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1、DNA复制复制All Right Reserved by Liuwanh重庆科技学院化学化工学院第第1页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏中心法则中心法则重点知识回顾重点知识回顾DNADNA经经过过复复制制将将遗遗传传信信息息由由亲亲代代传传递递给给子子代代；经经过过转转录录和和翻翻译译，将将遗遗传传信信息息传传递递给给蛋蛋白白质质分分子子，从从而而决决定定生生物物表表型型。DNADNA复复制制、转转录录和和翻翻译译过过程程就就组组成成了了遗遗传传学学中中心心法法则则。第第2页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏DNA双螺旋结构双螺旋结构重点知识回顾重点知
2、识回顾DNA合成原料是合成原料是dNTP核苷酸经过磷酸核苷酸经过磷酸3，5-二酯键连接二酯键连接DNA中碱基互补配对中碱基互补配对第第3页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏DNA双螺旋结构双螺旋结构重点知识回顾重点知识回顾1.主干链反向平行主干链反向平行2.侧链碱基互补配对侧链碱基互补配对3.立体构象双螺旋立体构象双螺旋第第4页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏问题提出问题提出1DNA为何需为何需要复制？要复制？2DNA复制过复制过程有没有共程有没有共性？性？3DNA复复制过程制过程怎样？怎样？第第5页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万
3、宏本章内容本章内容第第5节：节：DNA损伤与修复损伤与修复 第第4节：逆转录和其它复制方式节：逆转录和其它复制方式第第3节：节：DNA复制过程复制过程第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学第第1节：复制基本规律节：复制基本规律内容提要内容提要第第6页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第1节节.复制基本规律复制基本规律1.1半保留复制半保留复制1.1半保留复制半保留复制概念概念半保留复制（半保留复制（semiconser-vative replication）：）：DNA在复制过程中合成新在复制过程中合成新链与亲代链与亲代DNA分子碱基次分子碱基次序完全一样。因为序完全一样。
4、因为子代子代DNA分子分子中一条链来自亲中一条链来自亲代，另一条链是新合成，代，另一条链是新合成，这种复制方式称为这种复制方式称为半保留半保留复制。复制。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA新合成子链新合成子链第第7页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第1节节.复制基本规律复制基本规律1.1半保留复制半保留复制半保留复制试验证据半保留复制试验证据以以15NH4Cl为唯一氮源培养大肠杆菌，为唯一氮源培养大肠杆菌，使其使其DNA全部变成全部变成15NDNA；Step 1Step 2Step 3Step 4将上述细菌转入普通培养基（含将上述细菌转入普通培养基（含14NH4Cl）
5、培养；）培养；提取各代细菌中提取各代细菌中DNA分子；分子；氯化铯密度梯度离心，分析沉降氯化铯密度梯度离心，分析沉降区域密度。区域密度。米西尔逊米西尔逊-斯塔尔试验斯塔尔试验 第第8页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第1节节.复制基本规律复制基本规律1.2复制子与复制方向复制子与复制方向概念概念复制子复制子(replicon)：复制：复制子是独立完成复制功效单子是独立完成复制功效单位。习惯上把两个相邻位。习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间距离复制起始点之间距离（或（或DNA片段）定为一个片段）定为一个复制子复制子。单向复制单向复制双向复制双向复制复制方向复制方向第第9
6、页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第1节节.复制基本规律复制基本规律1.3需要引物需要引物知识点知识点参加参加DNA复制复制DNA聚合酶，必须以一段含有聚合酶，必须以一段含有3端自由端自由羟基（羟基（3-OH）RNA作为作为引物引物(primer)，才能开始聚合子，才能开始聚合子代代DNA链。链。RNA引物大小，在原核生物中通常为引物大小，在原核生物中通常为50-100个个核苷酸，核苷酸，而在真核生物中约为而在真核生物中约为10个个核苷酸。核苷酸。RNA引物碱基次序，与其模板引物碱基次序，与其模板DNA碱基次序相配对。碱基次序相配对。第第10页页课程：生物化学课程：生物
7、化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第1节节.复制基本规律复制基本规律1.4半不连续复制半不连续复制35353535解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)35第第11页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第1节节.复制基本规律复制基本规律1.4半不连续复制半不连续复制概念概念领头链领头链(leading strand(leading strand）以以3 355方向亲代方向亲代DNADNA链作模板子代链链作模板子代链在复制时基本上是连在复制时基本上是连续进行，其子代链聚续进行，其子代链聚合方向为合方向为5 533，
8、这一条链被称为这一条链被称为领头领头链链(leading strand)(leading strand)。随从链随从链(lagging strand)(lagging strand)以以5 533方向亲代方向亲代DNADNA链为模板子代链链为模板子代链在复制时则是不连续，在复制时则是不连续，其链聚合方向也是其链聚合方向也是5 533，这条链被，这条链被称为称为随从链随从链(lagging(lagging strand)strand)。冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)(Okazaki fragment)因为亲代因为亲代DNADNA双链在双链在复制时是逐步解开，复制时是逐步解开
9、，所以，随从链合成也所以，随从链合成也是一段一段。是一段一段。DNADNA在在复制时，由随从链所复制时，由随从链所形成一些子代形成一些子代DNADNA短短链称为链称为冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)(Okazaki fragment)。第第12页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学DNA复制体系复制体系 复制是在酶催化下核苷酸聚合过程复制是在酶催化下核苷酸聚合过程,需要各种物质共同参加需要各种物质共同参加:底物：底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；模板模板(template)：解开成单链：解开成单链
10、DNA母链；母链；引物引物(primer)：提供：提供3-OH末端寡核苷酸（末端寡核苷酸（RNA分子分子）；）；聚合酶聚合酶(polymerase)：依赖：依赖DNADNA聚合酶，简写为聚合酶，简写为DNA-pol 或或DDDP；其它酶和蛋白质因子其它酶和蛋白质因子DNA复制体系复制体系第第13页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学1.1.解旋解链酶解旋解链酶拓扑异构酶（解超螺旋酶）：拓扑异构酶（解超螺旋酶）：解开解开DNADNA超螺旋超螺旋解链酶（解螺旋酶）：解链酶（解螺旋酶）：解开碱基对之间氢键，形成解开碱基对之间氢键，形成2 2股单链
11、股单链单链单链DNADNA结合蛋白：结合蛋白：结合于单股结合于单股DNADNA链，阻止链，阻止DNADNA复性复性,预防单链被核预防单链被核酸酶水解酸酶水解（辅助因子，非酶）（辅助因子，非酶）2.2.引物酶：引物酶：合成一小段合成一小段RNARNA引物，用于引物，用于DNADNA聚合酶延长子链聚合酶延长子链3.DNA3.DNA聚合酶：聚合酶：在在5 5端由端由RNARNA（或（或DNADNA）前提下，延长）前提下，延长DNADNA子链子链4.DNA4.DNA连接酶：连接酶：在随从链合成过程中，将不连续在随从链合成过程中，将不连续DNADNA子链片段连接子链片段连接第第14页页课程：生物化学课程
12、：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.1 解旋解链酶解旋解链酶拓扑异构酶拓扑异构酶第第15页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.1 解旋解链酶解旋解链酶解链酶解链酶v解螺旋酶解螺旋酶(helicase)，又称解链酶或，又称解链酶或rep蛋白，蛋白，利用利用ATP供能，作用于氢供能，作用于氢键，使键，使DNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2分子分子ATP。v单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single strand binding protei
13、n,SSB）又称螺旋反稳蛋又称螺旋反稳蛋白（白（HDP）。这是一些能够与单链）。这是一些能够与单链DNA结合蛋白质因子。其作用为：结合蛋白质因子。其作用为：使解开使解开双螺旋后双螺旋后DNA单链能够稳定存在，即稳单链能够稳定存在，即稳定单链定单链DNA，便于以其为模板复制子代，便于以其为模板复制子代DNA；保护单链保护单链DNA，防止核酸酶，防止核酸酶降解。降解。SSB第第16页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.2 引物酶引物酶引物酶引物酶v引物酶引物酶(primerase)(primerase)本质上是一个本质上是一个依依赖赖DNA
14、DNARNARNA聚合酶（聚合酶（DDRPDDRP），该酶以，该酶以DNADNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNARNA短链短链引物引物(primer)(primer)，以提供自由，以提供自由3 3-OH-OH，使，使子代子代DNADNA链能够开始聚合。链能够开始聚合。第第17页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.3 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶当前发觉当前发觉DNA聚合酶有三种，聚合酶有三种，分别命名为分别命名为DNA聚合酶聚合酶（pol），），DNA聚合酶聚合酶（pol），），DNA聚合酶聚合酶（pol），），这这三种酶
15、都属于含有各种酶活性三种酶都属于含有各种酶活性多功效酶。多功效酶。参加参加DNA复制主要是复制主要是pol 和和pol。第第18页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.3 DNA聚合酶聚合酶pol Ipol 为含有三种酶活性单一肽链大分子蛋白质，可为含有三种酶活性单一肽链大分子蛋白质，可被特异蛋白酶水解为两个片段，其中大片段保留了被特异蛋白酶水解为两个片段，其中大片段保留了两种酶活性两种酶活性,即即53聚合酶聚合酶和和35外切酶外切酶活性，通活性，通常被称为常被称为Klenow fragment。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段53核酸
16、外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604604个氨基酸个氨基酸木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶N N 端端C C 端端DNA-pol DNA聚合酶活性聚合酶活性 35核酸外切酶活性核酸外切酶活性第第19页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.3 DNA聚合酶聚合酶pol IIDNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。它参加它参加DNA损伤应损伤应急状态修复。急状态修复。pol IIIpol 由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中由十种亚基组成不对称异源二聚体结构，其中 亚基亚基含有含
17、有53聚合酶聚合酶活性，含有复制活性，含有复制DNA功效；功效；亚基亚基含有含有35外切酶外切酶活性，与活性，与DNA复制校正功效相关复制校正功效相关;亚基亚基是起到是起到滑动夹钳滑动夹钳(Sliding clamp)作用，预防聚合酶在单链模板上滑行过程中脱落。作用，预防聚合酶在单链模板上滑行过程中脱落。功效：是原核生物复制延长功效：是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。中真正起催化作用酶。第第20页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.3 DNA聚合酶聚合酶真核细胞真核细胞DNADNA聚合酶种类聚合酶种类第第21页页课程：生物化学课程：
18、生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学2.4 DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶在复制中在复制中起最终接合缺口作用。起最终接合缺口作用。在在DNA修复、重组及修复、重组及剪接中也起缝合缺口剪接中也起缝合缺口作用。作用。是基因工程主要工具是基因工程主要工具酶之一。酶之一。DNA连接酶催化条件连接酶催化条件 需一段需一段DNA片段含有片段含有3-OH，而另一段，而另一段DNA片片段含有段含有5-Pi基；基；未封闭缺口位于双链未封闭缺口位于双链DNA中，中，其中有一条链其中有一条链是完整是完整；需要消耗需要消耗能量能量第第22页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万
19、宏主讲：刘万宏第第2节：节：DNA复制酶学复制酶学DNA复制酶学总结复制酶学总结DNA复制酶学总结复制酶学总结第第23页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第3节：节：DNA复制过程（原核）复制过程（原核）3.1 复制过程静态描述复制过程静态描述1.1.复制起始复制起始1 1）DNADNA解旋、解链、形成解旋、解链、形成复制叉复制叉：拓扑异构酶、解链酶：拓扑异构酶、解链酶及单链及单链DNADNA结合蛋白；结合蛋白；2 2）RNARNA引物合成引物合成：依赖于：依赖于单链模板，由引物酶催化合成单链模板，由引物酶催化合成一小段一小段RNARNA引物；引物；3 3）特点）特点：原
20、核环形：原核环形DNADNA通通常只有一个起点，双向复制；常只有一个起点，双向复制；真核线性真核线性DNADNA含有多个起点，含有多个起点，形成多个复制叉形成多个复制叉2.2.复制延长复制延长1 1）子链延长）子链延长：引物合成后，：引物合成后，有有pol(pol(真核为真核为DNADNA或或)催催化，在引物化，在引物3-OH3-OH末端逐一添加末端逐一添加与模板链对应互补脱氧核苷三与模板链对应互补脱氧核苷三磷酸。磷酸。2 2）半不连续合成）半不连续合成：a.a.领头链领头链：链延长方向与：链延长方向与解链方向相同，连续合成；解链方向相同，连续合成；b.b.随从链随从链：链延长方向与：链延长方
21、向与解链方向相反，为不连续合成解链方向相反，为不连续合成（产生冈崎片段）（产生冈崎片段）3.3.复制终止复制终止1 1）水解引物及填补空缺）水解引物及填补空缺：冈崎片段合成后，有冈崎片段合成后，有polpol（真核可能是（真核可能是）水解去除）水解去除RNARNA引物，并填补留下空隙。引物，并填补留下空隙。2 2）连接酶连接冈崎片段形）连接酶连接冈崎片段形成完整双链成完整双链DNADNA：空隙填补后，空隙填补后，DNADNA片段与片段之间一个缺口片段与片段之间一个缺口由由DNADNA连接酶催化连接，从而连接酶催化连接，从而产生完整产生完整DNADNA双链分子。双链分子。第第24页页课程：生物化学课程：生物化学主讲：刘万宏主讲：刘万宏第第3节：节：DNA复制过程（原核）复制过程（原核）3.2 复制过程动态展示复制过程动态展示DNA复制动态展示复制动态展示第第25页页敬请教授批评指正！第第26页页