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1、第9章 酶促反应动力学一、一、化学动力学基础化学动力学基础二、底物浓度对酶反应速率影响二、底物浓度对酶反应速率影响三、酶抑制作用三、酶抑制作用四、温度对酶反应影响四、温度对酶反应影响五、五、pH对酶反应影响对酶反应影响六、激活剂对酶反应影响六、激活剂对酶反应影响(kinetics of enzyme-catalyzed reaction)第1页研究酶促反应动力学意义 酶酶促促反反应应动动力力学学是是研研究究酶酶促促反反应应速速率率以以及及影影响响此此速速率率各各种种原原因因科科学学。在在研研究究酶酶结结构构与与功功效效关关系系以以及及酶酶作作用用机机制制时时，需需要要动动力力学学提提供供试试验
2、验证证据据；为为发发挥挥酶酶催催化化反反应应高高效效率率，寻寻找找最最有有利利反反应应条条件件；为为了了解解酶酶在在代代谢谢中中作作用用和和一一些些药药品品作作用用机机制制等等，都都需需要要掌掌握握酶酶促促反反应速率规律。应速率规律。第2页二、底物浓度对酶反应速率影响第3页酶反应速率对底物浓度作图第4页中间复合物学说 为为了了解解释释这这个个现现象象，Henri和和Wurtz提提出出了了酶酶底底物物复复合合物物学学说说。该该学学说说认认为为，当当酶酶催催化化反反应应时时，酶酶首首先先与与底底物物结结合合，生生成成酶酶底底物物复复合合物物，然然后后生生成成产产物物，并并释释放放出出酶酶。反反应应
3、用用下下式表示：式表示：S+E ES P+E 第5页酶底物中间复合物存在证据电子显微镜和电子显微镜和X光衍射直接观察到酶与底物复合光衍射直接观察到酶与底物复合物。物。酶与底物结合后光谱发生改变。酶与底物结合后光谱发生改变。溶解度或热稳定性在加入底物后发生改变。溶解度或热稳定性在加入底物后发生改变。分离到了酶底物复合物。分离到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降现超离心沉降过程中，可观察到酶和底物共沉降现象。象。平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相平衡透析时，观察到底物在半透膜两侧浓度不相同同(半透膜一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物半透膜一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧
4、底物浓度高于无酶一侧浓度高于无酶一侧)。第6页（1）平衡学说（Henri，Michaelis和和Menten方程）方程）19Henri和Brown提出了酶催化反应机理 19Michaelis和Menten完善了这个理论，他们认为酶反应第一步是快速可逆平衡，第二步慢，为限速反应。第7页平衡学说推导反应速度方程假设前提 在推导动力学方程时，有几点假设：在推导动力学方程时，有几点假设：第第一一步步快快速速平平衡衡，第第二二步步慢慢，即即 k3 E，S ES。酶以酶以E和和ES两种状态存在。两种状态存在。第8页依据平衡学说推导速度方程设设Vf 为为E与与S结合速度，结合速度，Vr 为为ES解离速度，则
5、解离速度，则Vfk 1(E0ES)(SES)Vrk 2 ES 平衡时平衡时VfVr k 1(E0ES)(SES)k 2 ES又又 S ES SESS第9页依据平衡学说推导速度方程 k1(E0ES)S k 2 ES 解出解出 ES 得得 令令 ，则则 第10页依据平衡学说推导速度方程 因为因为V=k 3 ES，代入前式，代入前式得得 因因为为当当全全部部E都都成成为为ES时时，可可达达最最大大反反应应速速度，即度，即Vm=k 3 E0，所以，所以 这就是米氏方程。这就是米氏方程。第11页米氏方程 米氏方程是一个双曲线方程，若以米氏方程是一个双曲线方程，若以SS为自变为自变量，量，V V为因变量，
6、能够作出双曲线，与试验测得结为因变量，能够作出双曲线，与试验测得结果相符。果相符。第12页（2）稳态理论 1925年年，Briggs和和Haldane提提出出了了稳稳态态（steady state）理论，对米氏方程做了一项很主要修正：）理论，对米氏方程做了一项很主要修正：在在 反反应应式式中中，k3值值不小，后一步骤不是限速步骤。不小，后一步骤不是限速步骤。所所谓谓稳稳态态是是指指反反应应进进行行一一段段时时间间后后，系系统统中中酶酶底底物物复复合合物物浓浓度度由由零零逐逐步步增增加加到到一一定定数数值值，然然后后保保持持不不变变，即即处处于于稳稳态态水水平平，此此时时ES解解离离和和分分解解
7、速速率率之之和等于和等于ES形成速率形成速率，第13页依据稳态学说推导速度方程产生产生ES速率速率消耗消耗ES速率速率 稳态时稳态时所以所以第14页依据稳态学说推导速度方程 移项得移项得令令 ，代入上式得，代入上式得 将上式中将上式中ES解出得解出得 此此ES即为稳态时复合物浓度。即为稳态时复合物浓度。第15页依据稳态学说推导速度方程因为酶反应速率与因为酶反应速率与ES成正比，即成正比，即 所以所以 又因为当全部酶都与底物结合形成复合物时，反又因为当全部酶都与底物结合形成复合物时，反应速率到达最大，即应速率到达最大，即 ，代入上式得，代入上式得 （稳态法）（稳态法）（快速平衡法）（快速平衡法）
8、第16页两个米氏方程区分 这这两两个个方方程程区区分分就就在在于于快快速速平平衡衡法法推推导导方方程程中中米米氏氏常常数数是是Ks，而而稳稳态态法法推推导导米米氏氏方方程程中中米氏常数是米氏常数是Km。Ks是是 ES 解离平衡常数解离平衡常数第17页米氏方程几个特点从米氏方程中能够看出：从米氏方程中能够看出：当当S Km时时，反反应应速速率率到到达达最最大，并与底物浓度无关，属零级反应；大，并与底物浓度无关，属零级反应；当当S=Km时时，所所以以，Km意意义义是是使使反反应应速速率率到到达达最最大大反反应应速速率率二二分分之之一一时时底底物物浓度。浓度。第18页米氏方程曲线第19页米氏常数意义
9、 Km是是酶酶特特征征性性常常数数，其其单单位位是是浓浓度度单单位位。在在一一定定反应条件下，对于一定底物，反应条件下，对于一定底物，Km是定值。是定值。Km能能够够判判断断酶酶天天然然底底物物。有有些些酶酶能能够够作作用用于于几几个个底物，其中底物，其中Km最小底物是天然底物。最小底物是天然底物。当当k3 Km时时，V=Vm=k3E0，此此时时对对底底物物来来说说是是零零级级反反应应，对对酶酶来来说说是是一一级级反反应应，k3是是一一级级反反应应速速率率常常数数，k3表表示示当当酶酶被被底底物物饱饱和和时时每每秒秒钟钟每每个个酶酶分分子子转转换换底底物物分分子子数数（又又称称为为转转换换数数
10、），这这时时k3又又能能够够写写成成 kcat，kcat 越越大大，说说明明酶酶催催化化效效率越高。率越高。第22页kcat/Km意义 Kcat/Km表表示示酶酶催催化化效效率率，Kcat/Km越越大大，催催化化效效率率越越高高。，其其最最大大值值极极限限是是k k1，而而k k1是是酶酶与与底底物物结结合合速速率率常常数数，此此常常数数受受到到底底物物在溶液中扩散速度影响。在溶液中扩散速度影响。第23页作图法求Km和Vm值（Lineweaver-Burk双倒数作图法）双倒数作图法）将米氏方程两边取倒数得将米氏方程两边取倒数得 在一系列在一系列S下测出对应反应速率下测出对应反应速率v，以，以
11、对对 作图，可得出作图，可得出Km和和Vm值。值。第24页米氏方程双倒数图第25页多底物酶促反应动力学（酶促反应按底物分子数分类酶促反应按底物分子数分类）底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B+CA-B+H2O AOH+BH5%12%26%双底物双底物氧化还氧化还原酶原酶转移酶转移酶AH2 B A+BH2A2+B3+A3+B2+A+BX AX+B27%24%三底物三底物连接酶连接酶A+B+ATP AB+ADP+Pi A+B+ATP AB+AMP+PPi6%第26页多底物反应按动力学机制分类（序列反应
12、序列反应）底物结合和产物释放有一定次序：底物结合和产物释放有一定次序：E+A+BEABEPQE+P+Q 产产物物不不能能在在两两种种底底物物都都结结合合之之前前释释放放。这这类反应又能够分为两种类型。类反应又能够分为两种类型。第27页有序反应（ordered reaction）其中其中P是是B转变产物，转变产物，Q是是A转变产物。转变产物。如如脱脱氢氢酶酶辅辅酶酶NAD(P)+相相当当于于A，NAD(P)H相相当当于于Q。第28页随机反应（random reaction）如如肌肌酸酸激激酶酶催催化化肌肌酸酸与与ATP反反应应生生成成磷磷酸肌酸和酸肌酸和ADP。第29页乒乓反应乒乓反应（ping
13、 pong reaction）如转氨酶催化转氨反应：如转氨酶催化转氨反应：氨基酸氨基酸1 酮酸酮酸2 酮酸酮酸1 氨基酸氨基酸2 A B P Q第30页三、酶抑制作用 因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶失活作用，而因为某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶抑制作用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力物质称为酶抑制剂（inhibitor）。研究酶抑制作用是研究酶结构和功能、酶催化机制，以及说明代谢途径基本伎俩，也可认为医药设计新药品和为新农药研制提供理论依据。第31页抑制程度表示方法（1 1）相对活力分数（残余活力分数）相对活力分数（残余活力分数）（2 2）相对活力百分数（残余活力百分数）
14、相对活力百分数（残余活力百分数）（3 3）抑制分数（被抑制而失去活力分数）抑制分数（被抑制而失去活力分数）（4 4）抑制百分数）抑制百分数第32页抑制作用类型1不可逆抑制作用（不可逆抑制作用（irreversible inhibition）抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心基基团团以以共共价价键键结结合合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2可逆抑制作用（可逆抑制作用（reversible inhibition）抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心基基团团以以非非共共价价键键结结合合，能能够够用用透透析析、超超滤滤、凝凝胶胶过过滤滤等等物物理
15、理方方法法去去除除而使酶恢复活力。而使酶恢复活力。第33页可逆抑制作用3种类型（1 1）竞争性抑制（）竞争性抑制（competitive inhibition）I 和和 S 竞竞争争与与酶酶活活性性中中心心结结合合，二二者者只只能能结结合合一一个个。竞竞争争性性抑抑制制剂剂通通常常是是底底物物类类似似物物，它它能够与酶结合，但不能被酶催化发生反应。能够与酶结合，但不能被酶催化发生反应。第34页竞争性抑制剂举例第35页可逆抑制作用3种类型（2 2）非竞争性抑制（）非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）I 与与 S 能能够够分分别别与与酶酶结结合合，谁谁先先结结合合都都
16、能能够够，形形成成 ESI 三三元元复复合合物物，但但 ESI 中中 S 不不能能转转变变成成产产物物。这这类类抑抑制制剂剂是是与与酶酶活活性性中中心心之之外外某某个个部部位位结结合。合。第36页竞争性和非竞争性抑制剂抑制机理第37页可逆抑制作用3种类型（3）反竞争性抑制剂（）反竞争性抑制剂（uncompetitive inhibition）I 只只与与 ES 结结合合，只只有有 ES 能能分分解解出出产产物物，ESI 中中 S 不不能能转转变变成成产产物物。因因为为 I 存存在在促促进进了了 E 和和S 结结合合，所以称为反竞争性抑制。所以称为反竞争性抑制。ES+I ESI P+E+I第38
17、页可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学判别 在在反反应应系系统统中中加加入入一一定定量量抑抑制制剂剂，以以及及不不一一样样量量酶酶，测测定定反反应应速速率率与与酶酶量量关关系系。斜斜率率较较小小直直线线是是可可逆逆抑抑制制剂剂，不不经经过过原原点点但但斜斜率率与与对对摄影同是不可逆抑制剂。摄影同是不可逆抑制剂。1.control2.irreversible inhibitor3.reversible inhibitor第39页可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学判别 在在反反应应系系统统中中加加入入不不一一样样量量酶酶及及抑抑制制剂剂，作作不不一一样样抑抑制制剂剂浓浓度度下下反反应应速速率率对对酶
18、酶量量直直线线。可可逆逆抑抑制制剂剂得得到到是是一一组组经经过过原原点点但但斜斜率率不不一一样样直直线线，不不可可逆逆抑抑制制剂剂得得到到是是一一组组不不经经过过原原点点但但斜斜率率与与对对摄摄影影同同平平行线。行线。第40页一些主要不可逆抑制剂（1 1）非专一性不可逆抑制剂）非专一性不可逆抑制剂 有机磷化合物有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物 重金属盐重金属盐 烷化试剂烷化试剂 氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和CO 青霉素青霉素（2 2）专一性不可逆抑制剂）专一性不可逆抑制剂 Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 Kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 第41页有机磷化合物 很
19、很多多农农药药是是有有机机磷磷化化合合物物，它它们们能能抑抑制制一一些些蛋蛋白白酶酶及及酯酯酶酶活活力力，与与酶酶分分子子活活性性部部位位丝丝氨氨酸酸羟羟基基共共价价结结合合而而使使酶酶失失活活。这这类类化化合合物物强强烈烈地地抑抑制制胆胆碱碱酯酯酶酶活活力力，使使乙乙酰酰胆胆碱碱不不能能水水解解成成乙乙酸酸和和胆胆碱碱，造造成成乙乙酰酰胆胆碱碱积积累累，引引发发神神经经中中毒毒症症状状。所所以以这这类类化化合合物物又又称称为为神神经经毒毒剂剂。用用解解磷磷定定（碘碘化化醛醛肟肟甲甲基基吡吡啶啶）或或氯氯磷磷定定（氯氯化化醛醛肟肟甲甲基基吡吡啶啶）能能把把酶酶上上毒毒剂剂夺夺取取下下来来，使使
20、酶酶恢恢复复活力，到达解毒作用。活力，到达解毒作用。第42页有机磷化合物第43页解磷定解毒机理第44页有机汞化合物 有有机机汞汞化化合合物物能能与与酶酶巯巯基基结结合合而而使使酶酶失失活活。过过量半胱氨酸或还原型谷胱甘肽量半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。能解毒。第45页有机砷化合物 有有机机砷砷化化合合物物能能与与酶酶巯巯基基结结合合而而使使酶酶失失活活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。（二巯基丙醇）能解毒。路易斯毒气路易斯毒气第46页为了六十一个阶级弟兄第47页重金属盐 Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在在高高浓浓度度时时能能使使酶酶蛋蛋白白变变性性，低低浓浓度度时时抑抑制制一一些
21、些酶酶活活力力。可可用用金金属属螯合剂螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。烷烷化化试试剂剂含含有有一一个个活活泼泼卤卤素素离离子子，能能够够修修饰饰酶酶分分子子中中许许多多基基团团，如如巯巯基基、氨氨基基、羧羧基基、咪咪唑唑基基及及硫醚基等。硫醚基等。烷化试剂第48页氰化物、硫化物和CO 氰氰化化物物能能与与细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶中中Fe2+结结合合，使使酶酶失失活活不不能能呼呼吸吸。CO与与血血红红蛋蛋白白结结合合阻阻止止氧氧运运输输。硫硫化化物物能能与与各各种种含含金金属属酶酶形形成成较较为为稳稳定定络络合合物物，使使酶酶失活。失活。糖糖肽肽
22、转转肽肽酶酶在在细细菌菌细细胞胞壁壁合合成成中中使使肽肽聚聚糖糖链链交交联联。青青霉霉素素与与糖糖肽肽转转肽肽酶酶丝丝氨氨酸酸羟羟基基结结合合，使使细细菌菌细胞壁不能合成。细胞壁不能合成。青霉素 第49页青霉素抗菌机理第50页Ks型不可逆抑制剂 这这类类抑抑制制剂剂结结构构与与底底物物类类似似，并并带带有有高高反反应应性性基基团团，与与酶酶活活性性部部位位结结合合后后，修修饰饰活活性性部部位位基基团团使使酶酶失失活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。活。主要修饰活性部位，其它部位也可能修饰。胰蛋白酶人工底物胰蛋白酶人工底物胰蛋白酶胰蛋白酶Ks型抑制剂型抑制剂第51页Kcat型不可逆抑制剂
23、这这类类抑抑制制剂剂不不但但结结构构与与底底物物类类似似，而而且且需需要要经经酶酶催催化化反反应应后后才才产产生生高高反反应应性性基基团团，比比Ks型型不不可可逆逆抑抑制制剂专一性更强。剂专一性更强。-卤代卤代-D-D-丙氨酸丙氨酸 磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶丙氨酸消旋酶第52页可逆抑制剂（底物类似物底物类似物）合成叶酸组分合成叶酸组分磺磺胺胺药药品品竞竞争争抑抑制制二二氢氢叶酸合成酶活性叶酸合成酶活性 蝶呤蝶呤 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸 叶酸叶酸（磺胺药品）（磺胺药品）第53页可逆抑制剂（过渡态底物类似物过渡态底物类似物）过过渡渡态态底底物物类类似似物物抑抑制制力力更更强
24、强，因因为为酶酶对过渡态底物亲和力比对底物亲和力强得多。对过渡态底物亲和力比对底物亲和力强得多。各各种种酶酶催催化化反反应应时过渡态底物时过渡态底物过渡态底物类似物过渡态底物类似物第54页可逆抑制剂（过渡态底物类似物过渡态底物类似物）第55页可逆抑制剂（过渡态底物类似物过渡态底物类似物）第56页四、温度对酶反应影响 在在较较低低温温度度范范围围内内，酶酶反反应应速速率率伴伴随随温温度度升升高高而而增增加加，当当温温度度高高到到一一定定程程度度时时，酶酶开开始始变变性性失失活活，反反应应速速率率反反而而下下降降。所所以以对对于于酶酶反反应应来来说说，有有一一个个最最适适反反应应温温度度。普普通通
25、来来说说，动动物物细细胞胞内内酶酶最最适适反反应应温温度度在在3540，植植物物细细胞胞中中酶酶可可达达4050，也也有有一一些些生生长长在在堆堆肥肥、温温泉泉中中微微生生物物酶酶最最适适温温度度更更高高，如如Taq DNA聚聚合合酶酶最最适适温温度度可可高高达达70。需需要要注注意意是是，最最适适温温度度值值不不是是酶酶特特征征性性常常数数，此值伴随反应时间延长而有所下降。此值伴随反应时间延长而有所下降。第57页温度对酶反应速率影响第58页五、pH对酶反应影响 酶酶活活力力受受环环境境pH影影响响，存存在在一一个个最最适适反反应应pH。酶酶最最适适反反应应pH也也不不是是一一个个特特征征性性
26、常常数数，而而是是受受到到底底物物种种类类和和浓浓度度、缓缓冲冲液液种种类类和和浓浓度度不不一样而改变。一样而改变。第59页4种酶pH-酶活性曲线胃蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胆碱酯酶胰蛋白酶胰蛋白酶第60页pH影响酶活力原因pH影响酶活力原因有以下几方面：影响酶活力原因有以下几方面：过酸或过碱使酶变性失活。过酸或过碱使酶变性失活。pH偏偏离离最最适适pH不不多多时时，酶酶分分子子中中及及底底物物分分子子中中各各可可解解离离基基团团解解离离状状态态发发生生了了改改变变，不不利利于于底底物物与与酶结合及催化反应。酶结合及催化反应。因因为为酶酶分分子子可可解解离离基基团团解解离离状状
27、态态发发生生了了改改变变，造造成成酶酶分分子子构构象象发发生生改改变变，不不利利于于底底物物与与酶酶结结合合及及催化反应。催化反应。第61页最适反应pH示意图第62页六、激活剂对酶反应影响 有有些些物物质质与与酶酶结结合合后后能能够够提提升升酶酶活活力力，这这些些物物质质称称为为酶酶激激活活剂剂（activator）或或活活化化剂剂，它它们们大大部部分分是是无无机机离离子子或或小小分分子子化化合合物物，少少数数是是大大分分子子物物质质如如蛋蛋白白质质。作作为为激激活活剂剂金金属属离离子子有有K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+等等，它它们们与与酶酶蛋蛋白白结结合合后后，或或稳稳定定酶酶蛋蛋白白构象，或参加底物结合，或催化反应。构象，或参加底物结合，或催化反应。第63页激活剂对酶反应影响 不不一一样样激激活活剂剂激激活活不不一一样样酶酶，有有些些激激活活剂剂激激活活一一个个酶酶，却却又又抑抑制制另另一一个个酶酶。激激活活剂剂浓浓度度也也对对其其效效应应有有影影响响，一一定定浓浓度度时时起起激激活活作作用用，超超出出这这个个浓浓度度又起抑制作用。又起抑制作用。在在机机体体内内有有许许多多调调整整酶酶活活力力方方式式，其其中中抑抑制制剂剂和激活剂调整属于最快速方式。和激活剂调整属于最快速方式。第64页