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1、鱼雪鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测BJS 2019071 范围本方法规定了鳄鱼及其制品中裸盖鱼(Anoplopoma fimbria )、油鱼(Lepidocybium flavobrunneum, Ruvettuspretiosus)和南极犬牙鱼 Dissostichus eleginoides, Dissostichus mawsoni) 源性成分的实时荧光PCR检测方法。本方法适用于鳍鱼、tS鱼片、鳄鱼扒等生鲜或速冻鳄鱼产品(不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼 肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品)中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。2 原理使用商业化DNA提取试剂盒，获得适
2、用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼 或南极犬牙鱼特异性引物探针，通过实时荧光PCR反应，获得Ct值，根据Ct值判断样品是否检出 裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。3 试剂和材料除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T 6682的一级水要求。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。3.1 引物探针序列3. 1. 1裸盖鱼源性成分也！物基因裸盖鱼源成分5，端弓I物：5 LAGGGACCACCCTAACATTCG-3，裸盖鱼源性成分3，端弓I物：5 GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-S 9裸盖鱼.源性成分探针：5 FAM-CAGCTCTCACTGACTAC
3、TCGCATGA-BHQ1 -3 94. 1.2油鱼源性成分Cytb基因油鱼源性成分5，端弓I物：5 ITAACTTCGGATGACTCATCCG-3 油鱼源性成分3，端弓I物：5 AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3，油鱼源性成分探针：5 FAM-C ATCCG A A ACCTTC ATGCA A ACGGC-BHQ1 -3 55. 1.3南极犬牙鱼源性成分或基因南极犬牙鱼源性成分5 端引物：5 ICTGAATATGTAGGTGCATACG-3，南极犬牙鱼源性成分3，端弓I物：5 TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3，南极犬牙鱼源性成分探针,： 5 9-FAM-TCCAT
4、TAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1 -3 96. 1.4内参照基因真核生物18SrRNA内参照5 端引物：5 LTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 内参照3，端引物：5 LAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3，内参照探针：5 ,-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1 -3 93.2 商业化DNA提取试剂盒。3.3 商业化PCR反应预混液。4 仪器和设备1 .1实时荧光PCR仪。4 . 2微量紫外分光光度计。5 . 3恒温水浴锅。6 .4高速冷冻离心机：离心力18, 000 g以上。4. 5 微量
5、移液器(0.5 L- 10 L, 10 L- 100 L, 20 u L- 200 口1_, 100 u L- 1000 |1L)。5. 6涡旋振荡器。6. 7天平：感量0. 001 go7. 分析步骤7.1 样品前处理(1)样品只有单块鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。(2)样品有五块以下鱼肉组成：使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。(3)样品有五块以上鱼肉组成：随机挑选5块鱼肉，使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的 中心部位鱼肉。将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤，离心去除上清液，尽可能剪碎并混匀。注：速冻鳄鱼产品应在完全解冻后再取样。5. 2 DNA提取按照商业化DN
6、A提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品，每个样品设置两个平行，按照 商业化DN A提取试剂盒说明书操作。6. 3 DNA浓度测定取1 |1L DNA溶液，使用微量紫外分光光度计按照dsDNA (双链DNA)计算方式检测其浓度。5. 4实时荧光PCR扩增实时荧光PCR反应体系见表lo表1实时荧光PCR反应体系PCR预混液(2x)10 gL10pnol/L上游引物0.4 xL10 gmol/L下游引物0.4(1L10 pnol/L 探针0.2 |iLDNA20-50 ng灭菌去离子水补充至总体积20 pLPCR反应程序：95 15 s； 95 5 s, 60 34 s （读取荧光），40个循环。
7、6. 5实验对照分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。阳性对照：含相应物种的DNA。阴性对照：不含相应物种的DNA。PCR空白对照：以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系。空白提取对照：以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取。7. 结果判断与表述8. 1质量控制若以下条件的其中一条不满足要求时，结果视为无效：阳性对照：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值300阴性对照：Ct值N35.0；PCR空白对照：C唯235.0；空白提取对照：Ct值N35.O；内参照反应：荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；样品平行反应：Ct值经6.2结果判定后应一致
8、。9. 2结果判定（1）如Ct值30。且质量控制符合要求，则判定为检出相应物种源性成分。（2）如Ct值2300且质量控制符合要求，则判定为未检出相应物种源性成分。10. 3结果表述检出XXX源性成分。未检出XXX源性成分。11. 防污染措施检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。12. 方法检出限裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1 %5 %,油鱼引物探针检出限范围为1 %10 %,南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1 %2%。注：因使用的设备、试剂盒不同，其检出限有所差异。本方法负责起草单位：深圳市计量质量检测研究院。验证单位：河南省产品质量监督检验院、天津市食品安全检测技术研究院、重庆市食品药品 检验检测研究院、福建省食品药品质量检验研究院、广东省食品检验所。主要起草人：林霖、张世伟、吴佳辉、王坤、杨国武、杨俊。