《T_SHAAV 017-2024 犬呼吸道病原检测 微流控芯片法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《T_SHAAV 017-2024 犬呼吸道病原检测 微流控芯片法.docx（19页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 1 1 . 220 B41SHAAV 团 体 标 准T/SHAAV 0172024犬呼吸道病原检测 微流控芯片法M i crofl u id i C Chi p method for can i ne upper resp i ratory tract d i sease pathogens2024-04- 10 发布 2024-04- 10 实施上海市畜牧兽医学会 发 布T/SHAAV 017 2024次前 言 II1 范围 12 规范性引用文件 l3 术语和定义 14 缩略语 15 原理 26 试剂和材料 27 仪器设备 28 样品采集、保存 、运输和处理 39 操作步骤 310
2、质量控制 . . . 41 1 结果判定 4附 录 A (规范性) 试剂配制 5附 录 B (资料性) 引物序列 6附 录 C (资料性) 微流控芯片的制作 7附 录 D (规范性) 核酸提取 7lT/SHAAV 01 7 2024前 言本文件按照GB/T 1 . 1 2020 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口 。本文件起草单位: 上海市动物疫病预防控制中心 、复旦大学、上海市金山区动物疫病预防控制中心、 上海市崇明区动物疫病预防控制中心、上海
3、海关动植物与食品检验检疫技术中心、上海速芯生物科技有 限公司 、 宁波爱基因科技有限公司 。本文件主要起草人: 鞠厚斌 、杨德全、王建 、方雪恩 、沈海潇 、杨显超 、李鑫 、赵洪进 、陈琦 、盛 文伟 、卢春光、李守富 、苑建军 、葛菲菲 、李健 、孔继烈 、李杨 、刘萌 、张强 、王晓旭 、夏炉明 、周锦 萍 、李凯航 、刘健、陶田谷晟 、唐燕婷 、张玉杰 。本文件首批承诺执行单位名单: 上海市动物疫病预防控制中心 、复旦大学 、上海市金山区动物疫病 预防控制中心 、上海市崇明区动物疫病预防控制中心 、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 、上海 速芯生物科技有限公司 、宁波爱基因科技有限
4、公司 。llT/SHAAV 017 2024犬呼吸道病原检测 微流控芯片法1 范围本文件规定了犬呼吸道病原微流控芯片检测的原理 、试剂和材料 、仪器设备 、样品采集 、保存 、运 输和处理 、操作步骤 、质量控制和结果判定 。本文件适用于犬流感病毒 、犬呼吸道冠状病毒 、犬副流感病毒 、犬瘟热病毒 、支原体和支气管败血 波氏杆菌六种呼吸道病原核酸的检测 。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中 , 注日期的引用文件 , 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件 , 其最新版本 (包括所有的修改单) 适用于本 文件。GBT 6682 分
5、析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求NYT 541 兽医诊断样品采集 、保存与运输技术规范 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3 . 1微流控芯片 microfluidic chip以硅 、玻璃 、金属材料 、高分子聚合物等材料为芯片基材 , 利用微纳加工 、精密注塑等加工技术加 工而成 , 其中包括一个或多个微管道 、微阀 、微反应池等功能单元, 能够完成芯片内液体流动的精准操 控 , 从而实现某种特定生化反应功能的生物芯片 。来源: GBiT41521 2022, 3 . 1 3 . 2环介导等温扩增 loop-mediated isotherm
6、al amplification , LAMP在 Bst DNA 聚合酶作用下 , 以 DNA 为模板 , 以特异性引物为延伸起点 , 在 60 65 恒温 条件下通过链置换反应进行的 DNA 扩增方法 , 扩增产物是一系列复杂的大小不等的 DNA 混合物 。 是一种区别于 PCR 等变温扩增反应的等温核酸扩增方法。来源: SNT 3767 . 1 2014, 3 . 1 . 5 4 缩略语下列缩略语适用于本文件。Bst: 嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearthermophilus)DEPC: 焦碳酸二乙酯 (Diethyl pyrocarbonate) DNA: 脱氧核糖核酸
7、(Deoxyribonucleic acid)LAMP: 环介导恒温扩增 (LooP-mediated isothermal amplification)PBS: 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline)PCR: 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction) RNA: 核糖核酸 (Ribonulcleic acid)Tt : 时间阈值 (Time threshold)T/SHAAV 017 2024 5 原理基于 DNA 在 65 左右处于动态平衡状态 , 任何一个引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配 对延伸时 , 另 一条链就会解离
8、, 变成单链 。针对靶序列的 6 个区域设计 4 条特异引物 (包括 2 条内 引物和 2 条外引物) , 利用具备链置换功能的 DNA 聚合酶在恒定温度下不断复制扩增 DNA , 其反 应过程包括铃状状模板合成阶段 、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段 , 最终形成茎环结构和多环花椰菜 样结构的 DNA 片段混合物 。通常为了提高反应效率 , 还在反应体系中添加两条环引物 , 使之分别与 茎环结构结合 , 启动链置换合成 , 循环复制 。在微流控芯片上 , 利用荧光染料掺入法在微流控芯片核酸恒温扩增仪上进行恒温反应和实时荧光分 析 , 在具有链置换功能的聚合酶作用下 , 扩增阳性的样品会产生类似
9、 S 形扩增曲线一步完成对靶基 因的扩增和检测 。6 试剂和材料6 . 1 试剂配制6 . 1 . 1 除另有规定 , 所用化学试剂均为分析纯 , 试验用水符合GB/T 6682规定的二级水 , 所有试剂均 用无 RNA酶的容器分装 。6 . 1 . 2 异丙醇: 20 ec预冷 。6 . 1 . 3 氯仿: 2 C8 保存 。6 . 1 . 4 TRIzol: 2 C 8 C保存 。 6 . 1 . 5 DNAzol: 2 C 8 ec保存 。6 . 1 . 6 DEPC 水: 配制方法按附录 A 中的 A. 1 。6 . 1 . 7 75% 乙醇: 用无水乙醇和 DEPC 水配制 , -2
10、0 C预冷。 6 . 1 . 8 8 mmoL NaoH 溶液: 配制方法按A.2。6 . 1 . 9 0 . 01 mol/L PBS (PH7 .4) : 配制方法按A. 3 。6 . 1 . 1O 50%甘油磷酸缓冲液 (PH7.4) : 配制方法按A.4。6 . 1 . 1 1 商品化荧光等温扩增预混液 : 含反转录酶 、Bst DNA 聚合酶和荧光染料等 。 6 . 2 材料6 . 2 . 1 微流控芯片: 制作微流控芯片所用犬呼吸道病原的 LAMP 扩增引物见附录 B , 其制作方法按 附录C 。也可根据实际需求选择其他类型的等效商品化的微流控芯片 。6 . 2 . 2 芯片封口膜
11、。 7 仪器设备7. 1 II级生物安全柜 。7 . 2 微流控芯片核酸恒温扩增仪。7. 3 微量点样仪 。 7 . 4 恒温干燥箱。7 . 5 高速冷冻离心机, 可控温至 4 , 离心速度可达 1 2000 rmin 以上 。 7 . 6 涡旋振荡仪。7 . 7 微量移液器 , 量程为 0 . 5 UL 10L 、 2 UL 20 UL 、 20 UL 200 UL 和 200 UL 1 000 UL 。 2T/SHAAV 017 20247 . 8 冰箱 , 储藏温度在 2 C8ec、 -20 C 以下和 -70 C 以下 。 8 样品采集 、保存 、运输和处理8 . 1 总则样品采集宜在
12、发病初期、选择具有典型临床症状的犬进行 , 采样过程中应避免交叉污染 , 样品采集、 保存 、运输和处理应符合 GB 19489 和 NYT 541 的要求。8. 2 样品采集8. 2 . 1 组织样品采集用无菌剪刀 、镊子分别采集约 2 cmx2 cm大小的病死犬肺脏、肝脏 、脾脏和胰腺等以上器官有病 变和正常组织交接处的组织 , 置于无菌离心管中并编号 。8. 2 . 2 眼分泌物拭子样品采集用无菌采样拭子轻轻搔刮双侧眼结膜取分泌物 (来回滑动3次) , 置于装有1 mL 50%甘油磷酸盐缓 冲液的样品保存管中并编号 。8. 2 . 3 鼻咽拭子样品采集把拭子浸润到生理盐水中 , 然后通过
13、鼻腔缓慢的插入到鼻咽部位 , 在受到阻力以后停留数秒 , 轻轻 旋转 , 将拭子取出置于装有1 mL 50%甘油磷酸盐缓冲液的样品保存管中并编号 。8. 3 样品保存与运输采集的样品应放入主容器密封后 , 采用保温箱加冰袋或干冰密封 , 应在 8 h之内送到实验室 。上述 采集的样品可立即用于检测 。不能立即检测的样品 , 在 2 8 下保存不超过 24 h, -70 以下长 期保存。8 . 4 样品处理8. 4. 1 组织样品处理取适量组织样品置于组织匀浆器或研磨器中充分研磨 , 加入PBS 制备成 10% 组织匀浆液 。10 000 rmin , 4oc离心 10 min , 取上清 ,
14、转入1 . 5 mL灭菌离心管中 , 用于核酸检测 。8. 4. 2 眼分泌物拭子和鼻咽拭子样品将眼分泌物拭子或鼻咽拭子样品在振荡器上充分混合后 , 将拭子中的液体挤出后弃去拭子 。3 000 rhmin , 4 离心 5 min, 取上清液 , 转入1 .5 mL灭菌离心管中 , 用于核酸检测 。9 操作步骤9 . 1 样品 RNA提取TRIzol法抽提核酸 , 按照附录 D 中 D. 1 的方法 。也可采用等效 RNA 提取试剂或方法 , 如采用 自动化核酸提取仪和配套核酸提取试剂进行核酸提取。9 . 2 样品 DNA提取DNAzol法抽提核酸 , 按照附录 D 中 D.2 的方法 。也可
15、采用等效 DNA 提取试剂或方法, 如采用 自动化核酸提取仪和配套核酸提取试剂进行核酸提取。9 . 3 扩增试剂的准备与配制9 . 3 . 1 从-20 C5 oc取出试剂 , 将各试剂于室温下解冻 , 充分混匀并瞬时离心后备用 。 9 . 3 . 2 每个加样孔进样体积为25 UL , 按表 1 配制 25 L 反应体系 。3T/SHAAV 017 2024表 1 反应体系表组分名称体积荧光等温扩增预混液检测样品核酸模板15总反应体系25注 : 引物等己经预先固定到微流控芯片上 , 最终微流控芯片中的反应体系包含反应所需的引物。9 4 加样将上述反应体系旋涡振荡混匀 瞬时离心 全部加入到微流
16、控芯片加样孔中 用与芯片匹配的封口 膜封住加样孔 (参见附录 C) 及透气孔 使用刮片赶走气泡 确保封口膜完全贴合9 5 检测将上述封装好的芯片的凹处对准微流控芯片检测仪卡扣的凸处 水平按下即可 按以下程序设置: 1 600 r/min 低速离心 10 S 4 600 r/min 高速离心 30 S 温度为 63 5 反应时间为 30 min 检测完成 后 仪器自动进行数据分析10 质量控制10 1 检测过程中分别设阴性对照 阳性对照 空白对照和内参对照 10 2 阴性对照为 DEPC水10 3 阳性对照为含犬呼吸道病原靶基因序列的重组质粒10 4 空白对照为存在于微流控芯片反应孔中 不含有任
17、何引物10 5 内参对照为含细胞色素 C 氧化酶亚基 1 序列的重组质粒 其引物包埋于微流控芯片反应孔中 1 1 结果判定1 1 1 试验成立的条件1 1 1 1 空白对照 : 反应时间 30 min 内 无荧光信号检出 未出现典型扩增曲线 1 1 1 2 阴性对照 : 反应时间 30 min 内 无荧光信号检出 未出现典型扩增曲线1 1 1 3 阳性对照 : 反应时间 30 mi 内 有荧光信号检出 且出现典型扩增曲线 Tt 值30 1 1 1 4 内参对照 : 反应时间 30 min 内 有荧光信号检出 且出现典型扩增曲线 Tt 值30 1 1 1 5 同时满足以上条件 此次试验视为有效
18、则可以判读各病原的检测结果1 1 2 结果描述及判定 1 1 2 . 1 阴性反应时间 30 min内 无荧光信号检出 未出现典型扩增曲线时 判定为阴性 表示样品中无该病 原体核酸1 1 2 . 2 阳性反应时间 30 min内 有荧光信号检出 且出现典型扩增曲线 Tt 值30时 判定为阳性 表示样 品中有该病原体核酸4T/SHAAV 017 2024附 录 A (规范性) 试剂配制A. 1 DEPC 水将DEPC加入去离子水中至终浓度为0 . 1% (体积比) , 充分混合均匀后作用12 h , 分装 , 103 kpa 高压蒸汽灭菌30 min, 4c保存备用 。A. 2 8 mmolL
19、NaoH溶液称量0.32 gNaoH , 去离子水溶解后定容至 1 000 mL , 室温保存。A. 3 0 . 01 mol/L PBS (PH7 .4)称取8 . 0 g氯化钠 (Nacl) 、 0 .20 g氯化钾 (kcl) 、 1 .42 g磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 、 0 .27 g磷酸二 氢钾 (KH2PO4) , 加蒸馏水溶解 , 调整PH至7 .4 , 定容至1 000 mL , 103 kpa 高压蒸汽灭菌 30 min , 或 过滤除菌 , 4 保存备用 。A. 4 50%甘油磷酸缓冲液 (PH7 .4)将0. 01 molL PBS与纯甘油 (分析纯) 等量混合
20、, 调整PH至7.4 , 分装为小瓶 , 103 kpa高压蒸汽灭 菌30 min, 4 保存备用 。5T/SHAAV 017 2024附 录 B (资料性) 引物序列B. 1 犬呼吸道病原 LAMP 扩增引物见表B. 1 .表 B. 1 犬呼吸道病原 LAMP扩增引物序列病原名称引物名称目 的基因序列 (5 -3 )流感病毒IV- F3PB2GTAAACAGAGCAAACCAAAGAIV- B3TCAGTGCTGGAATATTCATCTIV- FIPTTCAATCCCCCAATTCTGAAACAGT-ATGCATCAACTCCTGAGACIV- BIPAATGTYATGGGAATGATCGG
21、AATAT-CCATTTTACTAACTCTTAYTCCTCT犬呼吸道冠 状病毒CCV- F3MACAACCGAAGTGGCATTTGGCCV- B3CCATCTGCCTAGCCYTACTCCV- FIPTGTCACCATCTGCCTRTGAGA-GCCACATGTGAACAGATTGCCV- BIPGCCAGYACCACGGCTAAAGCC-CAACCTCCATGGCCTCTG犬流感病 毒CPIV-F3NCCTCTAATAACCCAGAGCTAAGCPIV-B3CGATCTCTACCCTTTCGATACPIV-FIPGCGATGAGAATCCCTTGCAC-CGGCTTCTTCTATTCTG
22、CCCPIV-BIPTACAATGTTTTCACTACCATCAGCC-CTTCTGGTGACTGGTCAGCPIV-LFACTGAGAACAATCCGTA瘟热CDV- F3HCGGTGGCTGAATGACATGCDV- B3CAAATATTCCTAGCGTCACTACCDV- FIPGCTATAGTACATACCTTGGCTTTGG-CATTACTCCAGACAACCAACTCDV- BIPGTTGACACTGGCTTCCTTGTG-GAATACCATCTTGTGAACCATT支原体MYco- F316S rRNAATTAGCGAGACACGTTGTMYco- B3AGTTTCACCTTCT
23、GTGCTMYco- FIPCGCCGCTACTGATGGAATCATTA-GAACTGAAACATCTTAGTAGCAAMYco- BIPCCAAACCAACTTAGTTGGGGT-AGTTTTCCAACTTATTCTGCT气管败血 波氏杆菌Bb-F3DNT1GTTCGCCAGCTACGCGBb-B3CGATGTCAGCACCTTGTAGTBb-FIPCCGCTGCGCCTCGAGTATGC-GAGTATGCGGCCCAGTTCBb-BIPCGGATTCTGGCCCTGGGCT TTCTGCAGGGGAAGGCACBb-LBGCGGATGACGGTCGATCAT/SHAAV 017 2024
24、附 录 C (资料性)微流控芯片的制作C. 1 引物工作液的配制将附录 B 中各引物配制成浓度为 100 ymol/L的储存液 , 分别吸取引物 F3 、B3 、FIP、BIP、LF(LB) 储存液各 10 UL 、 10 UL 、 80L、 80L、 10 YL于离心管中混合 , 再加入0 . 89 mL DEPC水 , 涡旋混匀 , 500 rlmin 离心 30 S , 即作为引物工作液 。C. 2 引物包埋采用微量点样仪 , 将各个引物均匀的点布在微流控芯片上的特定位置区域 , 每反应孔添加引物工作 液 2 UL , 芯片反应孔和加样孔的布局示意图如图 C. 1 . 将加好引物工作液的
25、芯片置于 37 c恒温干燥 箱干燥 30 min, 确保彻底干燥后贴上封口膜密封芯片 。图 C. 1 犬呼吸道病原联检微流控芯片布局示意图说明 :A1 、Bl 犬流感病毒检测孔; C1 犬流感病毒阳性对照孔; D1 犬流感病毒阴性对照孔;A2 、B2 呼吸道冠状病毒检测孔; C2 呼吸道冠状病毒阳性对照孔; D2 呼吸道冠状病毒阴性对照孔; A3 、B3 犬副流感病毒检测孔; C3 犬副流感病毒阳性对照孔; D3 犬副流感病毒阴性对照孔;A4 、B4 犬癌热病毒检测孔; C4 犬癌热病毒阳性对照孔; D4 犬热病毒阴性对照孔; A5 、B5 支原体检测孔 ; C5 支原体阳性对照孔; D5 支
26、原体阴性对照孔;A6 、B6 支气管败血波氏杆菌检测孔; C6 支气管败血波氏杆菌阳性对照孔; D6 支气管败血波氏杆菌阴性对 照孔;A7 、B7 、 C7 、 D7 空白对照孔;A8 、B8 、 C8 、D8 内参对照孔。7T/SHAAV 01 7 2024附 录 D (规范性) 核酸提取D. 1 样品 RNA 提取D. 1 . 1 待检样品 、 阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示 , 取 n 个灭菌 1 .5 mL离心管 , 逐管编号 。D. 1 . 2 每管加入 600 YL TRIzol .D. 1 . 3 每管对应编号分别加入 200 L待检样品 、 阳性对照和阴性对照 , 混匀
27、。D. 1 . 4 每管加入 200 UL氯仿 , 充分颠倒混匀 。 于 4 C 、 12 000 rimin离心 15 min。D. 1 . 5 新取 n 个灭菌的 1 . 5 mL离心管 , 逐管编号 , 每管加入 500 L异丙醇 ( -20 c预冷) 。D. 1 . 6 吸取 D. 1 .4 各管中的上清液 500 L , 转移至 D. 1 . 5 相应的离心管中 , 避免吸出中间层 , 颠倒 混匀 。D. 1 . 7 于 4 C 、 12 000 rmin离心 15 min , 轻轻倒去上清 , 倒置于吸水纸上 , 沥干液体 , 不同样品 应在吸水纸不同地方沥干。D. 1 . 8 每
28、管加入 600 YL 75% 乙醇 ( -20 C预冷) , 颠倒洗涤 。D. 1 . 9 于 4 C 、 12 000 rmin离心 10 min , 轻轻倒去上清 , 倒置于吸水纸上 , 沥干液体 , 不同样品 应在吸水纸不同地方沥干。D. 1 . 10 4 000 rmin离心 10 S , 将管壁上的残余液体甩到管底部 , 用微量移液器将其吸干 。D. 1 . 1 1 室温干燥3 min oD. 1 . 12 每管加入11 L DEPC水 , 轻轻混匀 , 溶解管壁上的 RNA , 2 000 rmin离心 5 S , 获得 RN A 溶液 , 可直接用于检测或保存于-70 C以下备用
29、 。D. 2 样品 DNA提取D. 2 . 1 DNA 提取使用 DNAzol 裂解法提取; 也可采用其他等效的 DNA 提取方法。D. 2 . 2 待检样品 、 阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示 , 取 n 个灭菌1 . 5 mL离心管 , 逐管编号 。D. 2 . 3 每管加入 800 UL DNAzol .D. 2 . 4 每管对应编号分别加入 200 L待检样品 、 阳性对照和阴性对照 , 混匀 , 于 4 C 、 10 000 rm in离心 10 min D. 2 . 5 取 900 YL上清液 , 置新的灭菌 1 .5 mL离心管中 , 加入 500 L无水乙醇 , 混匀 , 室温放置 3 min , 于 4 C 、 10 000 r/min离心 5 min。D. 2 . 6 弃上清液 , 沿管壁缓缓加入 900 UL无水乙醇 , 颠倒洗涤 , 于 4 C 、 10 000 rmin离心 5 min 。 反复洗涤两次后 , 将离心管倒扣于吸水纸上 , 自然干燥或用移液器移吸弃残留液体 。D. 2 . 7 用 50 UL 8 mmol/L NaoH溶液溶解沉淀 , 2 000 r/min离心 5 S , 获得 DNA 溶液 , 可直接用 于检测或保存于 -20 C备用 。8