分子生物学教案 .doc

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1、第一章 绪论重点：1. 分子生物学的基本含义 2. DNA的发现 3. 分子生物学与其他学科的关系难点：DNA的发现课时分配：1.5学时分子生物学的基本含义分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、 生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提

2、供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。1.1 引言现代分子生物学研究的目标是要在分子水平上掌握细胞的功能并揭示生命是本质。1.1.1 创世说与进化论多少年来，人们常常会反复提出下面3个与生命和一切生物学现象有关的问题：（1）生命是怎样起源的？（2）

3、为什么“有其父必有其子”？（3）动、植物是怎样从一个受精卵发育而来的？对这些问题的回答：创世说：西方：上帝先创造了世间万物，后来又创造了男人亚当，再从亚当身上抽一根肋骨，这就成了女人夏娃，亚当和夏娃繁衍了人类。中国：女娲团土造人进化论：1859年，伟大的英国生物学家达尔文（Charles Darwin）发表了著名的物种起源一书，确立了进化论的观点。正是达尔文的生物进化学说，打破了上帝造人的传统观念，改变了社会对人类在整个世界中的地位的看法，极大地推动了人类思想的发展。达尔文用大量事实证明“物竟天择，适者生存”的进化论思想，他认为世界上的一切生物都是可变的，并预言从低级到高级的变化中必定有过渡物

4、种存在。他指出物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的，彻底否定了上帝创造万物的旧思想，推翻了物种不变的神话，使生物学真正迈入实证自然科学的行列。1.1.2 细胞学说早期生物科学家的另一大贡献是提出细胞理论（Cell Theory）。17世纪末，荷兰籍显微镜专家Leeuwenhoek成功制作了世界上第一架显微镜。大约与Leeuwenhoek同时代的Hooke，第一次用“细胞”这个概念来形容组成软木的最基本单元。动、植物的基本单元是细胞，这是19世纪三大发现之一的细胞学说的核心。建立这一学说的是德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann。1.1.3 经典的生物化学和遗传

5、学现代生物学的两大支柱：生物化学和遗传学进化论和细胞学说相结合，产生了作为实验科学之一的现代生物学，而以研究动、植物的遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。生物化学家Buchner第一个实现了用酵母无细胞液和葡萄糖进行氧化反应，生成乙醇，证明化学物质的转换并不需要完整的细胞而仅仅需要细胞中的某些成分。蛋白质是生活细胞中所有化学反应的执行者和催化剂。生物化学从一开始就执行着双重使命，首先，分析细胞的组成成分；其次，弄清楚这些物质与细胞内生命现象的联系。孟德尔通过豌豆实验，总结出生物遗传的两条基本规律基因分离规律和自由组合规律，被公认为经典

6、遗传学的奠基人。在孟德尔遗传学的基础上，美国著名的遗传学家Morgan又提出了基因学说。当所研究的两个基因位于同一染色体上而距离又较近时，Morgan的连锁遗传规律起主导作用；而当所研究的两个基因位于不同染色体上时，孟德尔的自由组合规律起主导作用。1.1.4 DNA的发现直到1953年Watson 和Crick提出DNA双螺旋模型之前，人们对于基因的理解仍然是抽象的、概念化的，缺乏准确的物质内容。首次证明DNA是遗传物质的是Avery的细菌转化实验。图1-1 DNA是转化源早在1928年，英国科学家Griffith等人就发现，肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面荚膜中的

7、多糖决定的。具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜而能使小鼠发病，具有粗糙外表的R型肺炎链球菌因为没有荚膜而失去致病力，（荚膜多糖使细菌免受动物白细胞的攻击）。首次用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery。他和同事首先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后在侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌无致病力。然而，当他们将烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，小鼠死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌（而不是R型）。他们推测，死细菌中的某一成分转化源将无致病力的细菌转化成致病菌。10多年后，

8、实验证明，DNA就是转化源。死细菌DNA指导了这一可遗传的转化，从而导致了小鼠死亡。再次证明DNA是遗传物质的噬菌体侵染细菌的实验。图1-2噬菌体专门寄生在细菌体内，它的头、尾外部都是由蛋白质组成的外壳，头内主要是DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下5个步骤：1. 噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面，2. 噬菌体通过尾轴把DNA全部注入细菌细胞内，蛋白质外壳则留在细胞外。3. 噬菌体的DNA一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成自身的DNA和蛋白质。4. 新合成的DNA和蛋白质能组装成许许多多与亲代完全相同的子代噬菌体。5. 子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵

9、染其他细菌。1.2 分子生物学简史分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。1.3 分子生物学研究的内容现代生物学研究发现，所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同的方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的20种氨基酸及DNA和RNA中的5种碱基组合而成，由此产生了分子生物学的3条基本原理：1. 构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的。2. 生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则。3. 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属

10、性。从表面上看，分子生物学涉猎范围极为广泛，研究内容似乎包罗万象。事实上，它所研究的不外乎以下四个方面：1. DNA重组技术2. 基因表达调控3. 生物大分子的结构和功能4. 基因组、功能基因组与生物信息学分子生物学与其他学科的关系分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”，但两者还是有区别的。生

11、物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢，包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能量代谢等与生理功能的联系。分子生物学则着重阐明生命的本质-主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。国际生物化学学会和中国生物化学学会现均已改名为国际生物化学与分子生物学学会和中国生物化学与分子生物学学会。细胞生物学与分子生物学关系也十分密切。传统的细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。细胞作为生物体基本的构成单位是由许多分子组成的复杂体系，光学显微镜和电子显微镜下所见到的规则结构是各种分子有序结合而

12、形成的。探讨组成细胞的分子结构比单纯观察大体结构能更加深入认识细胞的结构与功能，因此现代细胞生物学的发展越来越多地应用分子生物学的理论和方法。分子生物学则是从研究各个生物大分子的结构入手，但各个分子不能孤立发挥作用，生命绝非组成成分的随意加和或混合，分子生物学还需要进一步研究各生物分子间的高层次组织和相互作用，尤其是细胞整体反应的分子机理，这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。分子细胞学或细胞分子生物学就因此而产生，成为人们认识生命的基础。由于分子生物学涉及认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。在医学各个学科中，包括生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理

13、学以及临床各学科分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透，形成了一些交叉学科，如分子免疫学、分子病毒学、分子病理学和分子药理学等，大大促进了医学的发展。1.4 分子生物学展望（自学内容）第二章 染色体与DNA重点：1.原核生物和真核生物DNA的复制特点2. DNA的修复难点：1. DNA的修复2. DNA的转座课时分配：3.5学时第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点一. 原核生物DNA的复制特点 大肠杆菌基因组以双链环状DNA分子的形式存在，其DNA复制的之间产物可形成一个，复制从定点开始双向等速进行。1. 大肠杆菌DNA复制起始点（oriC）保守序列分布图（图2-21）2. 由大肠杆菌or

14、iC复制起始点出引发的DNA复制过程（a）大约有20个DnaA担保在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合；（b）在HU蛋白和ATP 的共同作用下，DnaA复制起始复合物使3X13bp直接重复序列变性，形成开链；（c）DnaB（解链酶）六体分别与单链DNA相结合，（需要DnaC的帮助），进一步解开双链。在一些重要的酶和蛋白质的相互作用下，DNA开始复制。3. 参与DNA复制的酶和蛋白因子 （1 . ）DNA解链酶 （Helicase） 促使DNA在复制叉处打开双链，与单链DNA结合，与ATP结合，分解成ADP+Pi，产生能量沿DNA链向前运动，促使DNA双链解开。 （2）单链DN

15、A结合蛋白（SSBP） 与单链DNA结合，防止解开的单链重新配对形成双链或被核酸酶降解;使单链DNA呈伸展状态，无弯曲和结节，利于作为模板； SSBP可重复使用。原核生物的SSBP具有协同效应。 SSBP只保持单链的存在，并不能起解链的作用。（3）拓扑异构酶Topoisomerase 解开负超螺旋，并与解链酶 共同作用解开双链。 （4）引物酶 Primase 催化引物RNA分子的合成 （5）DNA聚合酶 DNA Polymerase A.概念：是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。 B. 特点：a. 以dNTP为前体催化合成DNA； b. 需要模板和引物； c. 催化dNTP加到

16、DNA链的3-OH端； d. 催化合成方向53 。C. 分类： DNA聚合酶 I（主要保证DNA复制的准确性） DNA聚合酶II（主要起DNA修复的作用） DNA聚合酶III（DNA复制的主导酶）（6）DNA连接酶 将双链DNA上的切口连接起来； 主要用于冈崎片段的连接，DNA修复、重组，两个复制单元间片段的连接。 连接双链DNA的要求： 切口 3 -OH 5 -磷酸基团 需要能量 4.冈崎片段与半不连续复制由于DNA的两条链为反向平行，以复制叉移动的方向为基准，一条链为3 5 ，其新合成的DNA链沿5 3 连续进行前导链 另一条链为5 3 ，新生的DNA链先合成短的冈崎片段，不连续合成滞后链

17、，再由DNA连接酶连接成完整的DNA链。 这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制称为半不连续复制。5. 复制的引发和终止（1）引发 先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物的3 端开始合成新的DNA链。 滞后链的引发由引发体来完成。引发体由6种蛋白质n、n 、n 、DnaB、C和 I共同组成。引发体在滞后链分叉的方向上移动，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的RNA引物，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。RNase H降解RNA引物， DNA聚合酶I将缺口补齐，DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。（

18、2.）终止 （图2-23） 当复制叉前移，遇到20bp重复性终止序列（Ter）时， Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后，在拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。二.真核生物DNA的复制特点1. 与原核生物相似（1）半保留、半不连续复制 （2）复制过程：引发延伸终止三个阶段 （3）需要酶和蛋白因子2.与原核生物不同（1） 原核生物是单复制子，真核生物是多复制子（每条染色体上有多个复制起点）； （2） DNA全部复制完毕才进行第二轮复制，原核生物在第一轮复制未完成就进行第二轮复制。（3）有5种DNA聚合酶，即聚合酶、。 3.真核细胞DNA的复制调控

19、（3个水平）真核细胞的生活周期可以分为4个时期：G1、S、G2和M期。G1是复制预备期，S期是复制期，G2是有丝分裂准备期，M期为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期。（1） 细胞生活周期水平调控（决定细胞停留在G1期 还是进入S期 ）许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂等都可以诱发细胞由G1期进入S期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚ADP-核糖也可诱导DNA复制。（2）染色体水平调控（决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。这种有序复制的机理还不清楚。（3）复制子水平调控（决定复制的起始与否）这种调控从单细胞到多细胞生物是高度保守的。第五节

20、DNA的修复1. 错配修复该系统识别母链的依据来自Dam甲基化酶，它能使位于5 GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起使点，母链就会在几秒至几分钟内被甲基化。此后，只要两条DNA链上出现碱基配对错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5 位置切开子链，再根据错误碱基相对于DNA切口的方向启动修复，合成新的子链片段。 （图2-25）（a）发现碱基错配； （b）在水解ATP的作用下，MutS，MutL与碱基错配位点的DNA双链相结合；（c）MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由M

21、utH切开非甲基化的子链。（图2-26）当错配碱基位于切口3下游端时，在MutS-MutL、解链酶II、DNA外切酶或RecJ核酸没的作用下，从错配碱基3下游端开始切除单链DNA直到原切口，并在pol III和SSB的作用下合成新的子链片段。若错配碱基位于切口5端上游时，则在DNA外切酶I或X的作用下，从错配碱基位5上游端开始切除单链DNA直到原切口，再合成新的子链片段。2.碱基切除修复 AP位点：由糖苷水解酶切除受损核苷酸上的N- -糖苷键，在DNA链上形成的去嘌呤或去嘧啶位点。 DNA分子中一旦产生了AP位点， AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷磷酸键打开，并移去包括AP位点核苷酸在内的

22、小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。3.核苷酸切除修复 当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。损伤发生后，首先由DNA切割酶在已损伤的核苷酸5 和3 分别切开磷酸糖苷键，产生一个由1213（原）或2729（真）个核苷酸的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶I(原核)或（真核）合成新的片段，并由DNA连接酶完成最后修复。（图2-28）在原核生物中，DNA切割酶从受损核苷酸3 端的第5位和5 端的第8位切开磷酸糖苷键。在人类细胞中，DNA切割酶从受损核苷酸3 端的第6位和5 端的第22

23、位切开磷酸糖苷键。4. DNA的直接修复 是在DNA光解酶的作用下把在光下或紫外光照射形成的胸腺嘧啶二聚体等还原成单体的过程。第六节 DNA的转座DNA的转座,或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。与DNA的同源重组相比，频率较低，但有重要的生物学意义，可以解释基因缺失或倒转现象，可被用于构建新的突变体。1. 转座子（Transposon ，Tn） 能够进行复制并将一个拷贝插入新位点的DNA序列。（能在基因组中移动的DNA序列叫转位因子 ）由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置,甚至在不同的染色体之间跃迁所以又称跳跃基因（jump-gene）。最简单的转座子不含任何宿主

24、基因而常被称为插入序列（insertional sequence，IS）。转座子常常被定位特定的基因中，造成该基因突变。存在： 原核生物、植物中广泛存在，少数存在于动物中。2. 转位因子的结构特点：（图2-31） （1）两端存在末端重复序列（TIR），是转位过程中至关重要的结构；（2）绝大多数的转位因子含有开放阅读框，（ORF），编码一个转位酶，促进转位因子的转位；（3）受体DNA在接受插入DNA后，在插入序列的两侧形成同向重复序列； （4）受体（靶序列）没有确定的特异性，但趋向于一个“热点”区域即所谓“区域性优先”。 取决于DNA双螺旋状态，或DNA-PRO结合状态。IS序列都是一些小的DN

25、A片段，末端具有倒置重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一小段（4-15bp）DNA，形成位于IS序列两端的正向重复。3. 转位机制:转座子的复制靶序列的断裂及倍生同向重复序列转位是一种复制过程。4. 转座作用的遗传学效应（1） 转座引起插入突变各种IS、Tn转座子都可以引起插入突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。（2） 转座产生新的基因如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点产生抗药性。（3） 转座产生染色体畸变（2-35）当复制性转座发生在宿主DNA原有位点附近时，往往导致转座子两个拷贝之间

26、的同源重组，引起DNA的缺失或倒位。若同源重组发生在两个正向重复之间，就导致宿主染色体DNA缺失；若重组发生在两个反向重复转座区之间，则引起染色体DNA倒位。（4）转座引起生物进化由于转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远的基因整合到一起，构建成一一操纵子或表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。5. 真核生物中的转座子（1）玉米中的转位因子 分两类： 自主转位因子本身可以转位；非自主转位因子本身不能转位，但在自主 因子存在下可以转位。l 最早于20世纪40年代由美国冷泉港实验室B.Mc Clintock发现玉米的颜色变化与某些基因的关启有关，而这些基因的关启可能与某

27、些因子的控制有关，而这些因子在基因组中是可以移动的控制因子。当时这一发现并没有引起人们的注意； l直到70年代Shapiro发现大肠杆菌的乳糖操纵子的突变是由于插入了一段序列，后来又发现了其它转位因子后，McClintock的发现才被重视； l1983年Clintock荣获诺贝尔生物学医学奖。第五章 分子生物学技术重点：1. DNA操作技术2. 基因克隆的主要载体系统难点：1. DNA操作技术2. 基因克隆的主要载体系统课时分配：5学时第一节 重组DNA技术发展史上的重大事件1. 基因操作 gene manipulation 主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核

28、酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。2. 基因工程 genetic engineering 将外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。是核酸操作技术 的一部分。3. 二十世纪分子生物学的三大成就（1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；（2）50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了自我复制和世代交替问题；（3） 50年代至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，

29、成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。4. DNA 重组技术 recombinant DNA technique 其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。5. 重组DNA技术史上的主要事件1973 Cohen第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基

30、因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 6. 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第二节 DNA操作技术一. DNA的分离，提取 1. 材料的选择：物种、组织的选择 2. 组织匀浆：细胞分散、破碎 3. 破碎细胞： SDS表面活性剂 4. 除蛋白： 蛋白酶K、酚、氯仿抽提 5. 除RNA： RNA酶 6. DNA回收： 乙醇、异丙醇沉淀7. 纯度鉴定： （1） 电泳：常用琼脂糖凝胶电泳，也用聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下检测。 检测量可达ug，ng级 检测信息：DNA的有无 DNA的

31、大小 构象 纯度 （2）纯度检测： 紫外吸收法（260nm） OD260 - 决定DNA的量 OD280 - 决定Protein的量 1.8 OD260/280 2.0 纯样品 1.8 不纯 2.0 RNA（纯）二. 限制性内切酶图谱 （1）限制性内切酶的发现 阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖。1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割

32、猴子SV40DNA，DNA测序。（2）限制性内切酶的定义：特异性的识别某些核酸序列，并将切断的酶（双链）。 （3）DNA物理图谱： 定义:指DNA链的限制性酶切片段的排列顺序,即酶切片段在DNA链上的定位。 （4）意义: 基因定位 基因重组 剪接 DNA测序三. DNA突变分析 1. DNA RNA Protein 性状 碱基改变后，或会影响蛋白质的形成， 关键部位，或无改变 非关键部位。2. DNA结构变化：点突变、缺失、扩增3. RFLP限制性内切酶多态性分析（ Restriction Fragment Length Polymorphisms ） 制作方法：酶切电泳（转膜杂交）分析 4.

33、 AFLP扩增片段长度多态性分析 （Amplified Fragment Length Polymorphism） 制作方法：酶切加接头PCR电泳分析。 RFLP、AFLP用于突变分析的局限性： 突变必须发生于酶切位点区域，否则检测不到。5. SSCP单链构象多态性分析 （Single strand conformation polymorphism） （1）基本原理： 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率不

34、同。 （2）基本过程是: PCR扩增靶DNA; PCR扩增 产物变性； 聚丙烯酰胺凝胶电泳; 显 色分析结果. 若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变. （3）局限性：只有突变位点影响其空间构象才能被检出来。检出率：70%6. DGGE变性梯度凝胶电泳 ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈梯度增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度时，此浓 度下DNA片段在最低温度解链区域解链(Tm值)，此时DNA分

35、子成分枝状 结构，它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA片段移动减慢，从而使DNA片段 最终分离开来。 变性梯度胶凝电泳能够将具有单个碱基差别的DNA分子分离开来。点突变检出率可达100%，但操作复杂，技术要求较高。 四. 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制性内切酶作图等的技

36、术基础，受到科学界的高度重视。 1. 基本原理 带有电荷的分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，在无反应活性的稳定的支持介质中，与分子的摩擦系数成反比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数越多，分子越小，其迁移的速度越快，反之越慢。因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所携带的净电荷数的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分分离开来。核酸带负电荷，放置在电场中，会向正极方向迁移。相同碱基数量的双链DNA分子几乎带有等量的净电荷，能以同样的速度向正极方向迁移。在一定电场强度下，电泳的迁移率取决于核酸分子

37、大小和构型，可以通过电泳将核酸分子混合物中大小不同的片段分离开来。2. 琼脂糖凝胶电泳 （1.） 凝胶的分辨能力同凝胶的浓度和类型有关。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海澡产物琼脂中提取出来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力就随之减弱。 （2） 琼脂糖凝胶的分辨范围：0.250kb （3） 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围：11000bp（4.） 溴化乙锭染色在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光

38、下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把含有DNA分子的凝胶浸泡在溴化乙锭的溶液中，或是将溴化乙锭直接加到DNA的凝胶介质中，此种染料便会在一切可能的部位与DNA分子结合，然而却不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合，因此，只有DNA分子能吸收溴化乙锭并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的大小或数量成正比。五. 核酸的分子杂交将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或

39、RNA混合在一起，其相应的同源片段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系，而DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。1. Southern blotting杂交中常用的滤膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜 2. 主要步骤： （1）将核酸样品转移到固体支持物滤膜上（2）将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或R

40、NA探针进行杂交。杂交的具体步骤是将含有经电泳分离的不同相对分子质量DNA片段的琼脂糖凝胶，通过碱变性等预处理之后平铺在已用电泳缓冲液饱和了的滤纸上，在凝胶上部覆盖一张待用的滤膜。接着加一叠干滤纸，最后再压上一重物。这样，由于干滤纸的吸引力，凝胶中的单链DNA便随着电泳缓冲液一起转移。这些DNA分子一旦与滤膜接触，就会被吸附在上面，而且严格地保留了它们在凝胶中的谱带模式。在80下烘烤或用紫外线胶联发，就能将DNA片段永久地固定在滤膜上（图5-6）。然后，将滤膜放到加有放射性同位素标记的探针溶液中进行杂交。这些探针是与被吸印DNA序列互补的RNA或单链DNA，一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就

41、很难再解链。因此，可以用漂洗法去掉游离的没有杂交上的探针分子，用X底片暴光后得到放射自显影图片。六. 细菌转化 1. 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程.2. 基本过程所谓细菌转化，是指一中细菌由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫供体菌株，接受转化DNA的菌株则被称为受体菌株。大肠杆菌是细菌转化实验这的常用材料。将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液这，便会造成细胞膨胀，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将

42、该体系转移到42下作短暂的热处理，复合物并会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化因子。利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入寄主细胞中这一特点，科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将DNA注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。七. 核苷酸序列分析 DNA测序(Sequence) 基本原理: 先进行末端标记，作为长度参考位置，把核苷酸的序列测定。 1.Sanger双脱氧链终止法 1977年，英国剑桥生化学家Sanger 等人发明。Sanger首先提出“加减法”，后又对其进行了

43、改进双脱氧链终止法 原理：利用DNA聚合酶I的聚合反应，在反应混合物中加入模板、放射性标记的引物，DNA聚合酶I和四种dNTP，另外加入一定比例的2, 3-ddNTP, 当合成时ddNTP参与后，链将不能再延伸而停止。 注意：样品中加入一定比例的ddNTP。 dNTP / ddNTP = 1：50 或 1：100该方法又叫引物合成法或酶催引物合成法。它利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2，3-双脱氧核苷酸作为底物，将其掺入到寡核苷酸链的3-末端，从而终止DNA链的生长。在DNA测序反应

44、中，加入模板DNA、特意性引物、DNA聚合酶、dNTP和一种ddNTP，当这种2，3-ddNTP（图5-9，ddTTP）掺入到寡核苷酸链的生长末端，取代了dTTP之后，由于ddTTP没有3-末端，寡核苷酸链不再继续延长，在本该由dTTP掺入的位置上发生了链有效终止。如果在同一个反应中，加入一种带32P放射性标记的dNTP。那么，经过适当的温育之后，将会产生不同长度的DNA片段混合物，它们都具有同样的5-末端，并在3-末端的ddNTP处终止。将这种混合物加到变性凝胶上进行电泳分离，就可以获得一系列全部以3-末端ddNTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。分别加入ddATP、ddGTP和ddCTP，在不同的试管中温育后，点样于同一变性凝胶上进行电泳分离，再通过放射自显影的方法检测单链DNA的放射性带，就利益直接读出DNA的核苷酸序列。（图5-10） 在每一个凡庸管中，都加入一种互不相同的ddNTP和全部种dNTP，其