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1、真菌常用的体外药敏试验真菌常用的体外药敏试验方法比较方法比较1真菌药敏试验临床难以开展的原因 1.按照NCCLS推荐的稀释法,操作繁琐 2.有些药只能用于某种菌的抗菌活性测定 3.纸片法试验未得到NCCLS 认可 4.E试验价钱太贵 5.药敏孵育时间因菌种而不同2体外敏感试验与临床治疗相关性w真菌体外药敏试验结果与口咽部真菌感染结果相关性好w对于深部的真菌感染，抗真菌药物敏感性试验同临床治疗的相关性还有待进一步证实 w体外敏感试验没有考虑到真菌对抗真菌药物在体内的动力学和复杂的生物学作用 3真菌体外药物敏感试验方法真菌体外药物敏感试验方法 wNCCLSM27-A：常量肉汤稀释法，微量肉汤稀释法
2、 wE-test法 wNCCLS M44-P纸片扩散法(仅限氟康唑)w丹麦Rosco纸片扩散法(NCCLS未认可)4 真菌体外药敏用培养基 w 常量肉汤和微量肉汤法RPMI1640液制备：液制备：w RPMI 10.4g MOPS（三氮吗啡啉丙磺酸）34.53 g 蒸馏水900ml溶解后，用1M NaOH调节PH至7.0（25），用蒸馏水溶至1000ml，高压灭菌后，冷却至50 加入RPMI1640用0.22m滤膜抽滤除菌，4保存。5真菌体外药敏用培养基 w E-test法法：在RPMI液体培养基中补充葡萄糖，使其终浓度为2%。wNCCLS纸片扩散法纸片扩散法：Mueller-Hinton 琼
3、脂 补充2%葡萄糖和0.5g/ml美蓝 w丹麦丹麦ROSCO纸片扩散法纸片扩散法：改良的SHADOMY（PH7.0）培养基 主要成分：酵母粉，葡萄糖，天冬氨酸，磷酸缓冲液等。6菌液制备将受试菌在沙保罗培养基上转种，以保证其纯度和活性。用0.85%的盐水制成酵母菌悬液，调整其浊度达到0.5麦氏比浊标准（约为15106CFU/ml）。常量稀释法：用RPMI1640液体稀释2000倍 接种浓度约为0.52.5103CFU/ml 微量稀释法：用RPMI1640液体稀释1000倍 接种浓度约为15103CFU/mlE-test法和NCCLS纸片扩散法：用菌液浊度为0.5麦氏单位。Rosco纸片扩散法：1
4、.念珠菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀(15105CFU/ml)2.隐球菌属：1.0麦氏浊度3.其它酵母菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释 7常量肉汤法常量肉汤法(M27-A)w先将氟康唑粉末溶于蒸馏水，然后用配制好的RPMI1640液倍比稀释，使其起始浓度为640g/ml,终末浓度为1.25g/ml，分装无菌洁净的12mm75mm试管：64321684210.5.25.125前10管：0.2ml氟康唑1.8ml菌液念珠菌属 35 孵育48小时新型隐球菌 72小时 读取MIC结果2ml菌液1.8ml16408常量稀释法常量稀释法 药敏结果判定 w 氟康唑，伊曲康唑，两性霉素为100%
5、抑制w其他唑类药物为80%抑制（取0.2ml的生长对照菌液加入0.8mlRPMI液体培养基的菌液浓度）w质控株 克柔念珠菌ATCC 6258 近平滑念珠菌ATCC 22019 白念珠菌ATCC 90028 白念珠菌ATCC 24433 9微量肉汤法微量肉汤法 w氟康唑的稀释方法同常量法，但起始浓度为2常量法的浓度（即128g/ml），终浓度为0.25g/ml。37。376432168421.5.25.125氟康唑：1-10孔分别为 100ul菌悬液：1-10孔分别为 100ul200ulRPMI汤200ul菌悬液 35 新型隐球菌72小时，其余菌株 48小时读取MIC结果10酵母菌的NCCLS
6、 M27-A各药物折点粘膜及系统性感染：w氟康唑（除克柔念珠菌）敏感：8g/mlw w 中介：w 耐药：64g/ml粘膜感染：w伊曲康唑 敏感：0.125g/mlw w 中介：w 耐药：1g/ml粘膜及系统性感染：w5-氟嘧啶 敏感：4g/mlw w 中介：816g/ml w 耐药：32g/ml11 酵母菌酵母菌E-test法法 瑞典瑞典AB Biodisk 优点：有较好的重复性和稳定性优点：有较好的重复性和稳定性 MIC12E-test法法 0.5麦氏比浊液（约为15106CFU/ml）。菌悬液均匀涂布于药敏板上 35 培养24小时读取结果 光滑念珠菌 新型隐球菌等生长较慢的菌种需适当延长培
7、养时间。13E-test法评价法评价 w准确性高,且操作简便 wE-test法得到的MIC值在某些菌种中要低于NCCLS推荐的常量肉汤稀释法测得的MIC w20%浓度CO2的环境中，可使此方法的结果更真实反映药物对致病菌的敏感性 缺点：缺点：1.价格太高价格太高 每片每片40-50元元 2.吡咯类吡咯类MIC终点不好确定终点不好确定14酵母菌纸片扩散法敏感试验酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P.2003 培养基：培养基：Mueller-Hinton琼脂琼脂 补充补充 2 Glucose 0.5ug/ml Methylene blue dye PH7.2-7.4优点：有较好的重复性
8、和稳定性优点：有较好的重复性和稳定性 操作简便，价廉操作简便，价廉缺点：目前只限氟康唑缺点：目前只限氟康唑 15NCCLS纸片扩散法纸片扩散法 w0.5麦氏比浊标准（约为15106CFU/ml）。菌悬液均匀涂布于药敏板上w步骤同细菌敏感试验操作一致，w 3537孵育1824小时，w 对于生长缓慢的菌株如新型隐球菌，菌液需 调至1麦氏单位，孵育48小时，w 光滑念珠菌也需孵育48小时读取抑菌环直径。16酵母菌纸片扩散法敏感试验酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P.2003 氟康唑解释标准和相应的最小抑菌浓度抑菌环直径（mm)MIC（ug/ml)敏感（S)=19=8剂量依赖性敏感（SD
9、D)15-1816-32耐药（R)=64SSusceptible SDD=SusceptibleDose Dependent R=Resistant 17酵母菌纸片扩散法敏感试验酵母菌纸片扩散法敏感试验 NCCLS M44-P.2003氟康唑对标准菌株氟康唑对标准菌株 24h抑菌环直径（抑菌环直径（mm)的质控允许范围的质控允许范围标准菌株标准菌株氟康唑氟康唑25ug 沃尔康唑沃尔康唑1ug白念珠菌白念珠菌 ATCC9002828-39 31-42近平滑念珠菌近平滑念珠菌 ATCC2201922-33 28-37热带念珠菌热带念珠菌 ATCC75026-37 克柔念珠菌克柔念珠菌ATCC625
10、8 16-25 18ROSCO纸片扩散法纸片扩散法 ROSCO纸片扩散法：1.克柔念珠菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：10稀释菌液为5105CFU/ml2.隐球菌属：1 麦氏浊度3.其它酵母菌：0.5麦氏浊度，生理盐水1：1稀释菌液为2.5106CFU/mlw将稀释好的菌液涂布在改良的SHADOMY（PH7.0）培养基上w其它操作同细菌。19 w 读取抑菌环直径近似到mm w 在大约80%抑制区为测量边界w 在抑菌环内个别细小或中等大小的菌落，15可忽略不计 Rosco纸片扩散法纸片扩散法药敏结果判定 20两种纸片扩散法的比较wRosco纸片扩散法w检测菌种 念珠菌属，隐球菌属w培养基 改良S
11、HADOMY琼脂，PH7.0w试验药品及剂量 AMB 10g，IT 8g，FLA 15g，FC 1，10g，FC 10g，KET15g等w接种的菌量：5105CFU/ml（克柔念珠菌先制成 0.5麦氏浊度，再用生理盐水1：10。隐球菌属配1.0麦氏不稀释）其它菌种配0.5麦氏浊度，1：1稀释w培养条件 念珠菌属35培养1824小时，新型隐球菌30培养4248小时w结果判读 FC及AMB100%被抑制 唑类药物80%抑制 w质控株 光滑念珠菌2238NL 白念珠菌ATCC64548 白念珠菌ATCC64550wNCCLS纸片扩散法w 检测菌种 念珠菌属，隐球菌属w培养基 Mueller-Hint
12、on 琼脂中补充2%的 葡萄糖和0.5g/ml的美蓝w试验药品及剂量 FLA 25gw接种的菌量 1 5106/mLw隐球菌 1.0麦氏浊度w培养条件 35 孵育1824小时 新型隐球菌培养4248小时w结果判读 FC及AMB100%被抑制，唑类药物80%抑制w质控株 白念珠菌ATCC90028 近平滑念珠菌ATCC22019 21Rosco纸片扩散法各药物折点w粘膜酵母菌感染氟康唑，克霉唑，酮康唑，氟胞嘧啶1ug，特比奈吩，咪康唑等 敏感：20mm 中介：1219mm 耐药：11mm两性霉素B，制霉菌素伊曲康唑 敏感：15mm 中介：1014mm 耐药：无抑菌环氟胞嘧啶10ug 敏感：30m
13、m 用于黑曲霉 中介：2329mm 耐药：22mm灰黄霉素 敏感：10mm 中介：耐药：无抑菌环22 w系统性酵母菌感染氟康唑15ug 18-24h 敏感：30mm 4 中介：2923mm 8-16耐药：22mm 32 伊曲康唑 8ug 18-24h 敏感：20mm 0.06中介：1912mm 0.125耐药：11mm 0.25 这个MIC标准为纸片法的相应值 Rosco纸片扩散法各药物折点23 系统性酵母菌感染 酮康唑 15ug 纸片和培养基广州乐通公司可供应 敏感：30mm 0.12中介：23-29 0.25耐药：22mm 0.5 两性霉素 10ug 敏感：15mm 1中介：14-10 2 耐药：9mm 4氟胞嘧啶1ug 敏感：20mm 4中介：12-19 8-16耐药：11mm 32氟胞嘧啶10ug用于黑曲霉 敏感：30mm 4中介：23-29 8-16耐药：22mm 32 Rosco纸片扩散法各药物折点24氟孢嘧啶氟康唑-制霉菌素 伊曲康唑两性霉素B克霉唑-特比奈酚特比奈酚25结论w1.常量稀释法难以推广w2.微量板浪费w3.NCCLS纸片法只做氟康唑 w4.建议目前用Rosco纸片w5.寄希望将来推行Etest 法26