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1、维生素维生素C的提取及的提取及含量测定含量测定一、实验目的一、实验目的学习维生素学习维生素C的重要性质的重要性质 掌握掌握2,6-二氯酚靛酚法测定维生素二氯酚靛酚法测定维生素C的的原理和方法原理和方法二、实验原理二、实验原理维生素维生素C的结构与性质的结构与性质维生素定量测定维生素定量测定结构与性质结构与性质维生素维生素C/L-抗坏血酸抗坏血酸(ascorbic acid)多羟基，内酯；酸性；多羟基，内酯；酸性；易被氧化：中、碱性，热，光，重金属破坏易被氧化：中、碱性，热，光，重金属破坏 L-L-抗坏血酸抗坏血酸脱氢脱氢抗坏血酸抗坏血酸*若脱氢维生素若脱氢维生素若脱氢维生素若脱氢维生素C C进
2、一步氧化，则失去活性进一步氧化，则失去活性进一步氧化，则失去活性进一步氧化，则失去活性 维生素维生素C的功能的功能维生素维生素C C是重要的是重要的供氢体供氢体促进胶原合成促进胶原合成坏血病坏血病 来源来源 新鲜水果及新鲜水果及蔬菜蔬菜:橙类橙类、番、番茄茄、辣椒、辣椒 富含维生素富含维生素C量高的食物（毫克量高的食物（毫克/100克食物克食物)酸酸 枣枣830-1170猕猴桃猕猴桃568枣枣 549辣辣 椒椒185山山 楂楂89柿子椒柿子椒89菜菜 花花88金花菜金花菜85苦苦 瓜瓜84雪里红雪里红83豌豆苗豌豆苗53油油 菜菜51橙橙 49柚柚 41柠柠 檬檬40柑柑 橘橘34水萝卜水萝卜
3、34大白菜大白菜19西红柿西红柿12芥菜头芥菜头80青青 蒜蒜77 2,6-二氯酚靛酚二氯酚靛酚 氧化还原指示剂氧化还原指示剂三、实验内容三、实验内容样品处理：样品处理：2.0g猕猴桃猕猴桃510ml 2%的草酸研磨成浆状的草酸研磨成浆状 50ml的容量瓶定容的容量瓶定容过滤过滤标准液滴定：标准液滴定：5ml 1草酸草酸+5ml 0.001molL维生素维生素C(176.13)2,6-D滴定到浅红色，滴定到浅红色，30s；3次次（10 x2,6-D)计算计算1ml 2,6-D相当于维生素相当于维生素C的的mg数数T C C：抗坏血酸的浓度（：抗坏血酸的浓度（：抗坏血酸的浓度（：抗坏血酸的浓度（
4、mg/mlmg/ml）V1V1：抗坏血酸的量（：抗坏血酸的量（：抗坏血酸的量（：抗坏血酸的量（mlml）V2V2：消耗染料溶液的量（：消耗染料溶液的量（：消耗染料溶液的量（：消耗染料溶液的量（mlml）样品滴定：样品滴定：50ml 锥形瓶：滤液锥形瓶：滤液5ml（移液管）（移液管）2,6-D滴定到浅红色，滴定到浅红色，30s；3次次空白滴定：空白滴定：50ml 锥形瓶：锥形瓶：5ml l草酸草酸2,6-D滴定到浅红色，滴定到浅红色，30s；3次次计算结果计算结果100g 样品含维生素样品含维生素C的的mg数数=Bx(A-E)xTx100/CxDA滴定样品所消耗的滴定样品所消耗的2,6-二氯酚靛
5、酚钠的平均二氯酚靛酚钠的平均 毫升数；毫升数；E滴定空白所消耗的滴定空白所消耗的2,6-二氯酚靛酚钠的平均二氯酚靛酚钠的平均毫升数；毫升数；B样品提取液的总体积（样品提取液的总体积（50ml）；）；C每次滴定所用的提取液的毫升数（每次滴定所用的提取液的毫升数（5ml）；）；D提取所用的样品重量（提取所用的样品重量（2g）；）；T 1ml 2,6-D相当于维生素相当于维生素C的的mg数。数。四、操作要点四、操作要点定容定容过滤过滤移液管使用移液管使用滴定管的使用滴定管的使用滴定滴定思考题思考题为什么维生素为什么维生素C标准溶液要用新鲜配制的？标准溶液要用新鲜配制的？为准确测得维生素为准确测得维生
6、素C的含量，实验时要注意的含量，实验时要注意那些操作步骤？那些操作步骤？多酚氧化酶的制备多酚氧化酶的制备和性质研究和性质研究一、实验目的一、实验目的了解植物组织褐变和多酚氧化酶的关系。了解植物组织褐变和多酚氧化酶的关系。学习多酚氧化酶的提取和活力测定方法学习多酚氧化酶的提取和活力测定方法了解影响酶促反应速度的各种因素了解影响酶促反应速度的各种因素二、实验原理二、实验原理酶的分离纯化：酶的分离纯化：材料的选择（新鲜、目的蛋白含量高）材料的选择（新鲜、目的蛋白含量高）分离过程中避免一切可能引起变性的条件分离过程中避免一切可能引起变性的条件蛋白质的纯化一般在低温下进行（蛋白质的纯化一般在低温下进行（
7、4oC）细胞破碎：机械破碎细胞破碎：机械破碎分离目的蛋白：盐析法分离目的蛋白：盐析法多酚氧化酶催化的反应多酚氧化酶催化的反应邻苯二酚邻苯二酚邻苯醌邻苯醌三、实验内容三、实验内容多酚氧化酶的制备：多酚氧化酶的制备：50g小块土豆小块土豆+50ml氟化钠（氟化钠（600g/班）班）捣碎机中研磨捣碎机中研磨30s 3-5层纱布过滤（层纱布过滤（40-45ml滤液滤液/组）组）等体积饱和硫酸铵，等体积饱和硫酸铵，4，30min 离心离心4，4000r/min，20min沉淀沉淀+15ml柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液离心离心4，4000r/min，15min上清上清多酚氧化酶粗制品多酚氧化酶粗制品 多酚氧化
8、酶的性质多酚氧化酶的性质多酚氧化酶的作用多酚氧化酶的作用：催化的反应：催化的反应多酚氧化酶的化学性质：稳定性多酚氧化酶的化学性质：稳定性底物专一性（邻苯二酚，对苯二酚，间苯二酚底物专一性（邻苯二酚，对苯二酚，间苯二酚）底物浓度底物浓度酶浓度酶浓度氢离子浓度氢离子浓度（移液管）（移液管）四、操作要点四、操作要点公用试剂的使用、玻璃器皿清洁、定量、定时公用试剂的使用、玻璃器皿清洁、定量、定时离心机及其使用离心机及其使用 离心机是利用离心力对混合液（含有固形物）进行离心机是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种专用仪器。分离和沉淀的一种专用仪器。普通（非冷冻）离心机：转速小于普通（非冷
9、冻）离心机：转速小于4000rpm(Rotate Per Minute)，台式高速离心机最大转速可，台式高速离心机最大转速可18000rpm。低速冷冻离心机低速冷冻离心机：转速一般不超过：转速一般不超过4000rpm 高速冷冻离心机高速冷冻离心机：转速可达：转速可达20000rpm，收集微生物、，收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸沉淀物以及免细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸沉淀物以及免疫沉淀物等。疫沉淀物等。超速离心机超速离心机：转速可达：转速可达50000rpm，能使亚细胞器分，能使亚细胞器分级分离，并用于蛋白质、核酸分子量的测定等。级分离，并用于蛋白质、核酸分子量的测定等。转转
10、头头50 Ti RotorJA 20.1 Rotor JA-18 RotorJA17 Rotor离心管离心管开启离心机控制电闸开启离心机控制电闸打开离心机电源开关打开离心机电源开关选择转头选择转头将转头放入离心机内预冷将转头放入离心机内预冷平衡离心管平衡离心管离心管放入转头、拧紧转头盖离心管放入转头、拧紧转头盖关闭离心机盖关闭离心机盖设定离心转头速度、温度、时间，开始离心设定离心转头速度、温度、时间，开始离心离心结束后离心结束后 取出离心样品管取出离心样品管 取出转头，擦干、清洁转头取出转头，擦干、清洁转头 关闭离心机电源开关关闭离心机电源开关 关闭离心机控制电闸关闭离心机控制电闸五、思考题五、思考题为什么滤液为红色时应重新取材提取多酚氧为什么滤液为红色时应重新取材提取多酚氧化酶？化酶？怎样可以使切好的土豆丝不变色？怎样可以使切好的土豆丝不变色？怎样配制怎样配制1000ml柠檬酸缓冲液（柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8）