对木质纤维材料的降解能力.docx（11页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、1株海洋来源产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其对木质纤维材料的降解能力 农业大国，木质纤维素资源非常丰富，仅农业秸秆、皮壳年产量就高达7亿t以上1，然而目前多用于燃烧、动物饲料，没有充分发挥其价值，从而造成资源的奢侈。 植物细胞壁中的酚酸类物质通过酯键在木质素之间、木聚糖之间及木聚糖与木质素之间形成交联，阻碍了木质纤维素的降解和利用。目前，水解木质纤维素主要通过化学法、生物酶解法2种方式进行2-4。化学法虽然操作简洁、效率高，但该过程通常运用强酸、强碱，产生的废液简单污染环境。相比之下，生物酶法更加绿色环保。阿魏酸酯酶属于羧酸酯水解酶，可以破坏阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯及多聚糖阿魏酸酯中的酯键并释放阿
2、魏酸，可以有效破坏致密的网状交联结构。为提高木质纤维素的降解效率，实现阿魏酸酯酶在医药、食品、造纸、生物燃料等行业的应用，获得性质优良的阿魏酸酯酶成为亟待解决的问题。 由于海洋独特的环境条件，海洋来源微生物形成了特别的结构，为人类供应了众多结构新奇、功能独特的生物活性物质，如纤维素酶5、木聚糖酶6等木质纤维素降解酶类。由此可以推想，海洋环境中可能隐藏着新奇独特的阿魏酸酯酶资源。本探讨从海水中获得1株产阿魏酸酯酶菌株，并对该酶对多种植物材料的降解实力进行探讨，以期为挖掘海洋来源阿魏酸酯酶资源奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料 海水样品采自潍坊滨海开发区海疆，样品的处理
3、方法见文献7。 1.1.2 试剂 阿魏酸乙酯，购自Sigma-Aldrich公司；阿魏酸标准品，购自阿拉丁试剂公司；PCR扩增相关试剂和DL15000 Marker，购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；木聚糖酶，购自江苏锐阳生物科技有限公司；麦麸，购自当地面粉厂；除乙腈为色谱纯外，其他常规试剂为国产分析纯。 1.1.3 仪器 ABI10101 PCR扩增仪；LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津；DYY-6C型核酸电泳槽，北京六一生物科技有限公司；GENE GENIUS凝胶成像系统，美国Syngene公司；SW-CJ-1FD干净工作台，江苏苏净集团有限公司
4、。 1.1.4 培育基 筛选培育基：0.05%氯化钙，1%氯化钠，0.05%磷酸氢二钾，0.05%磷酸二氢钾，0.1%硫酸铵，0.005% 硫酸镁，2%琼脂，pH值7.07.2。每个平板倒 20 mL 筛选培育基，加入0.3 mL过滤除菌的10%溶于二甲基甲酰胺的阿魏酸乙酯，马上摇匀，直至呈现云雾状；发酵培育基：1%氯化钠，0.5%硫酸铵，0.1% 酵母粉，0.05%磷酸氢二钾，0.05%磷酸二氢钾，0.5%阿魏酸乙酯，pH值7.0 7.2。 1.2 试验方法 1.2.1 平板法初筛 将样品的稀释液涂布于筛选培育基上，20 恒温培育3 d，视察是否出现透亮水解圈。依据透亮圈出现的早晚、透亮圈直
5、径与菌落直径比值的大小筛选获得活性高且产酶周期短的菌株。将菌株接种于筛选培育基上保存备用。 1.2.2 菌体16S rDNA序列测定与分析 将菌株接种于液体培育基中，20 培育2 d，离心收集菌体，运用细菌基因组DNA提取试剂盒提取其DNA。采纳16S rDNA的通用引物进行PCR扩增。PCR产物送生工生物工程股份有限公司完成测序工作。将测序结果在GenBank中进行序列同源性分析，并利用Mega 5.2软件进行系统发育树的构建。 1.2.3 菌体粗酶液酶学特性的探讨 从筛选培育基上挑取少许菌种，接种于装有25 mL发酵培育基的101 mL三角瓶中，20 静置培育2 d。4 、16 000 g
6、离心5 min，收集上清，即得到粗酶液。 粗酶酶活性的测定。酶解底物为去淀粉麦麸，制备方法参见文献8。取上述250 L粗酶液于离心管中，并加入750 L磷酸缓冲液，45 恒温水浴保温5 min。随后加入10 mg DSWB反应60 min，沸水浴5 min后终止反应，通过高效液相色谱检测酶反应液中阿魏酸的含量。在上述反应条件下，1 min产生1 g阿魏酸所需的酶量定义为1个酶活性单位。 HPLC的检测条件如下：Inertsil C8-3色谱柱；流淌相为乙腈-1%冰醋酸；柱温30 ；流速1.0 mL/min；检测波长320 nm；进样量20 L。 粗酶的最适温度与温度稳定性。分别用不同温度代替上
7、述酶反应体系中反应温度，测定粗酶液在各温度下的酶活性。以最高酶活性为101%，计算相对酶活性。将粗酶液置于不同温度下，恒温水浴处理 2 h，每个温度设3个重复，测定残余酶活性。 粗酶的最适pH值与pH值稳定性。运用柠檬酸钠缓冲液，50 mmol/L pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.4、8.0的磷酸缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液代替上述酶反应体系中运用的缓冲液，测定在各pH值下的酶活性。设最高酶活性为101%，计算相对酶活性。将粗酶液置于不同缓冲液中，45 保溫2 h，每个pH值设3个重复，测定残余酶活性。 1.2.4 菌体粗酶液对木质纤维素材料的降解 通过在上述酶反应体系中添加10 U
8、木聚糖酶后测定阿魏酸释放量提高与否检测粗酶与木聚糖酶的协同关系。分别运用250 L FAES1和混合酶液作用于10 mg DSWB、10 mg汽爆小麦秸秆、10 mg汽爆玉米秸秆6 h后，每个组合设3次重复，测定阿魏酸的释放量。SEWS、SECS采纳曾薇等的方法9进行制备。上述植物纤维材料中阿魏酸的含量可以采纳Mukherjee等的方法10进行测定。 2 结果与分析 2.1 产阿魏酸酯酶菌株S1的筛选 利用平板透亮圈法，从海水中筛选到3株具有阿魏酸酯酶活性的菌株。由表1、图1可知，菌株S1出现阿魏酸酯酶活性最早，且透亮圈直径最大。透亮圈出现的早晚与产酶周期、R值与酶活性呈正相关，由此说明菌株S
9、1产酶周期短，且阿魏酸酯酶活性较高。 2.2 产阿魏酸酯酶菌株S1的鉴定 2.2.1 菌株形态结构视察 菌株S1在固体培育基中于 20 培育2 d后，直径为23 mm，菌落为白色，且长入培育基内部，表面干燥、粗糙，边缘不规则，与培育基结合紧密，不易挑起。在液体培育基中，S1呈颗粒状附着于甁壁，不使培育基变浑浊。该菌在一般细菌养分培育基中不生长。通过显微视察发觉，S1细胞呈球状，革兰氏阴性。 2.2.2 16S rDNA扩增及分析 通过PCR扩增获得菌株S1的16S rDNA片段的电泳结果如图3所示。经测序，此16S rDNA序列长1 437 bp，提交至NCBI GenBank，注册号为KT7
10、31290。将该序列提交至GenBank进行同源序列比对，结果显示，在检索到的101个相像性较高的16S rDNA序列中，有39个为甲基养分菌种属，1个为氨基养分菌种属，其余为不行培育微生物。其中，菌株S1与鞭毛甲基小杆菌的同源性最高，高达101%。以16S rDNA序列同源性为基础，运用Mega 5.2的邻接 分析法经过1 000次置换式取样计算出 Bootstrap值生成系统进化树，结果见图4。结合该菌的形态特征，推想该菌属于嗜甲基菌科。 2.3 粗酶FAES1酶学特性探讨 2.3.1 粗酶酶活性 以DSWB为底物检测粗酶的酶活性，结果表明，该粗酶的酶活性为U/mL。 2.3.2 粗酶的最
11、适作用温度和热稳定性 FAES1在45 时酶活性最高，在4060 时相对酶活性保持在73%以上，高于60 或低于40 时酶活性呈下降趋势。由图5可见，当粗酶液于73 保温2 h后，残余酶活性可维持80%以上；当温度上升至75 时，粗酶液保育2 h后仍可保存45%左右的酶活性。由此可见，FAES1具有明显的热稳定性，从而使其在高温工业流程中具有应用潜力。 2.3.3 粗酶的最适作用pH值和pH值稳定性 由图6可知，FAES1的最适pH值为7.0。在pH值6.09.0的范围内，粗酶表现出良好的稳定性，残余酶活性可维持80%以上。 2.4 粗酶FAES1与木聚糖酶对木质纤维素材料的协同作用 通过在反
12、应体系中添加木聚糖酶与否检验FAES1与木聚糖酶的协同作用。经测定，当FAES1单独作用于10 mg DSWB、10 mg SEWS、10 mg SECS 6 h时，可以释放阿魏酸的量分别约占各种材料中总阿魏酸含量的37.0%、16.5%、79%；当运用混合酶液作用同样时间，阿魏酸释放量分别约占总含量的46.0%、33.2%、141%，均高于单独运用FAES1，其中以对DSWB的降解实力最强。 3 探讨与结论 本探讨通过平板透亮圈法从海水中获得1株产阿魏酸酯酶菌株S1，通过其培育特征、形态特征和分子生物学鉴定，初步推想其属于嗜甲基菌科，这是首次发觉此科菌株具备阿魏酸酯酶活性，为生产阿魏酸酯酶的
13、微生物新成员。 经过初步酶学性质探讨发觉，菌株S1所生产的阿魏酸酯酶FAES1在73 下仍保持较高酶活性，与腾冲嗜热厌氧菌来源的阿魏酸酯酶TtFAE11相像。莱州湾南岸海疆年平均水温1112 12，并不属于高温海疆，然而源于菌株S1的阿魏酸酯酶FAES1却具有显著的热稳定性。已报道的阿魏酸酯酶Est2713、纤维素酶Cel5A14表现出与其非极端环境的来源不相关的良好的耐盐性。此现象的出现可能由于非极端环境承受更大温度、盐度、pH值的改变波动，那么处于非极端环境的生物酶须要适应这些波动而发挥其生物活性11。FAES1所具有的显著热稳定性使其具备工业应用的潜力。 FAES1对麦麸、小麦秸秆、玉米
14、秸秆均表现出降解实力，显示其较广的自然底物范围，其中以对麦麸的作用实力最强。与StFaeC15、AusfaeA16相像，FAES1单独作用于DSWB时能够释放阿魏酸，且能够释放出高达37%的阿魏酸，远高于上述阿魏酸酯酶，表现出较高的酶活性。木聚糖酶的加入可以提高阿魏酸的释放量，说明阿魏酸酯酶在木质纤维素降解过程中与木聚糖酶具有良好的协同关系13。阿魏酸以其抗氧化、防自由基、抗血栓、降血脂、抗癌、抗辐射等功能著称17，可用作功能性食品、化妆品的添加剂，广泛存在于麦麸中。FAES1与木聚糖酶的协同作用能够释放DSWB中高达46%的阿魏酸，显示FAES1在提高麦麸价值方面极具应用潜力。 上述试验结果
15、显示，海洋环境中的确隐藏着丰富且新奇的阿魏酸酯酶，可利用宏基因组技术开发更多的海洋阿魏酸酯酶资源。后续探讨将进一步确定FAES1的类型，并围绕菌株S1产酶条件的优化、FAES1的纯化、阿魏酸酯酶基因克隆与表达等方面绽开工作，以期提高阿魏酸酯酶FAES1的活性，深化挖掘其应用价值。 参考文献： 1郑 辉，陶 磊. 玉米秸秆发酵生产燃料乙醇的探讨进展J. 广西轻工业，2022，26：14-15，59. 2Verma B，Hucl P，Chibbar R N. Phenolic acid composition and antioxidant capacity of acid and alkali
16、hydrolysed wheat bran fractionsJ. Food Chemistry，2022，116：947-954. 3张 璟，欧仕益，张 宁，等. 酶解麦麸制備低聚糖和阿魏酸的探讨J. 广州食品工业科技，2003，19：17-22. 4蔡艳玲，何美丹. 水稻秸秆降解探讨进展J. 广东农业科学，2022，41：120-124，132. 5韩 笑，闫培生，史翠娟，等. 海洋微生物产纤维素酶及其应用探讨进展J. 生物技术进展，2022：191-195. 6郭 兵. 海洋细菌Glaciecola mesophila KMM241产木聚糖酶的结构、功能和应用潜力探讨D. 济南：山东高校
17、，2022. 7郑鸿飞，孙 谧，王跃军，等. 产酯酶海洋微生物的筛选、鉴定及系统发育分析J. 渔业科学进展，2022，30：68-73. 8桑姝丽. 土壤环境中新型阿魏酸酯酶基因的克隆表达及其分子定向改造探讨D. 广州：中山高校，2022：54-55. 9曾 薇，陈洪章. 阿魏酸酯酶和纤维素酶在水解汽爆稻草中的协同作用J. 生物工程学报，2022，25：49-54. 10Mukherjee G，Singh R K，Mitra A，et al. Ferulic acid esterase production by Streptomyces sp.J. Bioresource Technolog
18、y，2022，101：211-213. 11Abokitse K，Wu M，Bergeron H，et al. Thermostable feruloyl esterase for the bioproduction of ferulic acid from triticale branJ. Applied Microbiology and Biotechnology，2022，87：195-203. 12曲卫光. 潍坊滨海区北部海疆单环刺螠水产资源爱护的探讨D. 北京：中国农业科学院，2022：24-32. 13Sang S L，Li G，Hu X P，et al. Molecular cl
19、oning，overexpression and characterization of a novel feruloyl esterase from a soil metagenomic libraryJ. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2022，20：196-203. 14Voget S，Steele H L，Streit W R. Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulaseJ. Journal of Biotechnology，20
20、22，126：26-36. 15Topakas E，Vafiadi C，Stamatis H，et al. Sporotrichum thermophile type C feruloyl esterase：purification，characterization，and its use for phenolic acid ester synthesisJ. Enzyme and Microbial Technology，2022，36：739-736. 16龚燕燕，殷 欣，唐存多，等. 宇佐美曲霉阿魏酸酯酶与木聚糖酶协同作用降解小麦麸皮制备阿魏酸J. 中国生物制品学杂志，2022，27：262-266. 17桑姝丽. 微生物来源阿魏酸酯酶基因克隆与表达探讨进展J. 生物技术，2022，23：87-91. 第11页 共11页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页第 11 页 共 11 页