《单细胞测序技术指标技术要求.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单细胞测序技术指标技术要求.docx（3页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、单细胞测序技术指标一、技术要求1,根据课题设计和样本特性，对样本采集保存运输和前处理给出可行方案。1）提供适合的样本采集、保存和转运方法及注意事项并现场辅助进行。2）提供适合的细胞悬液制备方法及注意事项并进行制备。3）按照此标准对细胞悬液进行严格质检：总细胞210万，细胞活性290%,结团率5%, 碎片率W5%,质检合格才标记。4）实验员和lOxChromium仪器能24h在指定地点待命。5）技术人员在现场沟通和优化样本前处理和制备细胞悬液的过程与方法。2 .单细胞悬液质检标记建库和测序。1）完成制备的细胞悬液，质检合格后，立即使用10x Genomics Chromium仪器和Chromiu
2、m Next GEM Automated Single Cell 5 cDNA Kit v2 进行上机标记实验。2）标记实验结束，确认样本形成均一乳浊液状态后，当场进行PCR反转录。3）反转录的cDNA进行cDNA扩增和质检，通过A、B、C三种等级评估样本后续建库的风 险和分析数据的有效性。4）样本质量合格（判定结果至少达到B级）,按照Chromium Next GEM Automated Single Cell 5 cDNA Kit v2建库试剂盒进行建库，库检合格则安排上机测序。5） Chromium Automated Mouse BCR Amplification & Library
3、Construction Kit 构建 BCR 文库；6） Chromium Automated Mouse TCR Amplification & Library Construction Kit 构建 TCR 文库7）库检合格的样本，使用lluminaNovaSeq6000测序仪，PE150模式进行测序，每个样本单 细胞转录组测序数据量不低于120G bp, TCR测序数据量不低于6G bp, BCR测序数据量不低 于6Gbp , Barcodes和UMIsQ30质控不低于90%, Read2 Q30质控不低于85%。8）测序结束后，提供数据质控报告，数据质量不达标的，继续加测。3 .测序
4、数据标准分析。1）测序数据Cell ranger流程分析：数据质控，比对基因组，单细胞基因表达定量。2）细胞-基因表达矩阵导入Seurat 3进行流程分析，数据整合后，过滤多包、空包GEMs 和凋亡逆境等低质量细胞，根据样本和数据特征进行过滤。多包GEMs较多时，使用 DoubletFinder识别多包并进行过滤。3）过滤后，对单细胞基因表达量数据进行均一化和PCA降维，矫正批次效应，对细胞进 行聚类和分群，并可视化分群结果，根据样本主要细胞类型Marker基因评估分群效果。4）各细胞亚群上调表达基因筛选和GO、KEGG、Reactome富集分析。5）各细胞亚群Marker基因筛选和热图、气泡
5、图、小提琴图和tSNE图可视化。6）各细胞亚群Marker基因蛋白互作网络分析。4 ,个性化数据分析。1）通过SingleR和人工辅助鉴定各亚群细胞类型。2）全部或指定细胞类型拟时分析。3）指定基因（目标基因或Marker基因）在样本与细胞图谱中表达分析。4）组间细胞类型和频率差异比较。5）单个样本scRNA数据聚类分群。6）指定细胞类型进一步区分子亚群。7）细胞亚群GSEA分析。8）细胞亚群GSVA分析。9）细胞亚群细胞周期分析。10）指定细胞类型RNA velocity分析。12）细胞亚群相互作用-WGCNA分析13）细胞亚群相互作用-细胞通讯分析（Cellphone） o14）细胞亚群转
6、录因子分析。15） Clonotype 分型16） CDR3特征分析17） V/J基因特征分析18） V-J paired特征分析19）多样本分析20 ）与10X Genomics 5转录组关联分析19） .主动式数据挖掘服务。1）根据课题目标、样本特性和数据质量，探索出合适的基础的细胞-基因定量数据质控和 过滤参数。2）根据课题目标和数据分析结果，提炼文章框架，构思文章主旨。3）结合已有知识和单细胞研究进展和已有单细胞数据分析经验，对个性化数据分析结果 进行解读研判，并制定下一步数据分析方案。4）针对关键数据分析结论或推测，需要明确分析结果是否充足，模型算法是否合适，能 通过不同分析方法验证
7、同一结论或推测。5）开发项目在线报告系统，能实时使用在线报告进行数据分析、数据筛选、绘图等工作。6）根据分析结果和杂志要求，研究和实现数据分析结果的可视化个性展示方式。7）充分利用单细胞测序行业专业优势，及时掌握肾脏疾病研究领域国际和国内研究进展 和情报，遇到严峻竞争事态时，向甲方提供预警和差异化研究方案。8）对于文章投递过程中补充数据分析，能按要求进行数据分析并及时提供分析结果，对 审稿人的疑问及时进行解答。9）免费进行任何其它合理的定制化数据分析，协助至文章发表。10）能上门进行研究方案讨论、结果解读和指导进行数据分析实操。二、商务要求L项目周期：每例样本标记后，样本质量合格时，20个工作
8、日内完成单细胞建库与流程数 据分析，30个工作日完成个性化数据分析，跨年放假时间不计算在内。2 .在项目执行周期内，接受委托方参与项目内容相关的数据分析工作和上门探讨数据挖掘 研究方案。3 .项目执行结束形成正式项目报告书、连同实验原始数据和相关生物信息分析文件一并交 付委托方，其后2年内仍需接受委托方提出与项目内容相关的生物信息分析服务。4 .验收要求：使用llumina NovaSeq 6000测序仪，每个样本单细胞转录组测序数据量不少 于120G bp, TCR测序数据量不低于6G bp, BCR测序数据量不低于6G bp , Barcodes和UMIs Q30质控不低于90%, Read2 Q30质控不低于85%；流程分析结果能按项目进度安排中约定 时间交付；定制化数据分析能下单后立即给出分析周期并到期反馈分析结果。5 .培训要求：能对样本采集保存和转运提供培训，能现场观摩悬液制备实验，能上门指导 单细胞转录组数据分析实操，能上门培训本项目单细胞转录组在线报告。6 .售后服务要求：须于约定时间内出示完整版数据。测序数据不能向任何第三方透露，需 在尾款结清时将原始测序数据交付给医院。须为数据后续分析提供技术支持。具有独立的技 术支持团队，本项目成立研究小组，及时进行项目的商讨、研发和分析。技术支持至本项目 完成后不少于2年。