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1、生物质谱分析技术生物质谱分析技术主讲：主讲：胡胡 水水 旺旺 南方医科大学病生教研室南方医科大学病生教研室E-mail:QQ:493448858第1页第一部分第一部分系统生物学发展系统生物学发展第2页生命科学研究目标生命科学研究目标n寻找生命活动起源及奥秘，n解释及探索生命活动普通规律，n改进人类生活质量，延长人类寿命第3页对生命认识过程对生命认识过程n1.生命是神造、上帝造（By God）等；n2.生命是活力（Activity）；n3.生命是机器（Machine）；n4.生命是信息（Information）。第4页第5页第6页系统生物学定义系统生物学定义 系统生物学（系统生物学（system
2、s biology），），是在细胞、组织、器官和生物体整体水平多层次、多系统研究各种分子（DNA、mRNA、蛋白质、糖类、脂类等、蛋白质、糖类、脂类等）结构、功效及其相互作用，用计算生物学方法整合各组学数据来定量描述和预测它们生物功效、表型和行为科学。第7页 系系统统生物学生物学不一样于以往试验生物学，仅关心个别基因和蛋白质，它要研究全部基因、全部蛋白质、组分间全部相互关系。第8页还原论还原论vs整合论整合论n传统生物学是还原论还原论(reductionism)观点还原论假设一个复杂系统能够分割为许多不分割为许多不会相互干扰子系统会相互干扰子系统，所以只要将子系统研究清楚，就能了解复杂系统行为
3、。n系统生物学是整合论整合论(synthesis)观点面对子系统不独立可能性，希望寻找新方法来处理子系统间交互作用交互作用问题。第9页第10页组学试验组学试验理论计算理论计算基因组基因组转录组转录组蛋白质组蛋白质组相互作用组相互作用组代谢组代谢组表型组表型组数据整合数据整合模型构建模型构建系统干涉系统干涉合成生物学合成生物学系统生物学研究两大技术方法：组学试验和理论计算系统生物学研究两大技术方法：组学试验和理论计算第11页系统生物学应用举例系统生物学应用举例应用系统生物学方法能够预测药品作用机制、病人对药品应答，包含毒副作用和疗效等。比如，美国纽约基因网络科学企业（GeneNetworkSci
4、ences）构建了一个人类癌细胞模型，该模型内含有500各种基因和蛋白质，可将以前分别孤立研究生物过程联络在一起，利用该生物网络模型，能够更加好地了解细胞生物学行为。第12页第二部分第二部分 蛋白质组学兴起蛋白质组学兴起第13页解析疾病机制伎俩改进解析疾病机制伎俩改进:DNA Protein第14页 蛋白质表示调控蛋白质表示调控转录水平调控转录水平调控翻译水平调控翻译水平调控翻译后水平调控翻译后水平调控 蛋白质存在复杂翻译后修饰，作为生命功效行蛋白质存在复杂翻译后修饰，作为生命功效行使者，它比基因更能直接地反应生理过程及其改变。使者，它比基因更能直接地反应生理过程及其改变。蛋白质相互作用及空间
5、构向等问题是生命现象蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性真实表达。复杂性真实表达。蛋白质研究复杂性蛋白质研究复杂性第15页蛋白质研究复杂性蛋白质研究复杂性细胞周期信号转导图细胞周期信号转导图第16页传统蛋白质研究方法中存在问题传统蛋白质研究方法中存在问题1.生命现象发生往往是多原因多原因，必定包括到多个蛋白质。2.多个蛋白质参加是交织成网络网络，或平行发生，或呈级联因果关系。3.在执行生理功效时蛋白质表现是多样多样、动态动态，并不像基因组那样基本固定不变。第17页伴随人类基因组计划重点由结构基因组到功效基因组转移，生命科学开始进入后基因组时代。研究基因终产物及生命活动直接功效执行者蛋
6、白质科学-蛋白质组学（Proteomics）应运而生。第18页蛋白质组最早是由澳大利亚Macquarie大学Wilkins和Williams在1994年意大利举行双向电泳会议上首次提出来。Proteome一词由“蛋白质（PROTEin）”与“基因组（genOME）”杂合而成，对于“基因组学（Genomics）”,“蛋白质组学”定义为一个基因组所表示全套蛋白质。由Proteome深入派生出Proteomics。第19页n，Science杂志把蛋白质组学列为二十一世纪六大研究热点之一。n年4月14日，科学家宣告人类基因组计划已经顺利完成，99%人类遗传密码被破译，人类基因组图谱提前2年完成。蛋白质
7、组学被深入提上日程。第20页 蛋白质组学蛋白质组学(Proteomics)：是经过大规模研：是经过大规模研究蛋白质表示水平改变、翻译后修饰、蛋白质究蛋白质表示水平改变、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间相互作用，以获取蛋白质水平上与蛋白质之间相互作用，以获取蛋白质水平上疾病改变、细胞进程及蛋白质网络相互作用整疾病改变、细胞进程及蛋白质网络相互作用整体综合信息科学研究。体综合信息科学研究。疾病蛋白质组学：蛋白质组学用于研究疾疾病蛋白质组学：蛋白质组学用于研究疾病发病机制便发展为疾病蛋白质组学。病发病机制便发展为疾病蛋白质组学。蛋白质组学定义蛋白质组学定义第21页 蛋白质组学研究机遇和挑战：蛋白质组学
8、研究机遇和挑战：机遇：基因组计划快速进行，大量基因机遇：基因组计划快速进行，大量基因序列和序列和EST确实定为蛋白质快速判定提确实定为蛋白质快速判定提供了良好基础。供了良好基础。挑战：从单一蛋白质研究转变到细胞和挑战：从单一蛋白质研究转变到细胞和组织整体蛋白质研究，在理论和技术上组织整体蛋白质研究，在理论和技术上提出了挑战。提出了挑战。第22页 蛋白质研究技术革命：蛋白质组学蛋白质研究技术革命：蛋白质组学第23页蛋白质组学惯用两大技术平台蛋白质组学惯用两大技术平台第24页第25页第26页第三部分生物质谱技术原理及应用生物质谱技术原理及应用第27页质谱技术特点质谱技术特点n质谱仪是一个用来测量单
9、个分子质量仪器，实际上质质谱仪是一个用来测量单个分子质量仪器，实际上质谱仪提供是分子质量与电荷比谱仪提供是分子质量与电荷比(m/z or m/e).n质谱法是一强有力分析技术。它可用于未知化合物判质谱法是一强有力分析技术。它可用于未知化合物判定、定量分析、分子结构及化学特征确实定等方面；定、定量分析、分子结构及化学特征确实定等方面；n所需化合物量非常低：所需化合物量非常低：10-12g,或或10-15mole；n应用范围广应用范围广:(1)有机质谱法：有机质谱法：生物、医药、聚合物、生物、医药、聚合物、法医和环境等方面；法医和环境等方面；(2)无机质谱法：无机质谱法：地球化学，地质地球化学，地
10、质矿产和无机元素分析判定等方面。矿产和无机元素分析判定等方面。第28页质谱分析原理质谱分析原理质谱分析法是经过对被测样品离子质荷比质荷比测定来进行分析一个分析方法。被分析样品首先要离子化，然后利用不一样离子在电场或磁场运动行为不一样，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质量图谱，经过样品质量图谱和相关信息，能够得到样品定性定量结果。第29页质谱发展史质谱发展史n19:世界第一台质谱装置（J.J.Thomson）n40年代:用于同位素测定和无机元素分析n50年代：开始有机物分析（分析石油）n60年代：研究GC-MS联用技术n70年代：计算机引入第30页生物质谱发展生物质谱发展n80年代：快原子轰击
11、电离，基质辅助激基质辅助激光解吸电离，电喷雾电离，光解吸电离，电喷雾电离，大气压化学电离第31页n质谱技术因处理科学前沿难题一再取得诺贝尔奖：n1.19，Thompson.J.J（创造质谱技术）；n2.1922年，AstonF.W（利用质谱仪发觉非放射性同位素）；n3.1980年，PaulW.（创造离子阱原理与技术）；n4.1996年，CurlR.F/SroalleyR.E.等（用质谱仪观察到激光轰击下产生碳60）；第32页n美国科学家约翰.芬恩与日本科学家田中耕一因为创造了对生物大分子质谱分析方法而取得了诺贝尔化学奖。因为该方法处理了生物大分子“是什么”问题。第33页质谱仪示意图质谱仪示意图
12、数据处理系统离子检测器质量分析器离子源蛋白质产生离子按离子质量与电荷比分离离子离子转换成电信号控制整个质谱仪高斯状峰高斯状峰棒状峰棒状峰第34页质谱工作流程1.加热进样2.直接进样1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆 1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光 5.快原子轰击第35页质谱结构n进样系统：进样系统：按电离方式需要，将样品送入离子源适当部位，分为加热进样和直接进样。n离子源：离子源：用来使样品分子电离生成离子n质量分析器质量分析器：利用电磁场作用未来自离子源离子束中不一样质荷比离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定是否等形式进行分离n离子检测器：离子检测器：用来接
13、收、检测和统计被分离后离子信号第36页进样系统n气体进样n液体进样n固体进样第37页离子源n电子轰击电离（EI）n化学电离（CI）n快原子轰击（FAB）n电喷雾电离（ESI）n基质辅助激光解吸电离（MALDI）n表面增强激光解吸电离(SELDI)技术第38页1).电子轰击电子轰击(Electron impact,EI)电离电离M+e-M+.+2e-Fi+,i=1,2,3,.电子束电子束气体分子气体分子离子束离子束第39页2).化学电离化学电离(chemicalionization,CI)正离子模式：GH+M M+H+G负离子模式：G-H-+M M-H-+G G:离子化试剂气体分子离子化试剂气体
14、分子,CH4,NH3等等M:被分析物被分析物电子束电子束气体分子气体分子试剂分子试剂分子离子束离子束第40页3).快原子轰击快原子轰击(Fastatombombardment,FAB)离子离子化技术化技术-可分析分子量达数千多肽可分析分子量达数千多肽,极性分子极性分子.第41页4).电喷雾离子化电喷雾离子化(Electrosprayionization,ESI)技术技术a).常规电喷雾源常规电喷雾源(mL/min)b).微升喷雾源微升喷雾源(L/min)c).毫微喷雾源毫微喷雾源(nL/min)Drying gasNebulizer gas第42页电喷雾离子化电喷雾离子化（Electrospr
15、ayIonizsation，ESI）是在毛细管出口处施加一高电压，所产生高电场使从毛细管流出液体雾化成细小带电液滴，伴随溶剂蒸发，液滴表面电荷强度逐步增大，最终液滴崩解为大量带一个或多个电荷离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子形式进入气相。第43页n电喷雾离子化特点电喷雾离子化特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都能够检测范围，因而大大扩展了分子量分析范围，离子真实分子质量也能够依据质荷比及电荷数算出n能够方便地与各种分离技术联合使用，如液质联用（LCMS）是将液相色谱与质谱联合而到达检测大分子物质目标。第44页5).基质辅助激光解吸电离技术基质辅助
16、激光解吸电离技术(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI)离子化过程离子化过程第45页nMALDI原理原理是用激光照射样品与基质形成共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离过程。所以它是一个软电离技术，适合用于混合物及生物大分子测定第46页MALDIMatrix应含有特征应含有特征 能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间相互作用(如形成共结晶);能溶解于可溶解样品分子溶剂;在真空状态下是稳定;可吸收激光,既与激光形成共振吸收;可激发样品分子离子化.第47页样
17、品引入方式样品引入方式：直接进样直接进样优点：优点：a).快速取得分子量信息快速取得分子量信息;b).快速取得混合肽肽谱快速取得混合肽肽谱.缺点缺点:a).金属离子干扰金属离子干扰,Na,K；b).离子源结构复杂离子源结构复杂,；c).没有没有LC/MALDI接口；接口；d).实现实现MS/MS困难困难e).需要基质需要基质质量范围质量范围:分子量小于分子量小于500,000Da第48页6).表面增强激光解吸电离表面增强激光解吸电离(Surface-enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)技术技术第49页adding the protein sampl
18、e,washing,adding the energy adsorbing molecule(EAM)第50页质量分析器n磁分析器n四极杆质量分析器(Quadrupoleanalyzer)n离子阱质量分析器(Iontrapanalyzer)n飞行时间质量分析器(Timeofflightanalyzer)n傅立叶变换离子盘旋共振分析器（Fouriertransformioncyclotronresonanceanalyzer）第51页1).磁质谱仪磁质谱仪(magnetic-sector mass spectrometer)经典质量分析器：带电粒子在磁场中运动受到洛伦兹力作用经典质量分析器：带电
19、粒子在磁场中运动受到洛伦兹力作用m:离子质量离子质量z:离子所带电量离子所带电量V:离子飞行速度离子飞行速度B:磁场强度磁场强度r MSMS/MS空间串联质谱仪第52页优点：优点：a).高重现性(稳定性);b).最好定性分析工具;c).能够实现高分辨;d).高灵敏度;e).宽动态范围;f).能够实现多级质谱串联;g).高能collision-induced dissociation(CID)谱重现性好.缺点缺点:a).不能很好与脉冲离子化技术联用(如:MALDI);b).造价高,体积大;c).联动扫描MS/MS谱分辨率低.应用应用:a).全部有机质谱分析方法;b).准确质量测量;c).定量分析
20、;d).同位素丰度比测量.第53页2).四极质量过滤器质谱仪四极质量过滤器质谱仪(quadrupolemassfiltermassspectrometer)quadrupoleMathieu 方程第54页四级杆质量分析器第55页四极杆分析器由四根棒状电极组成。电极材料是镀金陶瓷或钼合金。相对两根电极间加有电压（Vdc+Vrf），另外两根电极间加有-（Vdc+Vrf）。其中Vdc为直流电压，Vrf为射频电压。四个棒状电极形成一个四极电场。经过改变扫描电压让不一样质荷比离子分离开。第56页优点优点:a).可取得经典质谱图可取得经典质谱图;b).重现性好重现性好;c).以其体积较小以其体积较小,造价
21、较低造价较低;d).在三级四极杆串联质谱分析器上或四极杆分析器与磁质谱在三级四极杆串联质谱分析器上或四极杆分析器与磁质谱(飞行时间飞行时间)分分析器组成混合串联分析器上可取得低能析器组成混合串联分析器上可取得低能CID谱谱;缺点缺点:a).峰强度与峰质荷比相关峰强度与峰质荷比相关;b).分辨率低分辨率低;c).不能很好地与脉冲离子化技术结合不能很好地与脉冲离子化技术结合(如如:MALDI);d).collision-induceddissociation(CID)MS/MSspectra与与collisionenergy,collisiongas,pressure相关相关.应用应用:a).多数
22、台式质谱仪多数台式质谱仪,GC/MS和和LC/MS系统系统;b).串联三级四极杆质谱仪串联三级四极杆质谱仪,MS/MS;c).磁分析器与四极杆分析器组成混合型串联质谱仪磁分析器与四极杆分析器组成混合型串联质谱仪,MS/MS.第57页3).离子阱质谱仪(Ion trap mass spectrometer)第58页离子阱质量分析器第59页离子阱主体是一个环电极和上下两端盖电极，环电极和上下两端盖电极都是绕Z轴旋转双曲面，并满足r02=2Z02（r0为环形电极最小半径，Z0为两个端盖电极间最短距离）。直流电压U和射频电压Vrf加在环电极和端盖电极之间，两端盖电极都处于地电位。简单说：用高频交流电把
23、离子限制在离子阱里，然后用离子特征电压分别将其推出离子阱，到检测器检测。第60页优点：优点：a).能够实现多级串联质谱技术；能够实现多级串联质谱技术；b).结构紧凑。结构紧凑。缺点：缺点：a).动态范围窄，不适适用于定量分析；动态范围窄，不适适用于定量分析；b).存在空间电荷效应和离子存在空间电荷效应和离子-分子反应；分子反应；c).CID过程中碰撞能量大小不能确定；过程中碰撞能量大小不能确定；d).多个仪器参数影响质谱中离子分布，多个仪器参数影响质谱中离子分布，如：活化能、捕如：活化能、捕捉时间、检测器条件等。捉时间、检测器条件等。应用应用:a).台式台式GC/MS,LC/MS/MS;b).
24、目标化合物筛选目标化合物筛选;c).气相离子化学研究气相离子化学研究.d).肽序列测定肽序列测定第61页4).傅里叶变换离子盘旋共振质谱仪傅里叶变换离子盘旋共振质谱仪(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer,FTICR MS)第62页优点优点:a).是当前分辨率最高质谱仪是当前分辨率最高质谱仪,1000,000;b).可实现多级串联质谱分析可实现多级串联质谱分析,msn;c).能够与脉冲离子化电离技术联用能够与脉冲离子化电离技术联用,如如:MALDI;d).是当前蛋白质和肽测序中顶端质谱仪是当前蛋白质和肽测序中顶端
25、质谱仪;e).质量稳定性好质量稳定性好;f).可实现气相离子可实现气相离子-分子反应分子反应.缺点缺点:a).有限动态范围有限动态范围;b).存在空间电荷效应和离子存在空间电荷效应和离子-分子反应分子反应;c).存在存在Artifact峰峰;d).多个仪器参数影响质谱图分布多个仪器参数影响质谱图分布,如如:活化能活化能,捕捉时间捕捉时间,检测条件等检测条件等;e).CID谱与碰撞能，碰撞气及其它仪器参数相关谱与碰撞能，碰撞气及其它仪器参数相关应用应用:a).生物大分子分析；生物大分子分析；b).有机小分子分析；有机小分子分析；c).离子化学研究；离子化学研究；e).能够和各种电离技术联用。能够
26、和各种电离技术联用。第63页5).飞行时间质谱仪飞行时间质谱仪(Time-of-flight mass spectrometer)m为离子质量，为离子质量，q为离子所带电荷，为离子所带电荷，L为离子飞行距离，为离子飞行距离，v为离子飞行速度，为离子飞行速度，V为离子加速电压，为离子加速电压，z为离子所带电荷数，为离子所带电荷数，e微电子电量。微电子电量。第64页优点优点:a)可取得高分辨质谱；可取得高分辨质谱；b)可实现快速离子传输；可实现快速离子传输；c)能够很好地与脉冲离子化电离技术联用，如：能够很好地与脉冲离子化电离技术联用，如：MALDI等；等；d)高离子传输效率；高离子传输效率；e)
27、利用利用post-source decay(PSD)技术能够快速实现技术能够快速实现MS/MS技术；技术；f)含有较宽质量范围含有较宽质量范围;g)利用利用ToF-ToF能够实现能够实现MS/MS.缺点缺点:a)需要以脉冲开关；需要以脉冲开关；b)需要快速数字转换器需要快速数字转换器;c)有限动态范围有限动态范围.应用：应用：a)MALDI-ToF；b)GC/EI(CI)-ToF;c)可用于有机化合物分析；可用于有机化合物分析；d)生物大分子分析；生物大分子分析；e)肽谱肽谱第65页离子检测器离子检测器质谱仪检测主要使用电子倍增器，也有使用光电倍增管。由质量分析器出来离子打到高能电极产生电子，
28、电子经电子倍增器产生电信号，统计不一样离子信号即得质谱。信号增益与倍增器电压相关，提升倍增器电压能够提升灵敏度，但同时会降低倍增器寿命，所以，应该在确保仪器灵敏度情况下采取尽可能低倍增器电压。由倍增器出来电信号被送入计算机储存，这些信号经计算机处理后能够得到色谱图，质谱图及其它各种信息。第66页质谱性能指标n灵敏度(sensitivity)n分辨率(resolution)n质量范围(massrange)n质量稳定性(massstability)第67页灵敏度n在一定分辨率下，产生一定信噪比（S/N）分子离子峰所需样品量n在质谱分析中，仪器出现峰（信号）强度E应与物质量或浓度C成线性关系：E=S
29、C，百分比系数S称为灵敏度S=E/C第68页分辨率n质谱仪分辨率表示质谱仪把相邻两个质量分开能力，惯用R表示。n两种定义方式：双峰法和单峰法第69页双峰法n假如某质谱仪在质量M处刚才能分开M和M+M两个质量离子。则该质谱仪分辨率为R=M/Mn所谓两峰刚才分开，普通是指两峰间“峰谷”是峰高10%（每个峰提供5%）第70页单峰法n假如质量为M质谱峰其峰高50%处峰宽（半峰宽）为M。则分辨率为R=M/M，这后一个表示方法测量时比较方便。当前，FT-MS和TOF-MS采取这种分辨率表示方式。第71页质量范围n质量范围是质谱仪所能测定离子质荷比范围。n对于MALDI离子源，电离得到离子为单电荷离子，质量
30、范围实际上就是能够测定分子量范围；对于ESI离子源，因为形成离子带有多电荷，尽管质量范围只有几千，但能够测定分子量可达10万以上。第72页质量稳定性n质量稳定性主要是指仪器在工作时质量稳定情况，通惯用一定时间内质量漂移质量单位来表示。第73页生物质谱种类n按离子源类型：电喷雾质谱和MALDI质谱n按质量分析器类型：四级杆质谱；飞行时间质谱；离子阱质谱；FTICR质谱等第74页串联质谱nQ-Q-QnTOF/TOFnQ-TOFnQ-Trap第75页串联质谱优势n利用软电离技术（如电喷雾和快原子轰击）作为离子源时，所得到质谱主要是准分子离子峰，碎片离子极少，因而也就没有结构信息。为了得到更多信息，最
31、好方法是把准分子离子“打坏”之后测定其碎片离子。nDe novo测序主体思想第76页裂解方式n碰撞诱导分解（CollisionInduceddissociation，CID）n源后衰减（Postsourcedecay，PSD）第77页碰撞诱导分解（CID）n碰撞诱导分解在碰撞室内进行，带有一定能量离子进入碰撞室后，与室内惰性气体分子或原子（也能够是空气）发生碰撞，离子发生碎裂。第78页源后衰减（PSD）n离子在飞行过程中假如发生裂解，新产生离子依然以母离子速度飞行。所以在直线型漂移管中观察不到新生成离子。假如采取带有反射器漂移管，因为新生成离子与其母离子动能不一样，可在反射器中被分开。第79页
32、MALDI TOF/TOF 4800第80页第81页Pulsed laser2.Target is introduced into high vacuum chamber4.Ions are accelerated by an electric field to the same kinetic energy;they separate according to mass as they drift thru the field-free region of the flight tube Flight tube1.Sample+matrix dried on target plate Hig
33、h vacuumTimeHigh voltage3.Sample is irradiated with laser,clock starts to measure time-of-flight .20-25kV6.A data system controls instrument parameters,acquires signal vs.time,and processes the data5.Ions strike the detector at different times,depending on their mass/charge ratio质谱工作流程第82页第83页4800图谱
34、PMF图谱第84页PST图谱第85页A:质谱图中最强子相对强度(Y axis)B:离子质量与电荷比(m/z,X axis)C:离子峰称为基峰(base peak)D:相对于特定检测器时称为峰绝对强度E:全部质谱峰对应是离子电信号强度和离子应在m/z位置F:棒状谱(centroidal peak)G:高斯峰(gauss peak)F质谱图意义质谱图意义G第86页生物质谱技术应用n1.质谱与蛋白质分析n2.蛋白质组学研究n3.质谱与核酸研究n4.质谱与临床医学第87页思索题：1.质谱仪组成部分2.质谱仪主要技术指标3.ESI电离方法原理4.MALDI电离方法原理 5.生物质谱技术主要应用领域第88页第89页