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1、 动物细胞工程（动物克隆技术） 编稿：闫敏敏 审稿：宋辰霞【学习目标】1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用。2、比较动物细胞培养与植物组织培养区别。3、简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。【要点梳理】要点一：动物细胞培养1、动物细胞培养概念（1）动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。（2）动物细胞培养过程中的几个重要概念：细胞贴壁：培养液中分散的细胞很快贴附在瓶壁上生长繁殖，称为细胞贴壁或贴壁生长。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。原代培养：将动物的器官或组织
2、用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，分散成单个细胞，然后制成细胞悬液，放入培养瓶内，放在适宜的条件下培养，这种培养叫原代培养。传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，还要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理后，再分瓶培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。2、动物细胞培养过程【高清课堂：动物细胞工程（动物克隆技术）369168 动物细胞培养过程 】（1）取材：动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织。 （2）过程：原代培养传代培养细胞株细胞系（3）动物细胞培养过程：大多数死亡原代培养动物胚胎或幼龄动物器官、组织单个细胞细胞悬浮液10代危机剪碎，胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理子代细胞可继续传代的细胞50代危机绝
3、大多数死亡可无限传代的细胞（连续细胞系）有限细胞系要点诠释取自动物胚胎或幼龄动物器官、组织，是因为组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强。胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。 成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养。用胰蛋白酶处理组织块，可使细胞分散开，这样做的目的是使细胞与组织液充分接触，这也说明了细胞间的主要物质是蛋白质，但是由于细胞膜的主要成分之一也是蛋白质，因此要控制好处理的时间，不能太长，否则会损伤细胞。由于多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，因此不能使用胃蛋白酶分散细胞。细胞系：泛指可传代的细胞，分为有限细胞系和
4、连续细胞系。细胞株：通过一定选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，称为细胞株。细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。3、动物细胞培养的条件【高清课堂：动物细胞工程（动物克隆技术）369168 动物细胞培养条件 】（1）无菌无毒的环境培养液应进行无菌处理，培养液中加抗生素并且定期更换培养液。（2）营养协调：水、无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、维生素、促生长因子、动物血清（3）适宜温度和pH：哺乳动物，适宜温度：36.50.5；pH：7.27.4。（4）气体环境: 95%空气+5%CO2置于含95%空气5%二氧化碳的
5、混合气体的培养箱中。细胞培养所需气体主要有氧和二氧化碳，前者是细胞代谢所必需的，后者的主要作用是维持培养液的pH。要点诠释动物细胞培养与植物组织培养有许多相似之处，也有许多不同点。一是它们用的培养基不同，植物组织培养用的一般是固体培养基，而动物细胞培养用的一般是液体培养基。第二是它们的培养基的成分不同。动物细胞培养的培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐和维生素，另外还有动物血清。植物组织培养所需要的培养基包含植物生长和发育的全部营养成分，如矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物，没有动物血清。第三是植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，
6、因此得到的是同一种的细胞。4、动物细胞培养技术的应用(1)蛋白质生物制品的生产： 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体(2)健康细胞培养：培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植(3)检测有毒物质：原理是动物细胞经该物质处理后，畸变细胞所占的比例越大，说明该物质毒性越大。要点二：动物细胞融合技术 （动物细胞杂交）1、 概念 两个或多个动物细胞结合成一个细胞（杂交细胞）的过程，叫动物细胞融合。2、原理 细胞膜具有一定的流动性3、诱导方法：物理法离心、振动、电激；化学法聚乙二醇；生物方法灭活的病毒要点诠释:灭活是指用物理或化学的手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。4、动物细胞融合的过
7、程5、优点：动物细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限性，使远缘杂交成为可能。6、应用（1）进行基因定位 利用杂交细胞检测染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系。（2）制备单克隆抗体要点三：单克隆抗体的制备1、抗体：抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。2、B淋巴细胞与抗体的关系：（1）B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。（2）动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。（3）每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。3、单克隆抗体的概念及特点由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞
8、群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体特异性强、灵敏度高。4、制备单克隆抗体的关键思路（1）克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群。（2）将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞。要点诠释: 用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的原因:每一个B淋巴细胞只能分泌一种特异性抗体；不同种类的B淋巴细胞分泌的抗体不同。B淋巴细胞在体外培养时不能无限增殖；骨髓瘤细胞能够无限增殖。 5、单克隆抗体的制备过程要点诠释:单克隆抗体制备过程中的筛选及原因(1)第一次筛选是在B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合之后，因为有三种融合情况：B淋巴细胞与B淋巴细胞融合、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合、B淋
9、巴细胞与骨髓瘤细胞融合，而只有B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞才是需要的杂种细胞。(2)第二次筛选需先在多孔培养皿上培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是由单个杂交瘤细胞克隆来的，所以产生的抗体一定是化学性质单一、特异性强的单克隆抗体。特别提醒：上述B淋巴细胞为经过免疫的B淋巴细胞。6、单克隆抗体的优点及其应用(1)优点 特异性强、灵敏度高、优越性明显(2)应用临床诊断：例如：用单克隆抗体对血清中甲脂蛋白水平的测定可以诊断肝癌。用单克隆抗体测定人体绒毛膜中促性腺激素和白细胞T200，可以诊断人体恶性淋巴瘤。在传染病的诊断上使用单克
10、隆抗体不但诊断准确，还可以大大缩短诊断时间。作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤。要点四：植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振动、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体要点五：动物细胞核移植技术和克隆动物 1、动物核移植技术的概念将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。2、原理：细胞核的全能性
11、要点诠释:动物体细胞移植依据的原理还是细胞的全能性，与植物组织培养一样属于无性生殖。虽然细胞核内具有发展成为一个完整个体所需的全套基因，但动物体细胞分化程度较高，因此很难表达全能性。卵细胞体积大，易于操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。将体细胞核移植入去核卵细胞内，既保证了重组细胞的完整性，又能刺激体细胞核表达其全能性，发展成为一个新的个体。动物体细胞移植产生的新个体的亲本有三个：体细胞核供体、卵细胞细胞质供体、代孕母体。新个体细胞核基因型与体细胞核供体完全一样，因此新个体性状与体细胞核供体基本相同。卵细胞细胞质中也有少量的DNA，新个体性状与卵细胞细胞质供体有一些地方相同。代孕母
12、体没有为新个体提供遗传物质，新个体性状与代孕母体基本没有联系。3、过程要点诠释:核移植时，一般先用电刺激使供受体细胞融合，再用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。接受细胞核的卵母细胞必须体外培养到减数第二次分裂中期，原因是此期细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管可将二者一并吸出，并且此时使细胞核的全能性表现出来的物质已近成熟。克隆动物的性状与核供体生物的性状基本相同，而不是完全相同，因为克隆动物的细胞质遗传物质来自于受体卵母细胞；生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。【典型例题】类型一：动物细胞培养例1、（2014 浙江高考）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（）
13、A、连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型 B、某些癌细胞在合适条件下能逆转为正常细胞 C、由多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆 D、未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状【答案】B【解析】解：A、连续细胞系的细胞一般都培养了多次，二倍体核型发生了改变，故A选项错误； B、细胞癌变是基因突变引起的，如细胞在一定条件下发生基因突变，有可能使癌细胞恢复成正常细胞，故B选项正确；C、一个克隆是指1个细胞经培养形成的细胞群，故C选项错误；D、未经克隆化培养的细胞系可能是由多个能无限增殖的细胞增殖来的，不一定具有相同的性状，故D选项错误【点评】本题考查动物细胞培养。【举一反三】：【变式一】现将“细胞工程
14、”中动、植物细胞培养技术列表比较如下，你认为哪一项比较有错误()比较项目原理培养基区别结果培养目的植物组织培养细胞的全能性需加植物激素培育成植株快速繁殖，培育无病毒植株等动物细胞培养细胞的全能性需加动物血清培养成细胞系或细胞株获得细胞或细胞的产物等A.原理B培养基区别 C结果 D培养目的【答案】A【解析】本题考查的是植物组织培养和动物细胞培养相关知识的比较，动物细胞培养的目的是获得更多细胞或细胞产物。而不是获得个体，其原理只涉及细胞增殖(细胞分裂)【误区警示】误认为动物细胞培养也是为了获得一个完整的个体，而得出错误答案“D”，但却忽略了动物细胞培养只是为了得到细胞或细胞产物，它用到的原理也只是
15、细胞增殖。【变式二】下列有关植物组织培养和动物细胞培养的比较中，叙述错误的是()A所用的培养基的成分基本相同B植物组织培养的结果是培育成植株，动物细胞培养的结果是培育成很多细胞C植物组织培养的目的是为了快速繁殖和获得无病毒的植株，动物细胞培养的目的是为了获得细胞产物或细胞D植物组织培养的原理是细胞的全能性，动物细胞培养的原理是细胞的增殖【答案】A【解析】对动物细胞培养和植物组织培养的知识理解程度不够，造成了概念上的混淆，认为动物细胞培养和植物组织培养具体过程相差不大，故误选B或C或D。动植物细胞培养时培养基的成分差别较大，动物培养基需加入血清，植物培养基需加入激素和琼脂。【变式三】动物细胞工程
16、技术的基础是（）A动物细胞融合B胚胎移植C动物细胞培养D核移植【答案】C类型二：动物细胞融合 例2、（2015 安徽高考）科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子IX医用蛋白，其技术路线如图。（1） 由过程获得的A为 。（2） 在核移植前，必须先去掉受体卵母细胞的核。目的是 ，受体应选用 期卵母细胞。（3） 进行胚胎移植时，代孕母羊对移入子宫的重组胚胎基本上不发生 ，这是为重组胚胎在代孕母羊体内的存活提供了可能。（4） 采用胎儿成纤维细胞进行转基因体细胞克隆，理论上可获得无限个转基因绵羊，这是因为 。【答案】II（1）含目的基因的表达载体 （2）保证
17、核遗传物质来自含目的基因的成纤维细胞 MII中 （3）免疫排斥反应 （4）整合有目的基因的成纤维细胞可进行传代培养【解析】II（1）经过分析可知，过程表示构建基因表达载体，（2）对卵母细胞去核的目的是保证后代的遗传物质全部来自目的基因的成纤维细胞，受体应选用减数第二次分裂中期（3）原因是代孕母羊对放入子宫的重组胚胎基本上不发生免疫排斥反应。（4）转基因体细胞克隆属于无性繁殖，细胞能经过船代培养不断增殖，而且遗传物质一般不会改变。【点评】本题考查转基因绵阳的培育过程。【举一反三】：【变式一】能使动物细胞融合的特有的诱导因素是()A离心B灭活的病毒C电刺激 D振动【答案】B【变式二】在动物细胞融合
18、和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同【答案】B【变式三】关于应用动物细胞工程技术获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤如下，其中对单克隆抗体制备的相关叙述中不正确的是 ()将X抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞利用促细胞融合因子使两种细胞发生融合将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔培养筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞从腹水中提取抗体A实验顺序应当是B过程中产生多个杂交瘤细胞的过程也为克隆C过程获得的细胞均可无限增殖D到的过程中通常要经过两次筛选【答案】C【解析】解答本题的关键是知道单克隆抗体制备的过程，理解其原理。只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的融合体才可以无限增殖。