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1、转基因家畜的新品系培育 摘要：分析了利用现有的转基因技术所获得的代转基因家畜外源基因的整合和表达状况：在随机整合的状况下，存在大量嵌合体现象，不同的整合位点其表达效应不同；应用基因打靶技术实现定位整合，状况相对简洁。在此基础上，提出不同整合类型对代转基因家畜进行遴选的方法和程序，以及建立转基因家畜纯合体的两条技术路途：一是利用遴选出的具有遗传稳定性的代个体，通过常规繁育获得；二是利用基因打靶技术，获得双等位基因整合的家畜。最终依据家畜育种的理论，提出了建立转基因新品系、进而形成新品种的步骤。 关键词：转基因家畜；纯合体；新品系 中图分类号：.3文献标识码：文章编号：0439114183785-
2、05 ， ： T of ， t was ， ， b to ， the ， ： ； ； 应用现有的转基因技术制备出转基因家畜个体，再到培育成一个转基因新品系、进而培育成新品种，还有大量的选育工作要做和相当长的育种路程。无论用哪一种转基因方法得到的原代转基因家畜，都只是育种的初始材料，有的还不能作为育种的材料。代转基因家畜能否作为育种材料，取决于其外源基因遗传的稳定性，以及其表达水平是否达到预期要求。而代转基因家畜遗传稳定性以及表达水平，则与外源基因整合的位点和整合的状况有关。按目前的转基因技术，代转基因猪外源基因一般只是整合在同源染色体中的一条染色体上，可称其为“杂合体”。只有获得“纯合体”，才
3、能进行下一步的建立家系、品系等育种工作。在建立转基因品系的过程中，还要兼顾其他经济性状的选育。可见，从转基因家畜个体到培育成转基因新品系，是分子选择与常规育种相结合的过程。 本探讨提出建立转基因家畜新品系的方法和步骤，仅供参考。 外源基因在代转基因家畜中的整合状况 目前的转基因技术，外源基因的整合有两种状况：一种是随机整合；另一种是定位整合。外源基因的定位整合，一般是通过基因打靶技术实现的。 随机整合 转基因动物的嵌合体现象所谓转基因动物嵌合体是指：转基因动物由转基因的和非转基因的两种细胞、或由两种或两种以上不同类型的转基因细胞构成。下列几种状况，有可能导致转基因嵌合体的产生：其一，与外源基因
4、整合的时机有关，假如胚胎或细胞导入基因的时机染色体已经复制，则形成嵌合体的可能性较大。其二，对两个细胞期以上的胚胎进行基因导入，例如对两个细胞期的胚胎进行外源基因的显微注射，多数会形成嵌合体。其三，在胚胎细胞的分裂和分化过程中，一部分插入被修饰，也会形成嵌合体。有探讨表明，应用显微注射的方法进行转基因，嵌合体的比例大约占左右，。在转基因嵌合体中，假如生殖细胞中有外源基因的嵌合，则可以将转基因传递给后代；否则，就不能将转基因传递给后代。这就是有些代转基因动物不能传代的缘由之一。 外源基因的整合位点及其效应非基因打靶的外源导入受体细胞后将随机地插入受体基因组中的随意位置。牛迄东等用地高辛标记探针对
5、头代转猪染色体进行原位杂交，结果表明，其外源基因分别定位在、上。陈付学等 应用非同位素原位杂交技术，探讨转基因猪外源基因在受体基因组染色体上的整合及其定位，结果表明，头代转猪外源基因分别定位在、和上。这些试验结果可以说明，不同的代个体外源基因的整合位点不同，显示出其随机性。 转基因的表达与其整合位点有关，不同的整合位点，表现出不一样的表达效果，称之为转基因的“位点效应”。朱作言等将转基因的“位点效应”分为三种类型，即“有效整合”、“缄默整合”和“毒性整合”。转基因的有效整合位点应具备两个特征：其一，转基因能有效表达；其二，避开干扰基因组功能基因的表达调控或破坏基因结构。无表达作用的整合为“缄默
6、整合”，其整合位点常发生在染色体异染色质区。“毒性整合”的位点一般在常染色区，由于干扰了基因组功能基因的表达调控或破坏了正常基因的结构，而导致胚胎或个体生长发育受阻、畸形甚至夭折。 有效整合的位点具有遗传的稳定性。樊俊华等对来自同一代亲本的、代转P基因猪，采纳非同位素标记的染色体原位杂交技术进行了定位检测，结果表明，外源基因均定位于上。表明能够传代的代转基因动物，其后代的整合位点是相对稳定的。 外源基因的整合形式外源基因随机整合的形式有三种：单拷贝单一位点整合，多拷贝串联单一位点整合，多拷贝多位点整合。多拷贝整合，外源通常呈现多串状整合；在绝大多数状况下，某一位点上多拷贝串状整合的外源基因，实
7、行头尾相连的排列方式；这些方向一样的串状拷贝，是被导入的完整或近乎完整的拷贝，少数状况下也有在两个相邻拷贝结合的地方出现小的不完整；在稀有的状况下，发觉两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连接方式，在这种状况下常发生末端缺失。转基因的另一种改变是某些碱基被甲基化。转基因拷贝的不完整、末端缺失或甲基化，都会影响基因表达和遗传的稳定性。多拷贝串联的拷贝数可从几个到个以上。等以定量斑点杂交法，检测转基因猪整合外源基因的拷贝数，发觉整合基因拷贝数在个，整合基因拷贝数在个，整合基因拷贝数在个。孔庆然等采纳定量 技术，检测了两头体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪，其外源基因拷贝数分别为个和 个。 已有的转
8、基因动物探讨，尚未见转基因拷贝数与表达水平之间具有很明确相关性的报道。但这是须要进一步深化探讨的问题。 定位整合 外源基因的定位整合一般是通过基因打靶实现的，基因打靶是精确地人工修饰基因组的一种技术。这种技术的特征在于：第一，具有干脆性，干脆作用于靶基因，不涉及基因组的其他位置；其次，具有精确性，可以将设计好的序列插入选定的目标基因座，或者用设计好的序列去取代基因座中相应的序列。因此，通过基因打靶技术制备的转基因动物，应不存在转基因的嵌合体现象，其整合位点和拷贝数也应是确定的。 对于家畜而言，实现外源基因的定位整合，必需通过核移植的程序。目前体细胞核移植生产克隆家畜的效率很低，大量的重构胚在孕
9、育期死亡，诞生后的个体生长发育不正常、甚至死亡的频率也很高。这些状况，应主要是由于克隆技术不完善而导致的；但也不能解除一部分是由于外源基因的表达或整合位点的不当所致。 代转基因家畜的遴选 了解了外源基因在代转基因家畜中的整合和表达状况，就不难理解要进行定向育种，就必需对代转基因个体进行遴选。 遴选的内容和目标 代转基因家畜是建立新品系的原始材料，遴选正确与否，将确定今后育种工作能否进行下去。选择内容应包括如下几点：代转基因家畜的生长发育、繁殖性能是否正常；外源基因的表达是否达到预期；外源基因整合和表达水平是否具有遗传稳定性。 最终的遴选目标应是：生长发育和繁殖性能正常，外源基因的表达水平达到预
10、期，且具有遗传稳定性的个体。 遴选程序 代生长发育、繁殖性能和生理生化指标的测定和评价对全部代个体按家畜育种的常规进行饲养管理并观测其生长发育和繁殖性能，在规定的日龄进行生理生化指标的检测，重点视察有无异样或其他的病理表现。全部测定和检测，均应以同窝非转基因家畜或亲本品种的成果作为比照。 代转基因家畜的表达检测对生长发育、繁殖性能和生理生化指标正常的代转基因家畜，进行转基因的表达检测。表达检测的程序，应首先进行转录水平的检测，然后进行翻译水平的定性和定量检测，有些还要进行生物活性的检测、功能测试和性能测定。从而选择出达到预期表达水平的代转基因个体。 代个体遗传稳定性测定测定代转基因个体的遗传稳
11、定性，需进行繁殖传代，从后代的检测状况进行推断。 对于随机整合的转基因个体，繁殖传代应实行如下方式：雄性代个体应与非转基因的雌性个体进行交配，雌性代转基因个体应与非转基因雄性个体交配。根据这样的交配方式，从理论上，遗传稳定的代个体，其后代的阳性率应为。实际操作中，在后代个体数不少于个样本的状况下，接近即可，样本量越大，越应接近。切忌代不同性别个体之间的交配，因为每头代个体整合的位点不一，表达水平不同，同时还存在转基因嵌合体的可能，这种交配方式所产生后代的检测结果无法说明任何一个亲本的遗传性。 对于定位整合技术制备的代转基因个体，应首先进行外源基因的定位检测，以推断其是否根据预期整合到相应的位点
12、上；同时进行表达检测，定位整合的代个体其表达水平应当是基本一样的，但允许有肯定的差别。即使整合与表达的检测都达到了预期的代个体，也必需通过传代来推断其是否具有遗传的稳定性。其繁殖传代的方式可有两种：一种方式如前所述，即代转基因个体与非转基因个体进行交配，如后代的阳性率左右，且的表达水平基本达到了转基因亲本的水平，即可初步认为该代转基因个体具有遗传稳定性；另一种方式，即两头具有不同性别的代个体之间的交配，其产生的子代假如阳性率为左右，就可以初步认为该两头代个体均具有遗传稳定性。 最终判定代转基因个体的遗传是否稳定，还有赖于由该代所产生的、，甚至于、代的检测结果。 转基因家畜纯合体的建立 建立转基
13、因家畜的纯合体可有两条路途：一是利用遴选出的具有遗传稳定性的代个体，通过常规繁育获得；二是利用体细胞二次基因打靶，获得双等位基因整合的家畜。第一条路途耗时长，而且还有近交风险；其次条路途可一步到位，但技术难度大。 通过常规繁育建立转基因纯合体 随机整合转基因纯合体的获得随机整合的状况下，代个体之间整合的位点不一，整合的拷贝数不同，表达水平也有差别。假如不同性别的代个体之间进行交配，无法得到双等位基因整合的后代，因此也就不能得到转基因纯合体。只有代个体与非转基因个体交配所产生的代，其整合的位点、整合的拷贝数和表达水平才会是一样的；进而进行代之间的交配，在近交所产生的代中，才能筛选出转基因纯合体。
14、其近交的方式可有如下两种。 全同胞近交：交配模式如图所示。 在图的交配模式中，代转基因个体的比例应为总产仔数的；而在代转基因个体中，纯合体应占。 半同胞近交：除个别作为试验动物用的动物外，作为商业生产的家畜品种，并没有严格生物学意义上的近交系。非近交系的家畜实行近交，会出现近交衰退的现象。近交的程度越高，近交衰退的现象也就越严峻。为了降低近交衰退的风险，可采纳半同胞近交，交配模式如图所示。图的交配模式，代转基因个体中纯合体亦应占。 定位整合转基因纯合体的获得应用定位整合技术所获得的代转基因个体之间，由于其整合位点、整合拷贝数相同，表达水平也基本一样，因此可以干脆用不同性别相互交配的方法得到纯合
15、体。如图所示。在图的交配模式中，代转基因个体的比例应占总产仔数的，而纯合体应占代转基因个体的。 转基因纯合体的鉴定与筛选上述无论哪一种交配模式，都须要将纯合体从转基因的群体中筛选出来。鉴定纯合体的方法有两种：第一种是试验室方法，近年来发展建立了一些纯合体转基因动物鉴定的试验室方法，如荧光原位杂交法、杂交法和荧光实时定量法等。这些方法已胜利地应用于转基因小鼠纯合体的筛选。其次种是常规繁育法，试验室方法的检测结果只能作为参考，最终确认纯合体还必需通过常规繁育的方法。转基因个体与非转基因个体交配，假如其后代是转基因的，就可以确认该转基因亲本是纯合体；否则其转基因亲本仍旧是“杂合子”。 通过基因重复打
16、靶技术建立转基因家畜纯合体 通过常规繁育技术建立转基因家畜纯合体耗时很长。以猪为例：猪的世代间隔为年左右，如前所述，随机整合的代转基因猪通过两个世代的繁育，加上鉴定纯合体的一个世代，至少须要年的时间才能最终筛选出纯合体；即使是定位整合的代转基因猪，至少也须要年的时间才能最终筛选出纯合体。对于牛等世代间隔长的家畜，其所耗费的时间就更长。体细胞的基因重复打靶技术为解决上述问题供应了可以一次到位的技术路途。等对牛成纤维细胞进行基因的打靶，并通过克隆技术构建重构胚，重构胚移植到子宫内发育成日龄的胎儿实施流产并再次分别其成纤维细胞；然后进行重复打靶获得纯合型基因敲除细胞，以纯合型基因敲除细胞作为核供体，
17、构建成双等位基因位点失活的转基因牛。 体细胞基因重复打靶的关键技术有两点：一是要利用目标基因及其相邻序列，构建和两种基因打靶载体，分别用于敲除两条姊妹染色体上的目标基因拷贝；、两种载体分别用不同的标记，如和，防止两种标记基因相互干扰。二是要建立“细胞挽救技术”。在体细胞上实施基因打靶的制约因素，是细胞寿命太短。由于细胞增殖的代数有限，往往是尚未确定是否实现了靶向基因交换，细胞就进入凋亡期，难以把细胞还原成动物个体。但是，体细胞经过核移植过程之后，可以重新启动发育程序，其寿命得到更新。依据这个原理，在两轮基因打靶之间引入细胞挽救过程，使第一轮基因打靶中的阳性细胞得以更新。这一技术步骤能将细胞团扩
18、增为胎儿组织，生产大量均质的细胞，这些细胞不仅可以满意进一步分子检测须要，同时为完成其次轮基因打靶争取到足够的时间。 完成两次基因打靶核移植诞生的后代，应当全部是双等位基因整合的纯合体。但最终的确认还是要通过试验室检测和常规繁育的方法，转基因个体与非转基因个体交配，假如其后代是转基因的，就可以确认该转基因亲本是纯合体。 转基因家畜新品种的建立 得到遗传稳定的转基因纯合体家畜后的工作便是进入常规育种的程序。为了监测外源基因在进入常规育种传代过程中是否丢失或变异，须要对后代逐头进行分子检测。 转基因新品系的建立 建立转基因新品系，可采纳系祖建系法，即以经过筛选的纯合体为系祖建立品系。以猪为例：猪的
19、品系群最低应不少于个血统的头公猪和头母猪所组成，形成这样的一个遗传稳定、表达水平基本一样的群体，就可以认为转基因猪新品系建立胜利。 随机整合转基因家畜新品系的建立随机整合的转基因家畜个体之间，外源基因整合的位点和拷贝数不一样，假如用来源不同的纯合体之间交配，所得到的后代又成为新的杂合体。因此，只能采纳同一来源的纯合体之间交配，才能保证后代的纯合性和遗传稳定性。这就增加了建系的难度，过高的近交系数会导致群体的衰退，生命力下降，有的或许难以为续。因此，在建立纯合体的过程中，一是要尽可能采纳半同胞近交的方式；二是选择的非转基因个体与代转基因个体之间，以及非转基因个体之间，应尽量避开血缘关系。 以来源
20、于同一头代转基因家畜的若干纯合体，经各种性状的选择之后，首先建立若干个家系。在建立家系的过程中，设计公、母畜之间的交配组合，也要尽量降低近交系数。在建立家系的基础上，按育种安排的数量，选择其中优秀的公、母畜个体，进行纯繁扩群，建立核心群，进而形成品系。 定位整合转基因家畜新品系的建立应用定位整合技术制备的转基因家畜，其新品系的建立比随机整合要简洁、易行。无论来源是否相同的纯合体，其交配的后代都是纯合体。这就可以简单地避开血缘关系，降低或防止近交衰退。 假如是应用重复打靶技术获得的纯合体转基因家畜，从代就可以进行选择并建立家系的工作。 从不同整合类型转基因家畜新品系建立的过程中，可见定位整合乃至
21、于双等位基因整合对于转基因育种的重要性；同时启示我们，假如出于育种的目的制备转基因家畜，从一起先就应考虑后期育种工作的困难性，从而选择合适的转基因技术路途。 转基因新品种的建立 我国猪育种工作者认为，一个猪的品种，至少应有个以上的品系。每个品系之间应有不同的品质。对于转基因猪的全部品系而言，转基因所表达性状的品质应当是共同具备的。而品系之间品质的不同，则可以从以下几方面体现：以制备转基因猪时所用不同亲本的品系为基础，建立若干个转基因品系；以转基因性状表达水平的差异，建立若干个品系。随着转基因品系扩繁规模的扩大，会逐步分布在不同的地区和不同的饲养场。不同的地区或不同的饲养场，其饲料结构、自然条件
22、、饲养管理方法的不同，会形成若干各具特点、互有差别的类群，从而形成若干新的品系。 至今尚未见任何一种转基因家畜新品种培育胜利的报道，其过程或许比本探讨描述的这些要困难、困难得多，会有很多现在还预料不到的事情发生。只有在今后的育种实践中，不断探究、总结和完善，形成转基因家畜育种的新的理论和方法。 参考文献： 陈永福转基因动物北京：科学出版社， ， ， ， ，： ， ， ， ，： 牛迄东，何新，陈清轩，等 转基因猪外源基因染色体定位探讨生物工程学报，： 陈付学，樊俊华， 曹军平， 等 转基因猪外源基因的定位 上海高校学报， ： 朱作言，许克圣，谢岳峰，等转基因鱼模型的建立中国科学，： 樊俊华，魏庆信，陈清轩，等 转基因猪外源基因整合及遗传特性探讨 遗传学报，： ， ， ， ， ，： 孔庆然，武美玲，朱江，等 转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的探讨 生物化学与生物物理进展，： ， ， ， ，： 刘震乙，盛志廉，吴显华，等 家畜育种学 北京：中国农业出版社， 第18页 共18页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页第 18 页 共 18 页