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1、第五章第五章 植物离体微繁植物离体微繁 主要内容：主要内容：1.植物离体微繁植物离体微繁2.影响植物离体微繁成功的因素影响植物离体微繁成功的因素3.植物离体微繁过程中常见异常现象及对策植物离体微繁过程中常见异常现象及对策1植物有哪些繁殖方法？植物有哪些繁殖方法？思思 考考:2分株繁殖分株繁殖压条繁殖压条繁殖播种繁殖播种繁殖 嫁接繁殖嫁接繁殖3扦插繁殖扦插繁殖组织培养繁殖组织培养繁殖41.植物离体微繁植物离体微繁 植物离体微繁植物离体微繁(micropropagation)：是指利用植物组织培养技术进行的：是指利用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法，是常规营养繁殖方法的一种扩展和延伸一种营养
2、繁殖方法，是常规营养繁殖方法的一种扩展和延伸。是在短期内。是在短期内获得大量遗传性状一致的个体的方法。属获得大量遗传性状一致的个体的方法。属离体无性繁殖离体无性繁殖(propagation in vitro)。又称为快速繁殖（。又称为快速繁殖（rapid cloneprogagation）。）。5植物离体微繁的特点植物离体微繁的特点1.繁殖系数高，繁殖周期短，繁殖速度快：它的繁殖系数高，繁殖周期短，繁殖速度快：它的高速度高速度是以下三种因素构是以下三种因素构成的：成的：有较高的增殖倍数有较高的增殖倍数;较短的增殖周期；较短的增殖周期；周年生产。周年生产。2.应用广泛，是推广良种的重要手段：占用
3、空间小，生产效率高，省时、应用广泛，是推广良种的重要手段：占用空间小，生产效率高，省时、省工、节约土地。省工、节约土地。3.繁殖材料用量少，不受季节限制，可实现工厂化生产；繁殖材料用量少，不受季节限制，可实现工厂化生产；4.能获得无毒苗木无性系能获得无毒苗木无性系5.木本植物应用潜力大：繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。木本植物应用潜力大：繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。6 1.1 植物离体微繁过程植物离体微繁过程n第一阶段第一阶段 稳定无菌培养体系的建立时期稳定无菌培养体系的建立时期n第二阶段第二阶段 稳定培养系的增殖、生长和增状时期稳定培养系的增殖、生长和增状时期n第三阶段第三阶段
4、诱导茎芽生根形成小苗时期诱导茎芽生根形成小苗时期n第四阶段第四阶段 生根小苗移栽和驯化时期生根小苗移栽和驯化时期n第五阶段第五阶段 商品苗培育时期商品苗培育时期7第一阶段：稳定无菌培养体系的建立时期第一阶段：稳定无菌培养体系的建立时期 任何植物细胞或组织培养体系的建立，都必须任何植物细胞或组织培养体系的建立，都必须采制适宜的外植体采制适宜的外植体。外植体的选择有什么要求呢？外植体的选择有什么要求呢？第一，选择优良的种质：第一，选择优良的种质：易于离体培养的种类易于离体培养的种类、品种、类型；、品种、类型；生产或研究上意生产或研究上意义比较大的种类、品种、类型。义比较大的种类、品种、类型。第二，
5、选择健壮的植株：第二，选择健壮的植株：第三，选择合适的部位第三，选择合适的部位 茎尖：生长速度快，遗传稳定，茎尖：生长速度快，遗传稳定，无病毒分布。但材料来源有限，为此茎段也是重无病毒分布。但材料来源有限，为此茎段也是重要来源。要来源。叶片：叶片：采用幼嫩的叶片较好。如：秋海棠、矮牵牛、菊花等。采用幼嫩的叶片较好。如：秋海棠、矮牵牛、菊花等。花（花蕾）：花（花蕾）：据一些学者的观点，在花诱导之前细胞的脱分化容易发生，故外据一些学者的观点，在花诱导之前细胞的脱分化容易发生，故外植体常取发育早期阶段的花，即花蕾。植体常取发育早期阶段的花，即花蕾。胚：胚：大多数花卉都可用胚培养的方式进行快繁，如：百
6、合、羽叶甘蓝、蝴蝶大多数花卉都可用胚培养的方式进行快繁，如：百合、羽叶甘蓝、蝴蝶兰、卡特兰等。兰、卡特兰等。8外植体的选择外植体的选择第四，取材季节合理：第四，取材季节合理：选取外植体的季节和时间，对培养材料的启动和培养至关重要。选取外植体的季节和时间，对培养材料的启动和培养至关重要。一般在生长季一般在生长季春夏。春夏。第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；第六，选择大小合适的外植体；第六，选择大小合适的外植体；外植体过大，不易灭外植体过大，不易灭菌，过小，不易成活。一般菌，过小，不易成活。一般0.5-1cm；脱毒培养；脱毒培养0.2-0.5cm。9外植体的灭
7、菌外植体的灭菌 无菌的外植体材料是植物组织培养成功的重要前提与可靠保证，而消毒无菌的外植体材料是植物组织培养成功的重要前提与可靠保证，而消毒则是获得无菌外植体的有效方法。取来的外植体需要经过仔细的表面灭菌处则是获得无菌外植体的有效方法。取来的外植体需要经过仔细的表面灭菌处理，外植体灭菌常用消毒剂。理，外植体灭菌常用消毒剂。消毒注意事项：消毒注意事项：1.正确选择消毒剂种类及浓度、消毒时间，减少组织的死亡正确选择消毒剂种类及浓度、消毒时间，减少组织的死亡.2.在用消毒剂对材料表面消毒后，必须用无菌水漂洗在用消毒剂对材料表面消毒后，必须用无菌水漂洗3次以上以除去残留杀次以上以除去残留杀菌剂，但用酒
8、精消毒时，则不必漂洗。菌剂，但用酒精消毒时，则不必漂洗。3.与消毒剂接触过的切面在转移至无菌基质前需切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞与消毒剂接触过的切面在转移至无菌基质前需切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。对基质中营养物质的吸收。4.在外植体污染严重时，应用流水漂洗在外植体污染严重时，应用流水漂洗1h以上或先种子培养得到无菌种苗，以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。然后用其各个部分建立组织培养。5.Hgcl2效果最好，但较难从外植体去除，效果最好，但较难从外植体去除，对人的伤害也最大，用后要用水冲洗至少对人的伤害也最大，用后要用水冲洗至少5次。次。10
9、外植体的接种和培养外植体的接种和培养外植体的接种外植体的接种无菌操作无菌操作 外植体表面灭菌外植体表面灭菌切取分离切取分离无菌培养基无菌培养基外植体的培养外植体的培养 光照、温度、湿度、培养基光照、温度、湿度、培养基pH、气体调节、气体调节11接种材料修整与冲洗接种材料修整与冲洗12材料表面灭菌材料表面灭菌131.叶片叶片0.5cm0.5cm2.微茎尖微茎尖0.2-0.5mm3.带节茎段带节茎段0.5-1.0cm外植体切割外植体切割4.芽丛分离芽丛分离14 顶梢切割成顶梢切割成0.51.0cm的茎尖；的茎尖；（除叶（除叶,剥去休眠芽的鳞片剥去休眠芽的鳞片)；茎尖流水冲洗茎尖流水冲洗24h；75
10、%酒精迅速漂洗酒精迅速漂洗30s；0.1%升汞或稀释升汞或稀释20倍的次氯酸钠液消毒倍的次氯酸钠液消毒58min(取自老枝条上的可适取自老枝条上的可适当延长时间当延长时间)；无菌水冲洗无菌水冲洗3-5次。次。材料处理及消毒材料处理及消毒15外植体接入培养基外植体接入培养基 16 注意注意无菌培养体系的建立需注意下面两个问题：无菌培养体系的建立需注意下面两个问题：1.采样和表面灭菌；采样和表面灭菌；2.首次接种污染率的估算与对策：首次接种污染率的估算与对策：首次接种，小容器，多数量，尽首次接种，小容器，多数量，尽量分散，互相隔离，效果最好。量分散，互相隔离，效果最好。17 从植物组织培养积累的知
11、识中，可将从植物组织培养积累的知识中，可将植物再生过程划分为四种方式：植物再生过程划分为四种方式：1)顶芽和腋芽的发育顶芽和腋芽的发育2)不定芽的发育不定芽的发育3)体细胞胚状体的发生与发育体细胞胚状体的发生与发育4)原球茎的发育原球茎的发育第二阶段：稳定培养系的增殖、生长和增第二阶段：稳定培养系的增殖、生长和增状时期（诱导外植体生长与分化）状时期（诱导外植体生长与分化）18 1)顶芽和腋芽的发育顶芽和腋芽的发育 顶芽和腋芽在离体培养中都可被诱导而发育。顶芽和腋芽在离体培养中都可被诱导而发育。从芽萌发出苗，即枝条，枝条向上延伸，新形成的芽将逐渐发育。从芽萌发出苗，即枝条，枝条向上延伸，新形成的
12、芽将逐渐发育。如果将新形成的芽切割下来，使之再萌发出新的枝条，在适当的条件下如果将新形成的芽切割下来，使之再萌发出新的枝条，在适当的条件下使枝条生根，并种植到土壤中去，便完成了植物再生的全过程。使枝条生根，并种植到土壤中去，便完成了植物再生的全过程。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时只能采用顶芽，侧芽或带有芽适宜这种再生繁殖的植物，在采样时只能采用顶芽，侧芽或带有芽的茎切段，其它如种子，萌发后取枝条等也可以。的茎切段，其它如种子，萌发后取枝条等也可以。19幼嫩茎尖幼嫩茎尖营养芽营养芽20 茎尖培养茎尖培养n在顶芽的培养中，还有较为特殊的一种方式在顶芽的培养中，还有较为特殊的一种方式，即采用极其幼
13、嫩的顶芽的，即采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织为材料，由它作为外植体。过去常被称为茎尖分生组织为材料，由它作为外植体。过去常被称为“分生组织培养分生组织培养”，但目前多数学者认为以称作但目前多数学者认为以称作“茎尖培养茎尖培养”为宜。为宜。n真正的茎尖分生组织是被限制在一极小的范围内，那里的细胞几乎没有真正的茎尖分生组织是被限制在一极小的范围内，那里的细胞几乎没有分化，在活跃地进行细胞分裂，保持着强烈的再生分化能力，这个部分不分化，在活跃地进行细胞分裂，保持着强烈的再生分化能力，这个部分不包括叶原基，处于茎的极顶尖处。包括叶原基，处于茎的极顶尖处。21根据培养目的和取材大小分为：根据培养目的和
14、取材大小分为：u 微茎尖培养微茎尖培养u 普通茎尖培养普通茎尖培养 茎尖培养类型茎尖培养类型22普通茎尖指几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽普通茎尖指几毫米到几十毫米的芽尖及侧芽23微茎尖为微茎尖为0.3-0.5mm24普通茎尖培养方法普通茎尖培养方法取取材材材材料料处处理理及及消消毒毒培培 养养接接种种驯驯化化移移栽栽25直接取材：直接取材：在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株在生长旺盛、枝条健壮、无病的母株上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（上选生长不久、杂菌污染少的顶梢（12cm）（取前可喷杀菌药），取顶芽）（取前可喷杀菌药），取顶芽或侧芽。或侧芽。从试管苗获取。从试管苗获取。取取 材材取取1-2顶梢
15、顶梢26 茎尖培养时需要注意的问题茎尖培养时需要注意的问题n一般都采用稍大一些的茎尖来培养。一般都采用稍大一些的茎尖来培养。之所以用茎尖培养，是为了脱之所以用茎尖培养，是为了脱除病毒病的危害，因为只有茎尖未受病毒侵染。除病毒病的危害，因为只有茎尖未受病毒侵染。n如果是经过病毒鉴定的母株，或该种植物有无病毒并不在考虑之中，如果是经过病毒鉴定的母株，或该种植物有无病毒并不在考虑之中，当然最好是采用腋芽，或带腋芽的茎切段。过小的茎尖只有很低的当然最好是采用腋芽，或带腋芽的茎切段。过小的茎尖只有很低的存活率，并且最初生长太慢。存活率，并且最初生长太慢。n如果某些植物具有比较强的顶端优势，那么在培养中也
16、同样有所表如果某些植物具有比较强的顶端优势，那么在培养中也同样有所表现，往往顶芽抑制侧芽的萌发，这样总是获得分枝很少的独立的枝现，往往顶芽抑制侧芽的萌发，这样总是获得分枝很少的独立的枝条，限制了繁殖的速度，通常采取条，限制了繁殖的速度，通常采取切除顶芽切除顶芽和和适当增加细胞分裂素适当增加细胞分裂素两项措施加以克服。两项措施加以克服。27 茎段培养过程茎段培养过程 将经过表面消毒的茎段在无菌条件下，切成几厘米长带芽的节段，将经过表面消毒的茎段在无菌条件下，切成几厘米长带芽的节段，接种在固体培养基上。经过培养后，茎段可直接发生不定芽，或先诱导接种在固体培养基上。经过培养后，茎段可直接发生不定芽，
17、或先诱导形成愈伤组织，再脱分化形成再生苗。把再生苗进行切割，转接到生根形成愈伤组织，再脱分化形成再生苗。把再生苗进行切割，转接到生根培养基上培养，便可得到完整的小植株。培养基上培养，便可得到完整的小植株。28 图示茎段培养过程图示茎段培养过程健康植株上选健壮的枝梢健康植株上选健壮的枝梢去叶片用自来水冲洗去叶片用自来水冲洗 再生再生培养培养MS培养基培养基75%酒精酒精1分钟分钟1%次氯酸钠次氯酸钠0.1%升汞升汞292)不定芽的发育不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽分化，通常经历两个不同的生长时期：在培养中由外植体产生不定芽分化，通常经历两个不同的生长时期：首先外植体要经首先外植体要经脱
18、分化脱分化过程，形成或不形成愈伤组织；过程，形成或不形成愈伤组织；第二步由已脱分化的细胞或新形成的愈伤组织细胞，第二步由已脱分化的细胞或新形成的愈伤组织细胞，再分化再分化形成一些形成一些分生细胞团。然后由这些分生组织形成器官原基，在构成器官的纵轴上表分生细胞团。然后由这些分生组织形成器官原基，在构成器官的纵轴上表现出单向的极性。现出单向的极性。30 3)体细胞胚状体的发生与发育体细胞胚状体的发生与发育n体细胞胚状体体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它
19、是由，最终发育成小苗。但它是由体细胞体细胞发发生的。生的。n通过体细胞胚状体的发生，来进行无性系的大量繁殖具有极大的潜力。通过体细胞胚状体的发生，来进行无性系的大量繁殖具有极大的潜力。其特点是：成苗数量多，速度快，结构完整。其特点是：成苗数量多，速度快，结构完整。31 体细胞胚状体的发生方式体细胞胚状体的发生方式 胚状体产生的五种方式：胚状体产生的五种方式：由外植体的表皮细胞直接产生胚状体；由外植体的表皮细胞直接产生胚状体；由外植体组织内部的细胞产生胚状体；由外植体组织内部的细胞产生胚状体；由愈伤组织的表面细胞产生胚状体；由愈伤组织的表面细胞产生胚状体；由胚性细胞复合体的表面细胞产生胚状体；由
20、胚性细胞复合体的表面细胞产生胚状体；由单个游离细胞直接产生胚状体。由单个游离细胞直接产生胚状体。324）原球茎的发育）原球茎的发育 大部分兰花的培养属于这一类型。大部分兰花的培养属于这一类型。原球茎特点原球茎特点:缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。的器官。原球茎是一种类胚组织，培养兰花的茎尖或腋芽可直接产生原球原球茎是一种类胚组织，培养兰花的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，继而分化成植株，也可继代增殖为原球茎。茎，继而分化成植株，也可继代增殖为原球茎。特点：特点：受材料的局限性较大。受材料的局限性较大。33 初代培养初代培养旨在获得
21、无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。小结小结34 在初代培养的基础上所获得的在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还等，数量都还不多，也难以直接种植到栽培介质中去，这些培养的材料可统称为不多
22、，也难以直接种植到栽培介质中去，这些培养的材料可统称为中间繁中间繁殖体殖体，它们需要进一步培养增殖，使之越来越多，才能发挥快速繁殖的优，它们需要进一步培养增殖，使之越来越多，才能发挥快速繁殖的优势。势。在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。分流
23、，生产出成品。第三阶段：第三阶段：诱导茎芽生根形成小苗时期诱导茎芽生根形成小苗时期35n继代培养继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。n继代培养的后代继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么株苗为基础，那么经经10代将生成代将生成210株苗。株苗。n增殖使用的培养基增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最
24、良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。的竞争，所以能够按几何级数增殖。继代培养继代培养36n继代培养中扩繁的方法包括：继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。继代培养中扩繁的方法继代培养中扩繁的方法37 在在中间繁殖体中间繁殖体增殖到一定数量后，就使部分培养物分流，进入壮苗与增殖到一定数量后，就使部分培养物分流，进入壮苗与生根途径。生根途径。试管内生根或壮苗阶段的意义：试管内生根或壮苗阶段的意义：试管内生根或壮苗
25、的阶段，目的是为试管内生根或壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，也是使试管苗适应外部环境的一个了成功地移植到试管外的环境中，也是使试管苗适应外部环境的一个过渡过渡时期。时期。在生根壮苗培养基上，在生根壮苗培养基上，大多数植物要分离成单苗，有的可分成小丛苗，大多数植物要分离成单苗，有的可分成小丛苗，转移培养后应停止增殖，迅速生根，同时苗也长高了，以后便于移栽。转移培养后应停止增殖，迅速生根，同时苗也长高了，以后便于移栽。38 茎芽生根诱导的途径：茎芽生根诱导的途径：1、是试管（瓶）内生根、是试管（瓶）内生根2、是试管（瓶）外生根、是试管（瓶）外生根 395.2.3.1试管内生根试管
26、内生根 将长到一定长度的微枝转移到生根培养基上继续培养。（将长到一定长度的微枝转移到生根培养基上继续培养。（IBA NAA）植物离体培养产生的跟为不定根，依据根形成的部位又分为皮部根和愈伤根。植物离体培养产生的跟为不定根，依据根形成的部位又分为皮部根和愈伤根。40 思考思考:皮部根和愈伤根哪个利于组织培养？为什么皮部根和愈伤根哪个利于组织培养？为什么41 判断试管苗生根好坏依据：判断试管苗生根好坏依据：1、根系质量（粗度、长度）、根系质量（粗度、长度）2、根系数量（条数，毛细根）、根系数量（条数，毛细根）42 5.2.3.2 试管外生根试管外生根试管外生根技术是将组织培养茎芽的生根诱导同驯化培
27、养结合试管外生根技术是将组织培养茎芽的生根诱导同驯化培养结合在一起，直接将茎芽扦插到试管外有菌环境中，边诱导生根边在一起，直接将茎芽扦插到试管外有菌环境中，边诱导生根边驯化培养。驯化培养。优势：优势：1、试管外生根苗比试管内生根苗生理活性更好；、试管外生根苗比试管内生根苗生理活性更好；2、经济成本相对试管内生根要低很多、经济成本相对试管内生根要低很多43 第四阶段：生根小苗移栽和驯化时期第四阶段：生根小苗移栽和驯化时期44 试管苗的特点及移栽试管苗的特点及移栽 从以下三个方面讲述从以下三个方面讲述:1.试管苗的生长环境；试管苗的生长环境；2.试管苗的弱点；试管苗的弱点；3.克服弱点，提高移栽成
28、活率的措施。克服弱点，提高移栽成活率的措施。45试管苗的生长环境试管苗的生长环境无菌无菌 异养异养 高温高温 弱光弱光 恒湿恒湿46 试管苗由于是试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度、近在无菌、有营养供给、适宜光照和温度、近100的相的相对湿度环境条件下生长的，对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。所以必须通过的正常小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗炼苗，例如通过控水、减肥、，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组增光、降温等措施，使它们逐渐地适
29、应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。顺利移栽成功。克服弱点，提高移栽成活率的措施克服弱点，提高移栽成活率的措施47移栽前的准备移栽前的准备A.试管苗壮苗试管苗壮苗 加入生长控制剂，加入生长控制剂，如多效唑，如多效唑，B9（丁酰肼），（丁酰肼），CCC（矮壮素），（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。48 B.试管苗炼苗试管苗炼苗 移栽前可将培养物不打开瓶移栽前可将培养物不打开瓶口移到自然光照下锻炼口移到自然光照下锻炼2-3d
30、，让，让试管苗接受强光的照射，使其长试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗得壮实起来，然后再开口练苗1-3d，经受较低湿度的处理，以适，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。应将来自然湿度的条件。49 试管苗的移栽试管苗的移栽 试管苗的移栽要注意以下几点试管苗的移栽要注意以下几点;首先，要保持小苗的水分供需平衡首先，要保持小苗的水分供需平衡。第二，要选择恰当的种植介质第二，要选择恰当的种植介质，最要紧的是疏松透气，适宜的保水性，最要紧的是疏松透气，适宜的保水性，容易灭菌处理，不利于杂菌滋生。常用的有粗粒状蛭石、珍珠岩、粗沙、炉容易灭菌处理，不利于杂菌滋生。常用的有粗粒状
31、蛭石、珍珠岩、粗沙、炉灰渣、谷壳灰渣、谷壳(或谷壳灰或谷壳灰)、锯木屑等，或者将它们以一定的比例混合使用。、锯木屑等，或者将它们以一定的比例混合使用。第三，要防止菌类滋生。第三，要防止菌类滋生。试管苗原来的环境是无菌的，种植出来以后难试管苗原来的环境是无菌的，种植出来以后难以保持完全无菌，但应尽量不使菌类大量滋生，以利于试管苗成活。以保持完全无菌，但应尽量不使菌类大量滋生，以利于试管苗成活。第四，要注意一定的光、温条件。第四，要注意一定的光、温条件。一般强度较高的慢射光较好。一般强度较高的慢射光较好。第五，再生植株的鉴定：第五，再生植株的鉴定：是指用细胞学或形态学等方法检查再生植株是是指用细胞
32、学或形态学等方法检查再生植株是否有遗传变异。否有遗传变异。50试管苗的移栽基质试管苗的移栽基质泥泥 炭炭珍珠岩珍珠岩椰椰糠糠51 提高小苗移栽成活率的方法：提高小苗移栽成活率的方法：第一、将小苗分级第一、将小苗分级第二、要进行炼苗第二、要进行炼苗第三、选好定植场所第三、选好定植场所第四、要严格掌握移栽技术，科学确定合适的移栽时间第四、要严格掌握移栽技术，科学确定合适的移栽时间第五、重视移栽后的管理第五、重视移栽后的管理52 提高效益的措施提高效益的措施a.提高技能，提高生产效率；提高技能，提高生产效率；b.减少投资，延长设备使用寿命；减少投资，延长设备使用寿命；c.实施简化培养；实施简化培养；
33、d.节约水电。节约水电。53 5.3植物离体快速繁殖的影响因素植物离体快速繁殖的影响因素54 主要内容主要内容5.3.1 影响组培苗快繁的内因影响组培苗快繁的内因5.3.2 影响组培苗快繁的外因影响组培苗快繁的外因55 5.3.1 影响组培苗快繁的内因影响组培苗快繁的内因5.3.1.1 植物材料（外植体）的影响植物材料（外植体）的影响5.3.1.2 继代培养的次数继代培养的次数5.3.1.3 愈伤组织的遗传特性及其生理状态愈伤组织的遗传特性及其生理状态5.3.1.4 植物离体分化过程类型的影响植物离体分化过程类型的影响565.3.1.1 植物材料（外植体）的影响植物材料（外植体）的影响 外植体
34、的影响包括：外植体的基因型、外植体的类型及其生理状外植体的影响包括：外植体的基因型、外植体的类型及其生理状态、外植体的大小、取材植株的年龄及生理状态等。态、外植体的大小、取材植株的年龄及生理状态等。在植物组织培养中，基因型的影响是非常突出的问题，在植物组织培养中，基因型的影响是非常突出的问题，可能原因：可能原因：基因对激素需求有一定的控制作用。基因对激素需求有一定的控制作用。57 在植物组织培养中一般来说增值能力在植物组织培养中一般来说增值能力 草本草本 木本；木本；被子植物被子植物 裸子植物；裸子植物；年幼材料年幼材料 老年材料；老年材料；刚分离组织刚分离组织 已继代的组织；已继代的组织；胚
35、胚 营养体组织；营养体组织；芽芽 胚状体胚状体 愈伤组织。愈伤组织。58 5.3.1.2 继代培养继代培养(1)形态发生能力的保持或丧失；形态发生能力的保持或丧失；(2)培养中发生的变异培养中发生的变异(3)继代培养时间长短继代培养时间长短(4)季季 节节59(1)形态发生能力的保持或丧失；形态发生能力的保持或丧失；在大多数在大多数以顶芽或腋芽增殖方式繁殖以顶芽或腋芽增殖方式繁殖的植物中，在培养许多代之后，的植物中，在培养许多代之后，仍然保持着旺盛的增殖能力，对于这种类型，似乎不大会出现形态发生仍然保持着旺盛的增殖能力，对于这种类型，似乎不大会出现形态发生能力削弱或丧失的问题，它们完全类似于常
36、规的无性繁殖，只不过微型能力削弱或丧失的问题，它们完全类似于常规的无性繁殖，只不过微型化了而已；化了而已；采用采用细胞培养或愈伤组织培养细胞培养或愈伤组织培养的研究，需要关心着形态发生能力是否的研究，需要关心着形态发生能力是否能持久。能持久。形态发生能力减弱或丧失大多由三个因素造成：形态发生能力减弱或丧失大多由三个因素造成：60形态发生能力减弱或丧失大多由三个因素造成：形态发生能力减弱或丧失大多由三个因素造成：a.愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的愈伤组织中含有从外植体启动分裂时就包括进来的成器官中心成器官中心(分生分生组织组织)，当重复继代时会逐渐减少至丧失当它们不存在时，其它的愈
37、，当重复继代时会逐渐减少至丧失当它们不存在时，其它的愈伤组织难以再诱导形成成器官中心，这些愈伤组织不能形成维管束，伤组织难以再诱导形成成器官中心，这些愈伤组织不能形成维管束，而始终保持着无组织结构的细胞分裂；而始终保持着无组织结构的细胞分裂；b.形态发生潜力的丧失，可能是由于形态发生潜力的丧失，可能是由于内源生长调节物质的减少内源生长调节物质的减少；c.不正常染色体聚集不正常染色体聚集可能会抑制发育过程。可能会抑制发育过程。61(2)培养中发生的变异培养中发生的变异 培养中的细胞团，由于不断的继代使不正常植株产生的频率增加，培养中的细胞团，由于不断的继代使不正常植株产生的频率增加，变异的范围相
38、当广泛。变异的范围相当广泛。表现型变异：表现型变异：叶形态变异，花青素颜色丧失，绒毛丧失，变侏儒，花叶形态变异，花青素颜色丧失，绒毛丧失，变侏儒，花的形态变异等；的形态变异等；染色体数目和结构的改变可以产生变异；染色体数目和结构的改变可以产生变异；细胞核和细胞质的基因突变；细胞核和细胞质的基因突变；核外基因组的分离导致变异；核外基因组的分离导致变异；非遗传的生理适应变异。非遗传的生理适应变异。62(3)继代培养时间长短继代培养时间长短 关于关于继代培养次数对繁殖率的影响继代培养次数对繁殖率的影响报道不一：报道不一：有的材料长期继代可保持原来的再生能力和增殖率，如葡萄；有的材料长期继代可保持原来
39、的再生能力和增殖率，如葡萄；有的经过一定时间继代培养后才有分化再生能力，如沙枣；有的经过一定时间继代培养后才有分化再生能力，如沙枣；有的随继代时间加长而分化再生能力降低，如杜鹃。有的随继代时间加长而分化再生能力降低，如杜鹃。63(4)季季 节节 有些植物材料能否继代与季节有关，主要原因是：有些植物材料能否继代与季节有关，主要原因是：继代中有休眠现象。继代中有休眠现象。645.3.1.3 愈伤组织的遗传特性及其生理状态愈伤组织的遗传特性及其生理状态 其影响主要通过：其影响主要通过：a a、诱导愈伤组织进行离体培养时，培养基的成分及培养条件均能影响愈伤、诱导愈伤组织进行离体培养时，培养基的成分及培
40、养条件均能影响愈伤组织的生理状态，进而影响其再生能力组织的生理状态，进而影响其再生能力 b b、愈伤组织在增殖培养基上培养的时间越久或代数越多，转移到分化培养、愈伤组织在增殖培养基上培养的时间越久或代数越多，转移到分化培养基上，形态发生越困难基上，形态发生越困难 c c、体积大不利于分化、体积大不利于分化一般选取生长旺盛的愈伤组织进行转分化培养一般选取生长旺盛的愈伤组织进行转分化培养 655.3.1.4 芽的增殖途径芽的增殖途径芽及嫩梢的增殖是微繁的关键时期，芽的增殖途径一般有一下芽及嫩梢的增殖是微繁的关键时期，芽的增殖途径一般有一下5 种：种：A、嫩梢扦插增殖途径：又称节培法或微型扦插法，嫩
41、梢扦插增殖途径：又称节培法或微型扦插法，由单芽茎段增殖成苗由单芽茎段增殖成苗。特点：特点：一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，适用范围大，移栽容一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，适用范围大，移栽容易成活。易成活。主要适用主要适用:一些增殖培养比较困难，顶端优势明显或生长迅速，或对组培一些增殖培养比较困难，顶端优势明显或生长迅速，或对组培苗质量要求比较高的木本植物。苗质量要求比较高的木本植物。关键在于外植体芽位的选取关键在于外植体芽位的选取B、丛生芽增殖型丛生芽增殖型 茎尖或初代培养的芽茎尖或初代培养的芽发生腋芽发生腋芽丛生芽。丛生芽。特点：特点：遗传性状稳定，茎尖培养，脱毒苗。遗传性状稳
42、定，茎尖培养，脱毒苗。适合于大规模的商业化生产，也是植物茎尖脱毒培养的必经之路适合于大规模的商业化生产，也是植物茎尖脱毒培养的必经之路665.3.1.4 芽的增殖途径芽的增殖途径C、器官发生型器官发生型 从植物叶片、子房、花药、胚珠、叶柄等诱导出愈伤组织；从愈伤组织从植物叶片、子房、花药、胚珠、叶柄等诱导出愈伤组织；从愈伤组织上诱导不定芽。上诱导不定芽。特点：特点：可创造有益突变体，可能发生变异。可创造有益突变体，可能发生变异。D、胚状体发生型胚状体发生型 从植物叶片、子房、花药、胚珠、未成熟胚等诱导体细胞胚胎发生，从植物叶片、子房、花药、胚珠、未成熟胚等诱导体细胞胚胎发生，其发生和成苗类似合
43、子胚或种子。其发生和成苗类似合子胚或种子。特点：特点：胚状体具有数量多、结构稳定、易成苗和胚状体具有数量多、结构稳定、易成苗和繁殖速度快繁殖速度快的特点，有的特点，有变异。变异。67 5.3.1.4 芽的增殖途径芽的增殖途径E、原球茎型原球茎型 原球茎是一种类胚组织，原球茎是一种类胚组织，培养兰花的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，培养兰花的茎尖或腋芽可直接产生原球茎，继而分化成植株，也可继代增殖为原球茎。继而分化成植株，也可继代增殖为原球茎。特点：特点：受材料的局限性较大。受材料的局限性较大。68 5.3.2影响组培苗快繁的外因影响组培苗快繁的外因5.3.2.1 培养基对植物快速繁殖的影响培养基对
44、植物快速繁殖的影响5.3.2.2 培养条件培养条件69 5.3.2.1 培养基对植物快速繁殖的影响培养基对植物快速繁殖的影响（1）无机盐无机盐（2）糖浓度糖浓度（3）维生素维生素（4）生长素和细胞分裂素生长素和细胞分裂素（5）其它有机化合物其它有机化合物 70（1）无机盐无机盐nMS培养基培养基可以适用于许多植物的组织培养。可以适用于许多植物的组织培养。但在大量组织器官培养中发现，由于其但在大量组织器官培养中发现，由于其无机盐浓度较高无机盐浓度较高，对某些，对某些植物来说出现了抑制生长甚至毒害作用。植物来说出现了抑制生长甚至毒害作用。此时应选用此时应选用低盐浓度的培养基，或降低盐浓度低盐浓度的
45、培养基，或降低盐浓度的方法一试是很必的方法一试是很必要的要的。71（2）糖浓度糖浓度 糖类具有维持培养基渗透压的作用糖类具有维持培养基渗透压的作用，在培养过程中，组织不断地从培，在培养过程中，组织不断地从培养基中吸取糖类物质，随时间增长，逐步降低了糖的浓度，不能维持正常养基中吸取糖类物质，随时间增长，逐步降低了糖的浓度，不能维持正常的渗透压，这种情况下应尽快将材料转移至新鲜的培养基，否则影响试管的渗透压，这种情况下应尽快将材料转移至新鲜的培养基，否则影响试管苗的生长。苗的生长。另外另外适宜的糖浓度对器官的发生也有重要作用适宜的糖浓度对器官的发生也有重要作用。蔗糖在高压灭菌时产生一种降解产物蔗糖
46、在高压灭菌时产生一种降解产物5-羟甲基糖醛，应引起重视。羟甲基糖醛，应引起重视。72 （3）维生素维生素n维生素主要是影响基础的生物化学代谢，进而影响新陈代谢，并对形态维生素主要是影响基础的生物化学代谢，进而影响新陈代谢，并对形态发生产生影响。发生产生影响。n在培养过程中，所用的维生素类绝大多数为在培养过程中，所用的维生素类绝大多数为B族维生素族维生素，如硫胺素、烟，如硫胺素、烟酸、叶酸、生物素等，它们以各种辅酶的形式参与代谢活动，影响形态酸、叶酸、生物素等，它们以各种辅酶的形式参与代谢活动，影响形态发生、分化及试管苗的生长。发生、分化及试管苗的生长。73（4）生长素和细胞分裂素生长素和细胞分
47、裂素 植物生长调节物质，在试管苗增殖过程中起着植物生长调节物质，在试管苗增殖过程中起着决定性决定性的作用。的作用。由于植物体内源激素难以测定。因此，由于植物体内源激素难以测定。因此，外源激素的加入靠一系列的外源激素的加入靠一系列的试验来修正。试验来修正。生长素和细胞分裂素对植物快速繁殖的影响主要表现在以下几个方生长素和细胞分裂素对植物快速繁殖的影响主要表现在以下几个方面面:74 激素对植物快速繁殖的影响激素对植物快速繁殖的影响 培养物对激素的需求量取决于它本身内源激素的水平培养物对激素的需求量取决于它本身内源激素的水平，这一水平又随着植，这一水平又随着植物种类、组织的部位以及生长期的条件而变动
48、。物种类、组织的部位以及生长期的条件而变动。有效地有效地诱导一种植物产生苗或促进嫩茎良好地增殖诱导一种植物产生苗或促进嫩茎良好地增殖，所要求的细胞分裂素，所要求的细胞分裂素和生长素的种类与数量有不少变化，通常只有和生长素的种类与数量有不少变化，通常只有一系列的预备实验加以确定。一系列的预备实验加以确定。植物组织和细胞对细胞分裂素的需求量，植物组织和细胞对细胞分裂素的需求量，既取决于遗传因素也取决于后天既取决于遗传因素也取决于后天因素。因素。生长素浓度过高生长素浓度过高，培养物表现发生旺盛生长的愈伤组织，细胞团较松散，培养物表现发生旺盛生长的愈伤组织，细胞团较松散，出现水浸状，细胞较大，液泡较大
49、出现水浸状，细胞较大，液泡较大不可能分化出苗；不可能分化出苗；生长素含量不足生长素含量不足，组织块几乎不能生长；组织块几乎不能生长；某些生长素如某些生长素如2,4-D用量过高，用量过高，形态发生能力迅速丧失形态发生能力迅速丧失，或较长时间内不能恢复；，或较长时间内不能恢复；双子叶植物要求较低，单子叶植物要求较高。双子叶植物要求较低，单子叶植物要求较高。75激素对植物快速繁殖的影响激素对植物快速繁殖的影响 因此，因此，从实用的观点出发，从比较迅速、简便地达到快速繁殖的目的出从实用的观点出发，从比较迅速、简便地达到快速繁殖的目的出发，发，只能是在现有的关于细胞的全能性知识，植物激素知识以及已分化成
50、功只能是在现有的关于细胞的全能性知识，植物激素知识以及已分化成功的同种、同属植物的经验等基础上，用几组不同的激素配比实验进行试验来的同种、同属植物的经验等基础上，用几组不同的激素配比实验进行试验来解决问题。将大量试验报告汇集之后，将会渐渐理出理论的轮廓。最终我们解决问题。将大量试验报告汇集之后，将会渐渐理出理论的轮廓。最终我们将发现，将发现，阐明细胞分化或不定芽发生，要比我们想象的复杂得多。阐明细胞分化或不定芽发生，要比我们想象的复杂得多。76（5）其它有机化合物其它有机化合物 因不同的原因和需要，用于培养基中的有机化合物，种类相当丰富。因不同的原因和需要，用于培养基中的有机化合物，种类相当丰