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1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）的研究进展 【摘 要】DGGE 技术是由Fischer等于11019年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术1，之后Myers等首次在DGGE的引物中运用“GC夹子”，使得突变检出率大大提高，从而进一步完善了该技术。11013年，Muyzer等将DGGE技术应用于微生物的生态学探讨，并且证明了该技术在探讨自然界微生物群落的种群差异性和遗传多样性方面具有突出的优越性2。与传统的菌种分别培育技术及生理生化指标检测相比，DGGE技术通过对微生物群落的核酸信息进行分析，能更精确、更快速的对菌群进行鉴定，同时可鉴定出自然状态下不行培育的菌株。由于DGGE技术具有重现性高、牢靠
2、性强和高效快捷等优点3，现以用于微生物群落的困难性分析、检测微生物种群动态改变、对比细菌的富集培育及分别培育、单基因组中rRNA的多样性分析、DNA提取方法比较等方面，在废水、海洋、森林、土壤等环境样品探讨以及发酵工艺、植物内生真菌探讨、种群演替规律探讨等领域广泛应用。 【关键词】DGGE；微生态；纯培育 1.DGGE技术的原理 变性梯度凝胶电泳是依据小片段DNA分子的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA分子。DNA片段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢4。当DNA片段处在变
3、性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分溶化，达到肯定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。通过对比熔解状态下DNA片段的多态性，就可以推想有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。 为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区GC夹；GC夹就是在一侧引物的5端加上一个3040bp的连续GC碱基，这样在PCR产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于101%4。 2.DGGE技术
4、在微生物生态学中的应用 自然界中85%101.9%的微生物是不行纯培育的5，并且微生物的形态具有难观测性和可变性，在传统的试验方法下不能供应足够的微生物学信息，这严峻阻碍了对自然环境中微生物构成及特征的客观相识。PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的一个最主要的应用就是分析微生物群落构成，Muyzer 等人于11013年首次将DGGE技术应用于微生物膜系统和生物菌苔的群落多样性分析。此后，该技术被广泛应用于各种微生物生态系统的检测，绝大部分探讨都是通过扩增原核生物 16S rDNA 基因来探讨各生态系统中的古细菌或细菌的群落多样性6，或者用真菌的通用引物扩增18SrDNA 基因，从而探讨真菌
5、的群落多样性，另外除了通过rDNA基因来分析微生物群落结构组成外，还可以通过扩增功能性基因来探讨功能基因及功能菌群的差异。 Lam等利用DGGE技术对真菌18SrDNA的序列进行分析，探讨Magnolia liliifera叶片中真菌的多样性，结果在叶片的不同部位得到通过培育和形态学探讨未能得到的14株不同菌株7。Eeva等对挪威红杉残枝样本干脆进行DNA提取，利用DGGE分析通过FR1和NS1引物对扩增的1650 bp rDNA片段，结果得到了46株木材腐烂真菌，为真菌群体中难培育的菌株的检测供应了新的方法8。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA进行提取后，扩增细菌16SrRNA和
6、真菌28SrRNA上的相应片段，之后用DGGE进行分析得到11株优势菌株，并且在不同样本之间细菌存在7884%的相像度，酵母存在80-92%的相像度9。 PCR-DGGE 技术在微生物生态学中的另一个重要应用是检测微生物的动态改变。宋亚娜等运用16SrDNA和18S rDNA特异性引物对，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析，探讨不同间作和轮作种植体系对作物根际真菌和细菌菌落结构的影响，结果表明，间作明显变更玉米的根际细菌、真菌的菌落结构10。Takada利用PCR-DGGE探讨化学熏蒸后对散土和菠菜根部土壤中真菌群落的改变，结果表明，三氯硝基甲熏蒸两个
7、月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多样性都削减，并且一年后真菌的多样性并没有完全复原到原来的水平，但是菠菜根部土壤中真菌削减量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处理两个月后，真菌的多样性只发生微小的变更，并且六个月后就与比照组没有显著差异了11。 PCR-DGGE技术还可用于发觉新的微生物菌株。Santegoeds等通过DGGE分析细菌16SrRNA上的基因片段来检测多次富集培育的菌藻系，得到了14条独特的16SrRNA基因序列，其中有10个细菌株的基因是以前利用纯培育手段及单纯的分子技术方法均没有发觉的12。 3.DGGE技术的局限性及改进方法 DGGE 技术作为一种分子生物学手段在探讨微生物群
8、落的动态行为和困难性方面发挥着重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物学工具，但是作为一种分子水平上的技术，除了具有多数分子技术所固有的缺点之外，本身也有肯定的应用局限性。 首先，利用DGGE分别的PCR产物一般要求DNA长度在200 730bp范围内1，超出该范围DGGE的辨别率会下降，然而这些序列只能供应有限的系统发育信息，不利于推断微生物所属的系统类群。其次，DGGE通常显示的是微生物群落中的优势种群，Muyzer探讨发觉该技术只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析1。再次，每种菌可能含有数目不等的rRNA基因13，则可能会导致群落中菌株数量被过多的估计从而夸大群落差异性和多态性。另
9、外，假如选用的条件不是特殊相宜就不能保证将每类DNA片段完全分开，这样序列不同的DNA片段迁移到凝胶的同一位置，导致同一条带中含有不同种类的细菌14。 对于DGGE存在的这些缺限我们可以通过各种手段加以改善，例如可以优化电泳及PCR的条件从而削减误差，并且在进行DGGE之前通过软件来分析检测PCR过程中形成的嵌合体，另外，可以与其他技术方法相结合，如纯培育、干脆形态视察、原位杂交、核酸探针检测技术等，这样不仅更客观的从多方面反映环境中微生物的多样性信息，还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的探讨水平。DGGE技术与传统方法或其它分子生物技术的结合进一步促进了人们对微生物生态的
10、相识；随着分子生物学技术的快速发展，DGGE技术将会得到不断的补充和完善，必将在微生物生态探讨中发挥更大的作用。 【参考文献】 1Fischer S G，Lerman L S.Length-independent separation of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresisJ.Cell，11019，：191-200. 2MuyzerG，Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing
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