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1、第五章第五章 分子生物学研究方法分子生物学研究方法第1页 分子生物学研究之所以从分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要原因就是当代分子得到高速发展，其中最主要原因就是当代分子生物学研究方法、尤其是基因操作和基因工程生物学研究方法、尤其是基因操作和基因工程技术进步。技术进步。DNA分子切割与连接分子切割与连接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因人工合成基因人工合成基因操作基因操作基因定点突变基因定点突变PCR扩增等扩增等关键技术关键技术第2页基因工程基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒是指在体外将核酸分子插
2、入病毒、质粒或其它载体分子，组成遗传物质新组合，使之进或其它载体分子，组成遗传物质新组合，使之进入原先没有这类分子寄主细胞内并进行连续稳定入原先没有这类分子寄主细胞内并进行连续稳定繁殖和表示。繁殖和表示。外源核酸分子在另一个不一样寄主细胞中繁衍与外源核酸分子在另一个不一样寄主细胞中繁衍与性状表示过程性状表示过程.基因工程技术区分于其它技术基因工程技术区分于其它技术根本特征根本特征：含有跨：含有跨越天然物种屏障、把来自任何生物基因置于毫无越天然物种屏障、把来自任何生物基因置于毫无亲缘关系新寄主生物细胞之中能力。亲缘关系新寄主生物细胞之中能力。本本章将在回顾重组章将在回顾重组DNADNA技术史上主
3、要事件基础上，讨论技术史上主要事件基础上，讨论DNADNA操作技术、基因克隆惯用载体系统以及基因分离与判操作技术、基因克隆惯用载体系统以及基因分离与判定等三个步骤。定等三个步骤。第3页三大三大成就成就：1.40年代确定了遗传信息携带者，即基因分子载体是年代确定了遗传信息携带者，即基因分子载体是DNA而而不是蛋白质，处理了遗传物质基础问题；不是蛋白质，处理了遗传物质基础问题；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivi
4、ngScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae第5页19521952年年HersheyHershey和和ChaseChase证实噬菌体证实噬菌体D DNANA侵染细菌侵染细菌试验试验第6页2.50年代揭示了年代揭示了DNA分子双螺旋结构模型和半分子双螺旋结构模型和半保留复制保留复制机制机制,处理了基因自我复制和世代交替问题；处理了基因自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNA
5、RosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins1953-Franklin&Wilkins第7页Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson第8页ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-Matthew Meselson&Franklin Stahl 1958-Matt
6、hew Meselson&Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathwayfollows the semiconservative pathway第9页3.50年代末至年代末至60年代，相继提出了年代，相继提出了中心法则中心法则和操纵子学说和操纵子学说,成成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息流动和表示。功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息流动和表示。JacobandMonod第
7、10页不过，假如没有分离和富集单一不过，假如没有分离和富集单一DNADNA分子技术，分子技术，科学家就无法对这类物质进行直接生化分析。科学家就无法对这类物质进行直接生化分析。第11页两大两大技术确保：技术确保：1.DNA体外切割和连接体外切割和连接1962年年Arber发觉限制性核酸内切酶，发觉限制性核酸内切酶，1967Gellert发觉了发觉了DNA连接酶连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535第12页Herbert Boyer,Stanley Cohe
8、n1972年取得第年取得第一个重组一个重组DNA分子分子HerbertBoyer第13页第14页重组重组DNADNA试验中常见主要工具酶试验中常见主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶经过磷酸二酯键把两个或多个经过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按5 5到到3 3方向加入新核苷酸，方向加入新核苷酸，补平补平DNADNA双链中缺口双链中缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中碱基序列，依
9、分子中碱基序列，依据碱基互补标准合成据碱基互补标准合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链把磷酸基团加到多聚核苷酸链5-OH5-OH末端（进行末端标识试末端（进行末端标识试验或用来进行验或用来进行DNADNA连接连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸在双链核酸3 3末端加上多聚单末端加上多聚单核苷酸核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链链3 3末端逐一切除单核末端逐一切除单核苷酸苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链链5 5末端逐一切除单核末端逐一切除单核苷酸苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链5 5或
10、或3 3末端磷末端磷酸基团酸基团 到当前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何到当前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不分子切割成一系列不连续片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一连续片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。步研究。第15页1972-Paul Berg,1972-Paul Berg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsites phageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40D
11、NAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA第16页仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行连接酶进行DNA切割和重组远不能满足基因研究需要。切割和重组远不能满足基因研究需要。DNA片段在体外片段在体外不具备自我复制不具备自我复制能力，要想得到足够量能力，要想得到足够量和足够纯度和足够纯度DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力，必须将它们连接到具备自主复制能力DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因
12、克隆，或分子克隆这就是基因克隆，或分子克隆。第17页分子克隆载体分子克隆载体-具备自主复制能具备自主复制能力力DNA分子分子（vector），），如如病毒、噬菌体和病毒、噬菌体和质粒等小分子量质粒等小分子量复制子都能够作复制子都能够作为基因导入载体。为基因导入载体。第18页从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最惯用转化受体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最惯用转化受体。1970年年Mandel和和Higa发觉，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，发觉，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理大肠杆菌细胞一样能等人又报道
13、，经氯化钙处理大肠杆菌细胞一样能够摄取质粒够摄取质粒DNA。第19页1973-Boyer,Cohen&Chang1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandte
14、tracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies第20页表明：表明：（1 1）像）像pSC101pSC101这么质粒这么质粒DNADNA分子能够作为分子能够作为基因克隆载体，从而把外源基因克隆载体，从而把外源DNADNA导入寄主导入寄主细胞；细胞；（2 2）像非洲爪蟾这么高等生物基因也能）像非洲爪蟾这么高等生物基因也能够被成功地转移到原核细胞中并实现其功够被成功地转移到原核细胞中并实现其功效表示；效表示；（3 3）质粒）质粒DNA-DNA-大肠杆菌细胞作为一个成大肠杆菌细胞作为一个成功基因克隆体系，有可能在重组功
15、基因克隆体系，有可能在重组DNADNA或基或基因工程研究中发挥主要作用。因工程研究中发挥主要作用。第21页2.DNA核苷酸序列分析技术核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸酶学和生物化学基础上核苷酸序列分析法是在核酸酶学和生物化学基础上创建并发站起来一门主要创建并发站起来一门主要DNA技术学，这门技术，对于从分技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因结构与功效关系，以及克隆子水平上研究基因结构与功效关系，以及克隆DNA片断操作片断操作方面，都有着十分广泛使用价值。方面，都有着十分广泛使用价值。第22页General process of gene engineering1.1.从
16、生物有机体基因组中，分从生物有机体基因组中，分离出带有目标基因离出带有目标基因DNADNA片段。片段。2.2.将带有目标基因外源将带有目标基因外源DNADNA片段连接到片段连接到能够自我复制并含有选择记号载体分子能够自我复制并含有选择记号载体分子上，形成重组上，形成重组DNADNA分子。分子。3.3.将重组将重组DNADNA分子转移到适当受体细分子转移到适当受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.4.从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得从大量细胞繁殖群体中，筛选出取得了重组了重组DNADNA分子受体细胞，并筛选出已经分子受体细胞，并筛选出已经得到扩增目标基因。
17、得到扩增目标基因。第23页5.5.将目标基因克隆到将目标基因克隆到表示载体表示载体上，导入寄主细胞，使之在新遗传背景上，导入寄主细胞，使之在新遗传背景下实现功效表示，研究核酸序列与蛋白质功效之间关系。下实现功效表示，研究核酸序列与蛋白质功效之间关系。第24页5.2.4基因扩增基因扩增 聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应，即PCR技术，是一个在体外快技术，是一个在体外快速扩增特定基因或速扩增特定基因或DNA序列方法，故又称为基因体序列方法，故又称为基因体外扩增法。外扩增法。DNA DNA 聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶含有在核苷酸底物存在下，以一条含有在核苷酸底物存在下，以一条DNA链为模板催化新链链为
18、模板催化新链合成合成需要含有需要含有 3-OH 引物引物含有含有 5 到到3 方向聚合能力方向聚合能力通常含有通常含有 3到到 5 外切酶活性外切酶活性第50页PCR技术原理并不复杂：技术原理并不复杂：第51页一一DNA体外扩增技术体外扩增技术1.PCR反应体系反应体系1)基本原理基本原理PCR技术基本原理类似于技术基本原理类似于DNA天然复制过程，其特异天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。性依赖于与靶序列两端互补寡核苷酸引物。PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤组成：延伸三个基本反应步骤组成：第52页PCR Cycle-Step 1PCR Cycle-St
19、ep 1-Denaturation Template -Denaturation Template DNA by Heat(95DNA by Heat(95o oC)C)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图模板模板DNA变性：模板变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使模左右一定时间后，使模板板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成双链扩增形成双链DNA解离，使之成为单链，方解离，使之成为单链，方便它与引物结合，为下轮反应作准备；便它与引物结合，为下轮反应作准备；第53页PCR Cycle-Step 2 PCR Cycle-Step
20、 2 Temperature is lowered(TTemperature is lowered(Tm m)and primers anneal to)and primers anneal to target sequencestarget sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNA与引物退火与引物退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温度经加热变性成单链后，温度降至降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链互补序列配对结合；单链互补序列配对结合；第54页PCR Cycl
21、e-Step 3-PCR Cycle-Step 3-At 72 At 72 o o C C TaqTaq DNA polymerase catalyses primer DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are extension as complementary nucleotides are incorporatedincorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物
22、延伸：引物延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶作用下，以合酶作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新与模板条新与模板DNA链。链。第55页End of the 1st PCR Cycle End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一个
23、循环需24分钟，23小时就能将待扩目基因扩增放大几百万倍。第56页Target AmplificationTarget AmplificationNo.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon第57页PCR仪第60页5.2.
24、5 核苷酸序列分析核苷酸序列分析1968年年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略Sanger在它基础之上发展了快数测定在它基础之上发展了快数测定DNA末端终止法末端终止法K Mullis完善了完善了PCR扩增扩增DNA方法方法第61页5.2.5.1.5.2.5.1.SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法双脱氧链终止法(dideoxy-terminationsequencing)原理原理：双脱氧（：双脱氧（2，3）-核苷酸能够象核苷酸能够象2-脱氧核苷酸那样直接掺入脱氧核苷酸那样直接掺入新合成新合成DNA链中，但因链中，但因3端不
25、具端不具OH基，基，DNA链合成至此中止。因为双链合成至此中止。因为双脱氧核苷酸在每个脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入位置不一样，故可依据不一样长度分子中掺入位置不一样，故可依据不一样长度DNA片段测定出核苷酸序列。片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸经过磷酸二酯键连接起来第62页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53添加 DNA polymerase全部4 dNTPs其中一个标识ddNTPddTTP ddCTP ddGTP ddATP在四个不一样反应管中各只包含一个ddNTP.第63页AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 53TTCGATTCGATTTCGAT
26、TTTCTCGATTTCTCGATTTCCTCGTCGAT reactionC reactionG reactionA reaction每一管中复制序列都停留在ddNTPs 处5第64页反应终止后，四个反应管中反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应终止后，四个反应管中反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.这四个反应管中延伸寡核苷酸仅相差一个碱基这四个反应管中延伸寡核苷酸仅相差一个碱基.电泳结构经过显色指示电泳结构经过显色指示.T C G A3CCTTTAGCT5第65页过程过程：制备制备ss-DNA与引物退火与引物退火分为分为4个反应系统个反应系统每个系统中每个系统中加入加入dNTP
27、（其中其中dATP常带同位素标识）和一个双脱氧核苷酸常带同位素标识）和一个双脱氧核苷酸DNA聚合酶定序反应聚合酶定序反应反应产物变性后电泳反应产物变性后电泳凝胶干燥凝胶干燥放放射自显影。射自显影。该法亦适合该法亦适合mRNA序列分析。序列分析。GC富集区常出现富集区常出现“隐影隐影”或或“停顿停顿”现象，如在反应中加入现象，如在反应中加入dITP（脱脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-7-脱氧鸟苷可处理脱氧鸟苷可处理GCGC富集区测序。富集区测序。第66页第67页2.DNA定序普通程序定序普通程序酶法测序酶法测序(Sanger)化学测序法化学测序法(Maxam-
28、Gilbert)待测待测DNA片段片段待测待测DNA片段片段次克隆次克隆5-末端标识末端标识筛选重组子筛选重组子链分离链分离限制酶切限制酶切模板增殖与纯化模板增殖与纯化纯化标识纯化标识ss-DNA与引物退火与引物退火定序反应定序反应定序反应定序反应聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳真空干燥真空干燥放射自显影放射自显影阅读序列和计算机录入阅读序列和计算机录入核苷酸序列分析与比较核苷酸序列分析与比较第68页二二.DNA序列测定自动化序列测定自动化1.DNA测序步骤与自动化测序步骤与自动化1）模板制备）模板制备可自动化可自动化2）定序反应）定序反应可自动化可自动化3）凝胶电泳）凝胶电泳自动化有一定
29、困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入）核苷酸序列阅读与计算机输入可自动化可自动化2.自动测序仪自动测序仪Conney等人于等人于1987年设计了不一样荧光染料标识引物，然后年设计了不一样荧光染料标识引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。做链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色红色引物引物+T反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黄色黄色引物引物+G反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）绿色绿色引物引物+A反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP
30、+ddATP）兰色兰色引物引物+C反应系统（引物反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）第69页第70页优点优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节约制胶和点样时间；四个反应系统可合并点样，大大节约制胶和点样时间；ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；iii.可连续电泳，可读出较多核苷酸序列。可连续电泳，可读出较多核苷酸序列。缺点缺点：无法保留原始统计：无法保留原始统计,四个反应产物点在一条道上四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰相互间会发生干扰,造成读序时分辨率下降。造成读序时分辨率下降。DNA序列分
31、析自动化包括两个方面内容，一是指“分析反应”自动化，其次则是指“读片过程”自动化。第71页第72页5.2.5.3.5.2.5.3.杂交测序杂交测序自从自从70年代末期年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量主测序技术问世以来，人们已经做了大量主要改进，但从根本原理上创新则只有杂交测序法（要改进，但从根本原理上创新则只有杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）一个。它利用一组已知序列寡核苷酸短序一个。它利用一组已知序列寡核苷酸短序列作探针，同某一特定较长靶列作探针，同某一特定较长靶DNA分子进行杂交，从而测定其分子进行杂交，从而测定其核苷酸序列。核苷酸
32、序列。DNA杂交测序实质上包含两个主要步骤杂交测序实质上包含两个主要步骤首先是将待测定靶首先是将待测定靶DNA分子同一组已知其核苷酸次序寡核分子同一组已知其核苷酸次序寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完全双形成完全双链杂合分子寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶链杂合分子寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA核苷酸序列。核苷酸序列。第73页假如将一个核苷酸次序为假如将一个核苷酸次序为5-AGCCTAGCTGAA-312-mer靶靶DNA，与一组完全随机与一组完全随机8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为寡核苷酸探针混合杂交，在总数为
33、48=65536种种8-mer探针群体中，仅有探针群体中，仅有5种会与靶种会与靶DNA形成完全互补双链体分子。形成完全互补双链体分子。依据这依据这5种发生了完全杂交作用种发生了完全杂交作用8-mer寡核苷酸探针之间重合序列线寡核苷酸探针之间重合序列线性关系，便可推算出这段性关系，便可推算出这段12-mer靶靶DNA分子核苷酸次序分子核苷酸次序。当然，这只是一个理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂当然，这只是一个理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补寡核苷酸探针，也依片段完全互补寡核苷酸探针，也依然会与之形成不稳定双链分子。然会与之形成
34、不稳定双链分子。第74页上图是两条长度均为上图是两条长度均为17-mer靶靶DNA片段片段I和和II杂交测序结果，二者仅在第杂交测序结果，二者仅在第8位碱基有不位碱基有不一样，分别为一样，分别为C和和T。靶靶DNA片段片段I可与可与18共共8段彼此相互重合段彼此相互重合8-mer寡核苷酸形成完全寡核苷酸形成完全双链分子，但不能与第双链分子，但不能与第9段段8-mer寡核苷酸形成完全双链分子。依据相邻两段寡核苷酸形成完全双链分子。依据相邻两段8-mer寡核寡核苷酸之间各自含有苷酸之间各自含有7个碱基重合情况，能够构建出互补个碱基重合情况，能够构建出互补DNA序列。靶序列。靶DNA片段片段II杂交
35、结杂交结果表明，横跨其第果表明，横跨其第8位碱基位碱基T6段段8-mer寡核苷酸双链体，因为含有内部碱基错配，所以寡核苷酸双链体，因为含有内部碱基错配，所以其杂交效率显著下降；但与第其杂交效率显著下降；但与第1和第和第8两段两段8-mer寡聚体形成含有末端寡聚体形成含有末端G-T错配双链分子，错配双链分子，其稳定性下降并不显著。与第其稳定性下降并不显著。与第9段段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全双链体分子，证实与寡核苷酸能杂交形成完全双链体分子，证实与片段片段I相比，它在第相比，它在第8位发生了由位发生了由C碱基到碱基到T碱碱基改变。基改变。第75页（基因芯片测序（基因芯片测序)第76页基因芯
36、片测序流程基因芯片测序流程第77页5.2.6.1.5.2.6.1.凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验 凝胶阻滞试验凝胶阻滞试验（gel retardation assay），），又叫作又叫作DNA迁移率迁移率变动试验（变动试验（DNA mobility shift assay），），是用于体外研究是用于体外研究DNA与蛋白与蛋白质相互作用一个特殊凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，因为电场作用，质相互作用一个特殊凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，因为电场作用，裸露裸露DNA朝正电极移动距离与其分子量对数成反比。假如此时朝正电极移动距离与其分子量对数成反比。假如此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，因为分子量增大，它
37、在凝胶中迁分子与某种蛋白质相结合，那么，因为分子量增大，它在凝胶中迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动距离也就移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动距离也就对应缩短了。所以，当某个对应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中某种特在凝胶电泳中移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中某种特殊蛋白质分子相结合了殊蛋白质分子相结合了。5.2.6DNA与蛋白质相互作用研究与蛋白质相互作用研究第78页凝胶阻滞试验基本原理图凝胶阻滞试验基本原理图放射性标识放射性标识DNADNA因为
38、与一个细胞蛋白质因为与一个细胞蛋白质B B结合，于是在凝胶电泳中移动结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中展现滞后条带速度变慢，在放射自显影中展现滞后条带A AC CB B放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影*凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳放射性标识放射性标识放射性标识放射性标识DNADNADNADNA细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物细胞蛋白质提取物蛋白质与蛋白质与蛋白质与蛋白质与DNADNA结合结合结合结合*B BDNA-DNA-蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合蛋白质结合物电泳迁移迟缓物电泳迁移迟缓物电泳迁移迟缓物电泳迁移迟缓滞后带表明滞后带表明滞后带表明滞后
39、带表明DNADNA与蛋白与蛋白与蛋白与蛋白质结合质结合质结合质结合第79页5.2.6.2.DNaseI足迹试验足迹试验 在在DNaseI足迹试验（足迹试验（DNA foot-printing assay）过程中，过程中，首先将待检测双链首先将待检测双链DNA分子用分子用32P作末端标识，并用限制性内切酶作末端标识，并用限制性内切酶去掉其中一个末端，得到只有一条链单个末端标识双链去掉其中一个末端，得到只有一条链单个末端标识双链DNA分子，分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少许与细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少许DNaseI（它可沿着靶它可沿着靶DNA作随机单链切割
40、）消化作随机单链切割）消化DNA分子，并控分子，并控制酶用量使之到达平均每条制酶用量使之到达平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。假链只发生一次磷酸二酯键断裂。假如蛋白质提取物中不存在与如蛋白质提取物中不存在与DNA结合特异蛋白质，经结合特异蛋白质，经DNaseI消化消化之后便会产生出距放射性标识末端之后便会产生出距放射性标识末端1个、个、2个、个、3个核苷酸等等一系个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸连续列前后长度均仅相差一个核苷酸连续DNA片段梯度群体。片段梯度群体。假如有一个蛋白质已经结合到假如有一个蛋白质已经结合到DNA分子某一特定区段上，那分子某一特定区段上，那么，它就将
41、保护这一区段么，它就将保护这一区段DNA免受免受DNaseI消化作用，因而也就不消化作用，因而也就不可能产生出对应长度切割条带。在电泳凝胶放射自显影图片上，对可能产生出对应长度切割条带。在电泳凝胶放射自显影图片上，对应于蛋白质结合部位是没有放射标识条带，出现了一个空白区域，应于蛋白质结合部位是没有放射标识条带，出现了一个空白区域，人们形象地称之为人们形象地称之为“足迹足迹”。第80页3232p p15101510*1481014810*加入蛋白质加入蛋白质X X加入加入DNaseIDNaseI凝胶电泳放凝胶电泳放射自显影射自显影1 15 51010ABAB足迹足迹足迹足迹(a)a)(c)c)(
42、b)b)DNaseI DNaseI DNaseI DNaseI 足迹试验足迹试验足迹试验足迹试验第81页5.3 基因克隆主要载体系统基因克隆主要载体系统1.最少有一个复制起点，因而最少最少有一个复制起点，因而最少可在一个生物体中自主复制。可在一个生物体中自主复制。2.最少应有一个克隆位点，以供外最少应有一个克隆位点，以供外源源DNA插入。插入。3.最少应有一个遗传标识基因，以最少应有一个遗传标识基因，以指示载体或重组指示载体或重组DNA分子是否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞4.安全性安全性大肠杆菌载体大肠杆菌载体pBR322结构图结构图载体特点载体特点基因工程载体是一类可供外源基因工程载体是
43、一类可供外源DNADNA插入并携带重组插入并携带重组DNADNA分子进入适当分子进入适当宿主细胞自主复制宿主细胞自主复制DNADNA分子。分子。第82页5.3.1 质粒质粒DNA及其分离纯化及其分离纯化 细菌质粒是存在于细胞质中一类独立于染色体并能自主复制遗细菌质粒是存在于细胞质中一类独立于染色体并能自主复制遗传成份。绝大多数质粒都是由环形双链传成份。绝大多数质粒都是由环形双链DNADNA组成复制子，也有线性组成复制子，也有线性质粒质粒 报道。报道。质粒质粒DNADNA分子能够连续稳定地处于染色体外游离状态，也可能分子能够连续稳定地处于染色体外游离状态，也可能在一定条件下被可逆性整合到寄主染色
44、体上，伴随染色体复制而在一定条件下被可逆性整合到寄主染色体上，伴随染色体复制而复制，并经过细胞分裂传递到后代。复制，并经过细胞分裂传递到后代。应用质粒作为基因克隆载体分子，最主要前提是要取得大量纯化应用质粒作为基因克隆载体分子，最主要前提是要取得大量纯化质粒质粒DNADNA分子。分子。第83页 E Ecolicoli质粒种类质粒种类 1)colE11)colE1因子（大肠杆菌素因子）因子（大肠杆菌素因子）多数不多数不能进行接合转移能进行接合转移DNADNA，属高拷贝松弛型。，属高拷贝松弛型。2)R2)R因子（抗药性因子）因子（抗药性因子）可接合转移可接合转移DNADNA，属低拷贝，属低拷贝 严
45、紧型，严紧型，质粒较大，操作不便质粒较大，操作不便 3)F3)F因子（性因子）因子（性因子）第84页关键步骤关键步骤：寄主细胞裂解作用是分离质粒：寄主细胞裂解作用是分离质粒DNADNA试验操作。试验操作。通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促使大肠来促使大肠杆菌细胞裂解。假如寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低杆菌细胞裂解。假如寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒质粒DNADNA回收率。假如细胞裂解反应相当温和，同时试验操回收率。假如细胞裂解反应相当温和，同时试验操作又十分慎重仔细，那么绝大部分染色体作又十分慎重仔细，那么绝大部分染色体DNADNA分
46、子都将以高分子都将以高分子量形式释放出来，能够用高速离心方法使之与细胞碎片分子量形式释放出来，能够用高速离心方法使之与细胞碎片一起被沉淀除去，得到高纯度质粒一起被沉淀除去，得到高纯度质粒DNADNA。第85页质粒载体质粒载体DNA分离分离关键关键：怎样使质粒：怎样使质粒DNA与宿主染色体与宿主染色体DNA分开分开 原理原理：质粒：质粒DNA比染色体比染色体DNA小得多，在小得多，在DNA抽提过程中，抽提过程中，染色体染色体DNA断裂成小片段断裂成小片段(线状线状)，质粒，质粒DNA仍保持超螺旋构型仍保持超螺旋构型变性法：变性法：变性条件可采取加热煮沸法或碱变性法变性条件可采取加热煮沸法或碱变性
47、法上述方法亦可用于上述方法亦可用于ss环状病毒环状病毒DNARF型分离型分离,质粒质粒DNA氯霉素扩增氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）使用并不广泛（菌株和载体）第86页5.3.1.1.氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法试验表明，在细胞裂解及试验表明，在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量分离过程中，大分子量细菌染色体细菌染色体DNA轻易发生断裂形成对应线性片段，而质轻易发生断裂形成对应线性片段，而质粒粒DNA则因为其分子量较小、结构紧密，所以仍能保持则因为其分子量较小、结构紧密，所以仍能保持完整状态。这种差异对质粒完整状态。这种差异对质粒DNA纯化是十分有用。纯化是十分有用。上清液上
48、清液加入固体加入固体CsCl与与EtBr溶液溶液室温下超室温下超速离心速离心(45,000rpm）16小时小时穿孔取出穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭异丙醇抽提溴乙锭缓冲液透缓冲液透析除去残余析除去残余CsCl两倍体积冷乙醇沉淀两倍体积冷乙醇沉淀DNA离心、洗涤、干燥离心、洗涤、干燥第87页5.3.1.2.5.3.1.2.碱变性法碱变性法 经过氯化铯经过氯化铯-EtBr密度梯度离心法即使能够得到高纯度、高质密度梯度离心法即使能够得到高纯度、高质量质粒量质粒DNA，但它操作复杂，需要价格昂贵氯化铯和超速离心机设但它操作复杂，需要价格昂贵氯化铯和超速离心机设备，而且溴化乙锭又是一个致癌
49、物质，假如操作不慎，不但会造成备，而且溴化乙锭又是一个致癌物质，假如操作不慎，不但会造成环境污染，还会危及试验工作人员身心健康。环境污染，还会危及试验工作人员身心健康。试验观察发觉，在试验观察发觉，在pH值介于值介于12.012.5条件下加热条件下加热DNA溶液，溶液，使染色体使染色体DNA变为单链，而质粒变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条仍保持环状结构，当变性条件发生快速改变时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。件发生快速改变时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。随机断裂产生线性染色体随机断裂产生线性染色体DNA分子，彼此已经分离互补链之间分子，彼此已经分离互补链
50、之间复性作用就不会那么快速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性复性作用就不会那么快速而准确，往往聚集形成网状结构，与变性蛋白质及蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来。一道被离心沉淀下来。用酒精沉淀法能够搜集依然滞留在上清液中质粒用酒精沉淀法能够搜集依然滞留在上清液中质粒DNA。第88页5.3.2主要大肠杆菌质粒载体5.3.2.1.pSC101质粒载体质粒载体 pSC101 pSC101是一个严紧型复制控制低拷贝是一个严紧型复制控制低拷贝数大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅数大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有有1 12 2个拷贝。其分子大小为个拷贝。其分子大小为9.099.09kbkb，编码编