染色体病的分子生物学检验.ppt

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1、第十四章 染色体病的分子生物学检验技术遗传病的分类l单基因遗传病l多基因遗传病（复杂性疾病）l体细胞遗传病l线粒体病l染色体病学习内容l1.染色体异常与疾病染色体数目异常 染色体结构异常 l2.染色体病的分子生物学检验技术荧光原位杂交多重连接依赖性探针扩增技术 l3.染色体病的分子生物学检测l4.产前染色体异常的分子生物学检测数目异常的分子生物学检测结构异常的分子生物学检测第一节染色体异常与疾病一、染色体数目与结构 光镜下染色体 电镜下染色体人类有丝分裂中期染色体形态结构正常男性：46，XY正常女性：46，XX（一）染色体的数目（二）染色体的结构染色体病G显带-R显带G显带Q显带染色体病人类C

2、显带核型端粒显色端粒显色（三）人类正常核型人类的染色体数目和形态是恒定的，将一个体细胞中的全部染色体按其大小、形态结构顺序排列，进行配对，编号和分组的分析过程 二、染色体数目异常与疾病染色体组：染色体组： 人类正常生殖细胞（精子和卵子） 各含23条染色体，为一个染色体组。二倍体：二倍体： 人类精子和卵细胞受精结合后的受精卵发育分化的体细胞含有46条染色体，两个染色体组，为二倍体。以2N表示。二、染色体数目异常与疾病1、三倍体 在人类全身三倍性是致死的，妊娠至20余周的极为罕见.存活者都是二倍体和三倍体的嵌合体。但三倍体在自然流产胚胎中常见，是构成流产的重要原因之一。以下核型核型诊断意见： 69

3、,XXX。 （一）整倍体三倍体形成的原因3NNNN3NNNN（一）整倍体2、四倍体，比三倍体更罕见，往往是四倍体和二倍体的嵌合体。常见核内复制。2N2N2N2N4N2N2N精（卵）原细胞有丝分裂生殖细胞（一）整倍体 体细胞中，如果染色体不是整倍数，而是比二倍体多或少了几条染色体，即称为非整倍体。（二）非整倍体21,13,18号染色体和性染色体常见三体型三体型临床常见三体型临床常见: : 47,XY(XX),+2147,XY(XX),+18 47,XXY47,XXX单体型临床常见单体型临床常见: 45，X常染色体三体型： 21三体先天性愚型又名Down综合征 有特殊面容，鼻梁低，内眦赘皮，两眼外

4、眼角上翘。耳小，常为低位。张口吐舌，流涎多， 智力障碍。50%有先天性心脏缺陷，并有唇裂、腭裂，及多指（趾）、并指（趾）等畸形。 手指短，通贯掌。Down综合征核型47,XX,+21性染色体三体型 47,XXY（klinefelters综合征）klinefelters综合征发生率：在男性人群中发病率为1/600临床表现： 身材高大、细长、下肢较长。青春期后第二性征发育异常：阴茎短小、小睾丸、无胡须、体毛稀少，阴毛呈女性分布，喉结不明显，乳房过度发育。通常不育，并因此就诊。发病机制： 在卵子和精子形成的减数分裂过程中，发生了性染色体的不分离所致。受精后形成的合子就会有额外的X染色体，形成XXY核

5、型，此额外的X染色体可来自卵子或精子。此外，受精卵在卵裂过程中X不分离，也可出现额外的X染色体。klinefelters综合征核型:2、单体型 某对染色体数目少了一条，体细胞内染色体总数只有45条Turner氏综合征染色体核型原因：染色体断裂及重排 常见结构异常： 等臂 (i i)isochromosome 易位 (t t)translocation 倒位 (invinv) inversion 缺失 (deldel) delection 重复 （dupdup）duplication 环状染色体(r r)ring chromosome三、染色体结构异常与疾病1、末端缺失 46,XY,del(22

6、)(p12) 中间缺失 46,X,del(X)(p21.1p22.3)2、重复3、倒位染色体臂内倒位46,inv(12)(p12.2p13.3)染色体臂间倒位核型：46,X,inv(16)(p11.2q12)4、(1)相互易位 46,xx,t(2;5)(q21;q31)相互易位 46,XY,t(12;22)(p13；q11.2)4、（2）罗伯逊易位同源罗氏易位核型45，XX,-22,-22,+t(22;22)(p11q11)非同源罗氏易位核型45，XX,-14,-21,+t(14;21)(p11q11)4、（3）插入易位插入易位核型插入易位核型4646，XX,insXX,ins(7;13)(q

7、21(7;13)(q21;q13q31);q13q31)inv(7inv(7)(q21.2q31.3)(q21.2q31.3) )5、等臂染色体临床常见的是Xq等臂染色体:核型诊断意见：46,X,i(Xq)6、环状染色体5p-综合征(猫叫综合征)（二）染色体结构异常与疾病【临床表现】患者严重智力低下，有生长发育迟缓、头面部畸形、智能障碍及皮纹改变等特点。哭叫声似猫叫，又称为猫叫综合征。幼儿期为满月脸等【发病率】约占新生儿1/50000【核 型】 46XX(XY)del(5)(p15) 核型：患者的核型为46，XX(XY)，5P-。即患者的第5号染色体之一的短臂有缺失。 脆性X染色体综合征脆性X

8、染色体综合征 核型46，fraX(q27)Y该基因5端非翻译区不稳定的（CGG）n三核苷酸重复序列，导染色体区域呈细丝样结构。第二节染色体病的分子生物学检验技术一、荧光原位杂交技术 分子杂交（molecular hybridization） 液相杂交反应介质 原位杂交 固相杂交 印迹杂交制备待测核酸样本，分离/变性/转移/固化DNA片段预杂交制备携带标记的核酸探针杂交一、荧光原位杂交技术一、荧光原位杂交技术1,根据待测核酸信息设计合成带标记的特异性探针2，制备待测样本（组织切片/细胞爬片）3，经变性与复性探针与序列互补的待测靶核苷酸杂交4，进行靶核苷酸的定位检测观察FISH探针的种类l 根据探

9、针的核酸性质不同可分为： l DNA探针（临床使用的探针都是以DNA 为主） l cDNA探针 （不含内含子特异性更高，不受酶影响）l RNA探针 （无互补连杂交，杂交效率高）l 寡核苷酸探针 （一般较短）1、缺口翻译法2、随机引物法3、PCR法4、体外转录法探针的标记方法（第四章核酸杂交技术）（二）FISH的优缺点l1、优点：安全，稳定，周期短，定位准确，可同时检测多个靶序列，直观可靠l2、缺点:较短的探针cDNA杂交效率低，易漏诊，需结合核型分析综合诊断。（三）FISH技术的基本方法1、FISH的标本来源l（1）羊水细胞l（2）脐带血l（3）外周血l（4）胎儿细胞1、FISH的探针（着丝粒

10、探针）2、FISH的探针（特异基因探针）3、FISH的检测过程玻片制备玻片制备加盖玻片加盖玻片DNARNA原位杂交原位杂交洗脱复染洗脱复染变性变性荧光显微荧光显微镜观察镜观察将探针置于将探针置于载玻片上载玻片上4、FISH的结果判读l（1）至少计数50个信号质量好的杂交细胞l（2）90以上杂交细胞正常提示正常标本l（3） 60的杂交细胞出现异常提示异常标本l（4）若无法判断可扩大技术100个杂交细胞（四）FISH技术的注意事项l1、高纯度和高标记率的探针l2、探针和待测DNA变性完全，载玻片提前预热l3、如果小于1KB的探针信号不好，可采用整个质粒DNAl4、加入硫酸葡聚糖提高复性率l5、采用

11、不同的荧光探针可进行多重原位杂交l1、非整倍体异常的检测（五）FISH技术的应用2、分辨显带技术不易分辨的异常（五）FISH技术的应用3、肿瘤性疾病的检验慢性粒细胞白血病（五）FISH技术的应用（五）FISH技术的应用二、多重连接依赖性探针扩增技术 FISH探针很长，更擅长于染色体数目异常和 大片段缺失或位置改变，那小片段缺失或重复怎么检测，点突变能否检测？二、多重连接依赖性探针扩增技术 探针和靶DNA序列进行杂交，然后通过连接、PCR扩增、产物通过毛细管电泳分离和进行数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。 二、多重连接依赖性探针扩增技术（一）MLPA技术的原理 1、样本DNA变

12、性（1）提取样本DNA。（2）DNA溶解后，冷却至室温，进行纯度及浓度检测。2、探针与靶序列杂交针对每个待测基因目标序列设计了一对探针，这一对探针包括一条经化学合成的短探针（5 端探针）和一条经M13 噬菌体衍生法制备而来的长探针（3 端探针）组成。短探针长约50-60bp，长探针长约60-450bp。填充序列：长度特异填充片段，由于填充片段长短不一而可以区分不同的探针。3、探针特异化连接连接后探针长度在130nt-480nt之间，相邻两探针相差6-9nt。MLPA技术的特色是：1.仅扩增连接完好的探针，而不是扩增样本的靶序列2.在一个反应体系中，所有连接探针的PCR扩增用的是同一对引物。4、

13、连接探针的扩增样本DNA变性探针与靶序列杂交探针特异化连接连接探针的扩增结果的检测分析（二）MLPA的技术特点l结合DNA探针杂交和PCR两种技术优点 ：1、高效，一次检测可检测45个靶序列 2、特异，可检测点突变 3、快速，24小时内完成 4、简便、成品试剂盒缺点： 1、需要精确定量样品DNA浓度 2、不能用于单细胞 3、不能检测未知点突变 4、无法检测染色体平衡易位第一种情况：目标序列没有甲基化 连接 + 酶切 不扩增1、 MS-MLPA技术 甲基化目标序列MMMM1. 变性杂交2.连接并用识别甲基化的限制性内切酶酶切检测探针能够进行连接且连接产物不会被酶切3. 3. 能够进行扩增能够进行

14、扩增未甲基化目标序列1. 变性杂交 检测探针能够进行连接但连接产物被酶切3. 3. 不能进行扩增不能进行扩增2. 连接并用识别甲基化的限制性内切酶酶切第二种情况： 目标序列甲基化 连接+不酶切 能够扩增（二）常用的MLPA方法2、RT-MLPA3、Array-MLPAl由mRNA逆转率为cDNA，以cDNA为靶序列进行MLPA，可以检测靶基因的表达水平l将MLPA和芯片技术结合起来称为Array-MLPA, 可以增加MLPA的检测能力，以微阵列和芯片代替毛细管电泳l1、检测染色体的非整倍性改变l2、检测染色体亚端粒的基因重排l3、甲基化异常的检测l4、检测单核苷酸多态性和点突变l5、基因表达检

15、测（五）MLPA技术的应用三、比较基因组杂交技术原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于肿瘤的检测及其基因组分析是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具微阵列比较基因组杂交技术(array comparative genomic hybridization, aCGH) aCGH技术图示：正常对照样品和患者样品基因组DNA用两种不同的荧光染料进行标记（正常样品用Cy3标记呈现绿色，患者样品用Cy5标记呈现红色）。绿色峰（Cy3）表明红色信号缺失，与对照样品相比患者DNA样品发生缺失。相反如果Cy5信号

16、增强显示为红色峰（红色箭头），表明患者DNA样品特定基因组区域发生获得。aCGH芯片能够定位DNA拷贝数量变化在基因组的位置。 肿瘤DNA和对照DNA在染色体上的相对结合量取决于两种DNA标本中相应杂交序列的多少 因此可根据不同荧光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中DNA的增加或丟失FluorescentLabelingReferenceTestCo-HybridizationScanningData AnalysisNormal Normal Ratio =Ratio =2 2/ /2 2=1=1loglog2 2Ratio = 0Ratio = 0Deletion: Deletion: Ra

17、tio =Ratio =1 1/ /2 2loglog2 2Ratio = -1Ratio = -1Duplication: Duplication: Ratio =Ratio =3 3/ /2 2loglog2 2Ratio = 0.58Ratio = 0.58四、微阵列比较基因组杂交技术Prader-willi综合症15号染色体q11.2-q13的缺失将引起PWS的发生，主要表现为智力低下和肥胖。染色体微阵列(chromosomal microarray analysis,CMA)技术优势l全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常如染色体微缺失(deletion)和微重复(dupli

18、cation)，并能较准确的测定其大小，并精确定位。l不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水(amniotic fluid, AF)和绒毛膜绒毛(chorionic villus sampling, CVS) 样本，出报告速度更快，结果更加准确可靠。l检测10%水平的嵌合体l鉴定杂合子缺失LOH和单亲二倍体(uniparental disomy ，UPD)，亲缘关系的分析。l分辨率高：30Kbl结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测-PGS/PGDCMA局限性：不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗伯逊易位、倒位、平衡插入）不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病(如脆性X染色体综合

19、征）不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象不能检测三倍体以上的多倍体会检测出临床意义不明拷贝数变异(copy number variants, CNVs)。CMA基因芯片染色体核型分析FISH检测范围整套染色体数目异常和微缺失、微重复结构异常整套染色体数目异常，大片段缺失、重复，平衡及不平衡易位，倒位靶向检测细胞培养不需要需要两者均可单亲二倍体YesNoNo近亲结婚YesNoNo分辨率30Kb5-10Mb100Kb嵌合体YesYesYes染色体芯片与传统细胞遗传学技术比较第三节染色体病的分子生物学检测染色体病的类型染色体病染色体病性染色体病性染色体病常染色体病常染色体病21三体综合征三

20、体综合征18三体综合征三体综合征猫叫综合征猫叫综合征13三体综合征三体综合征脆性脆性X染色体综合征染色体综合征XXY综合征综合征XXX综合征综合征克兰费尔特综合征克兰费尔特综合征特纳综合征特纳综合征染色体病类型非整倍体异常的检测（以非整倍体异常的检测（以DownDown综合征为例）综合征为例）1 1、FISHFISH一、染色体数目异常的分子生物学检测2、聚合酶链反应分析 荧光定量PCR特定DNA片段体外扩增技术(21号染色体微卫星序列STR) 高温下双链靶DNA解旋低温下使引物与靶DNA互补结合在酶的作用下使引物沿模板扩增3、MLPA技术对于非整倍体的检测市场上已有专用试剂盒 预先设计36对检

21、测探针，其中4对探针针对Y染色体，而针对13、18、21和X染色体分别各有八对，通过杂交，连接，扩增的一系列步骤最终生成PCR产物。通过电泳后产物量与正常对照比较得出结论。 儿童发育迟缓和智力低下的Array-CGH检测 其高分辨率，用于核型分析和FISH无法确诊的病例对于传统的G带分析显示不明的患儿进行全基因组拷贝数变异的筛查。 二、染色体结构异常的分子生物学检测 部分先天性心脏病的MLPA检测染色体22q11区域发生基因拷贝数异常（22q11微缺失）是大部分先天性心脏病的明确病因。针对22q11区域设计48条检测探针。进行杂交，连接，扩增后产物与正常对照进行比较。二、染色体结构异常的分子生

22、物学检测第四节产前染色体异常的分子生物学检测产前诊断的实验室方法和进展l唐氏筛查l染色体核型分析l荧光原位杂交技术 FISHl聚合酶链反应分析 PCRl基因组微阵列杂交分析 Array CGHl全基因组测序妊娠15-20周时抽血5mL测定AFP，HCG，uE3将孕妇的基本资料填写在申请单上OSB危险度1:1152电脑算出唐氏症的合并危险度怀疑NTD做胎儿超声波检查唐氏症儿筛查流程图待续唐氏症危险度1/270唐氏症危险度1/270以超声波确认孕周发阴性报告并追踪妊娠结果及由新生儿科医师来确认婴儿是否正常不符合符合发阳性报告并建议孕妇羊水穿刺，细胞染色体检查修订周数重新计算，若周数不足15周则待1

23、5周时再行检测母血重新计算正常异常追踪妊娠结果由新生儿科医师来确认婴儿是否正常遗传咨询及进一步处理是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术绒毛活检取材 (10-13w) 孕中期羊膜腔穿刺羊水(18-23w) 脐带血（20周以后）染色体数量变化、平衡、不平衡易位、转位和显微镜下可见的大片段缺失和重复。 一、羊水、脐带血胎儿染色体异常检测材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、重复或易位染色体亚端粒区域异常诊断率较低单细胞分析单细胞分析 高分辨率分析高分辨率分析荧光原位杂交技术（FISH)可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断可对相应位

24、点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断 提高了染色体异常的诊断精度提高了染色体异常的诊断精度FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交-无需细无需细胞培养，可用于单细胞分析胞培养，可用于单细胞分析Chromosome 13q13-14荧光标记的荧光标记的DNA探针探针中期分裂相中期分裂相间期细胞核间期细胞核Chromosome 21q21FISH局限性只能检测已知突变的疾病，对背景未知的基因引发的疾病无法检测。一次最多只能检测5-8个位点，无法进行整个基因组的检测，增加探针又会面临准确性下降的问题。对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力 胎儿游离DNA特征二、孕妇外周血检测胎儿染色体异常是一项基于高通量测序和生物信息分析技术的新型唐氏综合征产前筛技术；仅需10ml 孕妇静脉外周血；l即可准确地判断胎儿是否患有21-21-三体综合征（唐氏综合征）、三体综合征（唐氏综合征）、18-18-三体综合征（爱德华氏综合征）、三体综合征（爱德华氏综合征）、13-13-三体综合征（帕陶氏综合三体综合征（帕陶氏综合症）症）；准确率 99.9%以上；无创产前胎儿DNA检测技术