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1、丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析 摘要目的：建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培育体系。方法：考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培育时间诱导丹参毛状根的效率，共培育外植体用400gL-1Cef水除菌5min，接种在MS+400gL-1Cef+2.5gL-1Hyg的固体培育基上，完全除菌后转接入6，7V+2.5gL-1Hyg液体培育基继代培育，GFP荧光检测阳性毛状根，PCR检测农杆菌特征基因rolC，并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。结果：用丹参叶片基部诱导毛状根，胜利率可达到93.3%；农杆菌侵染10min诱导效率最高为63.3%；共培育23d诱导效果最好；P
2、CR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性；丹参毛状根生物量改变与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论：胜利建立起丹参转基因毛状根离体培育体系，为进一步的基因工程应用打下基础。 关键词丹参；毛状根；转基因；离体培育 稿件编号20220330008 基金项目国家自然科学基金项目 通信作者*黄璐琦，探讨员，Tel：640144112955，Email：huangluqi263net 唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge是治疗心血管系统疾病的临床常用中药，主要含有2种有效成分，脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物，具有抗菌消炎、抗血栓形成、抗心肌缺
3、血、保肝及抗氧化的作用1，有着广袤的应用前景。但由于丹参野生资源有限，有效成分在原植物根中含量低、生长周期长等缘由，原料药的供应在数量和质量上都不能满意临床应用的需求2。 利用生物技术方法获得有用的次生代谢产物是药用植物代谢工程的一个重要手段。由发根农杆菌Agrobacteriumrhizogenes感染植物形成的毛状根系统，生长速度快、周期短、遗传稳定，不须要外源植物激素，合成次生代谢物质实力强，成为生产药用成分的良好培育系统3，尤其对于根类药材的药用成分积累有着广泛应用，如人参Panaxginseng4、萝芙木Rauvolfiaverticillata5、朝鲜当归Angelicagigas
4、6等。然而，毛状根中次生代谢物含量通常较低，积累丹参有效成分特殊是丹参酮类成分的实力始终无法达到生药水平7。一些探讨中应用诱导子银离子、茉莉酸甲酯、水杨酸等刺激某些次生代谢物积累，但诱导效果不稳定，且诱导机制不明，制约其发展。进行代谢途径改良，建立稳定高产的毛状根株系是药用植物次生代谢工程的一种有效工具。如在莨菪中共转化1，4丁二胺氮甲基转移酶基因和莨菪碱6羟化酶基因，使转基因莨菪发根中东莨菪碱含量比野生型提高了9倍，大大提高了莨菪烷类生物碱的合成与积累8。项目组通过前期的转录组学探讨，积累了大量的关键酶基因，为针对丹参毛状根代谢途径进行遗传改造，在本探讨中，利用含有绿色荧光过表达载体pH7W
5、G2D的发根农杆菌Accc10160侵染丹参叶片产生毛状根，胜利建立起适合丹参转基因毛状根离体生长的稳定转基因体系，为应用次生代谢工程手段提高其有效成分含量，促进产业化发展和应用奠定基础。 1材料和方法 1.1试剂 植物基因组DNA提取试剂盒，MS培育基，6，7V培育基，头孢霉素，利福平，壮丽霉素，潮霉素，过表达空载体pH7WG2D，ExTaq，倒置荧光显微镜，PCR扩增仪，Accc10160农杆菌菌株由中科院植物所漆小泉课题组惠赠，二氢丹参酮I购自江西本草天工科技有限责任公司。 1.2丹参外植体培育 陕西商洛天士力药材基地丹参种子，经本试验室郝近大探讨员鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参Smilt
6、iorrhiza。选择饱满无破损的丹参种子用自来水冲洗30min后用无菌水漂洗3次，吸干水分用75%乙醇浸泡45s，0.01%升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗45次，接种至MS固体培育基上，下暗培育3d，未染菌的种子转至光照培育1周后可得到无菌幼苗，接着光照培育1520d，得到无菌植株，备用。 1.3农杆菌的活化扩增 过表达载体质粒转化Accc10160菌株，PCR及测序验证正确的阳性克隆转接于1mL新的含有50mgL-1Rif和80mgL-1Spe的YEB液体培育基中，28，220rmin-1活化过夜，以150的比例转接于15mL含有相同抗生素的YEB液体培育基中扩大培育，28，220rm
7、in-1振荡培育至A6000.5左右，将菌液倒入无菌离心管中，44000rmin-1离心10min，弃上清夜，用等体积的MS液体培育基重悬沉淀菌体，备用。 1.4毛状根诱导及选择培育 选取幼嫩的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5cm0.5cm的小块，茎段切成0.5cm长，并用刀片将叶片和茎段表面轻轻划伤，将外植体背面对上置于MS固体培育基上，每种材料接种30个，25黑暗中预培育2d。将同种预培育材料放入MS重悬液的三角瓶中，分别浸染0，5，10，15，20min，考察侵染时间对诱导效率的影响。取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培育基上，黑暗中共培育0，1，2，3，4d，考察不同的共培育
8、时间对诱导效率的影响。每个时间点均取30个外植体。将共培育的外植体用无菌水清洗3次，400mgL-1Cef水浸泡5min左右，无菌水洗1次，吸干水分后移入含400mgL-1Cef和2.5mgL-1Hyg的MS固体培育基上，于黑暗中进行筛选培育，每7d更换1次培育基。长至2030cm的抗性毛状根，切下单独标号继代培育，多次继代直至完全除菌后将阳性根转入只含有Hyg的MS固体培育基。30d后统计毛状根数并计算诱导率。 1.5转基因毛状根的GFP鉴定和PCR鉴定 将含毛状根的培育皿放在倒置荧光显微镜下，在蓝色激发光源下视察。 取丹参簇新叶片和毛状根各0.1g，用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，
9、纯化后作为PCR扩增模板。依据已发表的序列设计Ri质粒中rolC基因的PCR引物。扩增体系：DNA50ng，10缓冲液2.5L，PF和PR引物各0.5L，Taq酶0.3L，dNTP2L，加水至25L。反应条件：94预变性4min；94变性30s，55退火30s，73延长1min，30个循环；7310min。琼脂糖凝胶电泳分别扩增后产物进行染色分析。以丹参叶片DNA为阴性比照，以非转基因丹参毛状根作为阳性比照。 1.6转基因毛状根生长曲线及丹参酮类物质积累 经过上述筛选的阳性毛状根在长至5cm后，移入含有2.5mgL-1Hyg的6，7V液体培育基中，25110rmin-1暗培育。取同一株系生长旺
10、盛的丹参转基因毛状根1g鲜重，无菌条件下接种至101mL三角瓶中，共计15瓶，从继代培育第20天起先，每隔10d取出毛状根在37培育箱干燥48h至恒重后测定干重，每次取3瓶，计算平均值，绘制生长曲线。 精确称取干燥至恒重的毛状根50mg于2mL的EP管中，加入两颗甲醇浸泡过夜的磁珠，球磨机研磨45s，加入1.5mLMeOH，25超声45min，补足体积至2mL，1万rmin-1离心1min，取上清，过0.45m微孔滤膜，用于HPLC含量测定。二氢丹参酮I的含量测定方法参照梁宗锁等9方法。 2结果与探讨 2.1不同诱导条件对诱导效率的影响 2.1.1不同外植体的影响结果表明，相同条件下，不同外植
11、体诱导效果不同。叶片基部诱导效率最高，可以达到93.3%，此部位叶脉较粗，传递和运输作用较强，对于农杆菌的侵染敏感度较高。非叶片基部和茎段也可诱导产生毛状根，但诱导效率明显不如叶片基部，分别为43.3%，73.3%。不同外植体上毛状根产生的时间也不同，叶片基部在暗培育15d左右，可见白色毛根长出，茎段其次，一般须要2030d，叶片边缘时间最长，产生的毛状根也最少。 a叶片基部用于丹参毛状根诱导效果较好；b，c单独标号继代培育的毛状根；d摇瓶中继代培育的毛状根在20，30，40，50，60d时的生长状态。 2.1.2侵染时间的影响外植体在农杆菌液中侵染10min可达到最佳诱导效果，诱导率63.3
12、%，随着时间延长，诱导率渐渐下降，侵染20min时仅为13.3%。菌液浓度干脆影响着农杆菌侵染效率，浓度越大，侵染时间越长，菌液与外植体接触面积越大，农杆菌中的Ri质粒更易进入外植体内，但菌液浓度过高也会导致农杆菌对外植体的过度损害致死，或后期不能完全除菌，农杆菌过度增殖抑制毛根的产生。 2.1.3共培育时间的影响不经共培育的外植体诱导生根率为0，随着共培育时间延长，诱导率渐渐提高，共培育23d诱导率分别达到567%，467%，接着培育则诱导率显著下降。共培育是为了诱导农杆菌中vir基因的表达，将其携带的外源基因转化进入外植体的过程10，共培育时间过长农杆菌增殖严峻，毒害外植体，不利于发根长出
13、，时间过短则转化效率降低。 2.2转基因根系的建立 2.2.1转基因毛状根GFP荧光检测潮霉素抗性平板生长起来的毛状根，经GFP荧光检测转化率可达到887%。过表达载体pH7WG2D中含有加强型绿色荧光蛋白编码基因，这是一个可见的非破坏性标签，可由蓝色光激发下放射出稳定的绿色荧光，是目前应用特别广泛的细胞内蛋白质定位和示踪分子之一，在转基因丹参毛状根中，可以应用这一标签对转化株系进行鉴定。 2.22PCR检测结果rol基因是限制毛根形成的基因，在不同类型的Ri质粒中均有存在1112，可以作为鉴定农杆菌的特征性片段。PCR鉴定结果表明，空载体转化株系与野生型毛状根均出现了预期条带，而叶片DNA中
14、未扩增出rolC片段，初步说明TDNA已经整合至丹参毛状根基因组内。 MDNA相对分子质量；NC丹参叶片DNA；WT不含质粒的农杆菌介导的毛状根；1，2，3，4转基因毛状根株系；rolC农杆菌特征基因。 Fig3PCRidentificationoftransgenichairyrootsofSalviamiltiorrhiza 2.3毛状根生物量与二氢丹参酮含量 对培育50d的野生型和转基因株系中二氢丹参酮I含量检测结果表明，不同根系中二氢丹参酮I含量差别显著，含量最低的WT1株系仅为1.89mgg-1，最高的V3株系达到3.77mgg-1；相同接种量的毛状根收获时生物量也不同，最重的WT3
15、株系在50mL培育体系中生物量为0.68g，说明每一条毛状根都是一个独立的转化体系，不同根系生长差异显著，但野生型与转基因毛状根株系相比没有显著性差异。 Table4DyhdrotanshinoneIcontent，biomassandyieldofhairyrootsaftersubculturedfor50d 丹参毛状根生物量的积累是一个动态过程，以V3转基因根系为例，继代培育40d以内生物量快速积累，毛状根由白色渐渐变成黄色、深黄色，40d以后丹参毛状根增殖速率减慢，起先进入次生代谢物积累阶段，毛状根颜色进一步加深，呈现出红黄色、红色以及粗大的表型；60d时虽然毛根生物量的肯定值有所增加
16、，但生长速率更慢，有些毛根起先变成黄褐色，甚至发黑、老化。因此，丹参毛状根的继代培育周期应在40d以内，以维持毛状根生长所需养分，改善生长环境。 3探讨 目前，萜类代谢工程探讨已经取得了长足进步。大肠杆菌和酵母以其生长快速、基因操作相对简洁等优势已经取得了较大进展，如在大肠杆菌中过表达DXP途径上的关键酶基因，提高类胡萝卜素含量13；导入可生成GPP和GGPP的操纵子后，番茄红素的产量提高到原来的6倍14；在酵母中导入截短后的HMGCoA还原酶基因，引起固醇合成前体鲨烯类物质的大量生成15等。在高等植物中导入外源基因作为重要萜类的生源探讨也取得了一些胜利的例子，如将来源于藻类的编码类胡萝卜素的
17、酮酶cDNA与烟草Pds启动子融合和转入烟草，可检测到虾青素16；将柠檬中的单萜合酶转入烟草，提高了烟草中的单萜产量，并变更了烟草中单萜成分的组成17。本文建立的转基因丹参毛状根体系，能有效用于解析丹参中有效成分的生物合成，同时为其工业化生产打下基础。 参考文献 1任德成，杜冠华，张均甜总丹酚酸对脑缺血再灌注损伤的爱护作用J中国药理学通报，2002，18：221 2邱德友，宋经元，马小军，等丹参毛状根生物反应器大规模培育的探讨J分子植物育种，2004，2：733 3陈秀清发根农杆菌诱导毛状根探讨进展J安徽农业科学，2022，39：9514 4刘峻，丁家宜，徐红，等Ri质粒人参转化系统的建立及鉴
18、定J中国中药杂志，2001，26：101 5孙敏，汤绍虎转化毛状根获得萝芙木生物碱的探讨J生物工程学报，11013，9：290. 6RheeHS，ChoHW，SonSY，etalEnhancedaccumulationofdecursinanddecursinolangelateinrootculturesandintactrootsofAngelicagigasNakaifollowingelicitationJPlantCellTissOrganCult，2022，101：302 7ChenH，ChenFInductionofphytoalexinformationincrowngalla
19、ndhairyrootcultureofSalviamiltiorrhizabymethylviologenJBiotechnolLett，2000，22：735 8ZhangL，DingR，ChaiY，etalEngineeringtropanebiosyntheticpathwayinHyoscyamusnigerhairyrootculturesJProcNatlAcadSciUSA，2004，101：6791 9张顺仓，刘岩，沈双，等诱导子对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的影响J中国中药杂志，2022，36：1274 10曹冬梅，韩振海，许雪峰发根农杆菌Ri质粒探讨进展J中国生物工
20、程杂志，2003，23：78 11MichaelT，SpenaATheplantoncogenerolA，BandCfromAgrobacteriumrhizogenes；effectsonmorphology，development，andhormonemetabolismJMethodsMolBiol，11015，44：222 12KiyokawaS，KobayashiK，KikuchiY，etalRootinducingregionofmikimopinetypeRiplasmidpRi1734JPlantPhysiol，11014，104：802 13MatthewsPD，Wurtze
21、lETMetabolicengineeringofcarotenoidaccumulationinEscherichiacolibymodulationoftheisoprenoidprecursorpoolwithexpressionofdeoxyxylulosephosphatesynthaseJApplMicrobiolBiotechnol，2000，53：400. 14ReilingKK，YoshikuniY，MartinVJ，etalMonoandditerpeneproductioninEscherichiacoliJBiotechnolBioeng，2004，87：212 15P
22、olakowskiT，StahlU，LangCOverexpressionofacytosolichydroxymethylglutarylCoAreductaseleadstosqualeneaccumulationinyeastJApplMicrobiolBiotechnol，19101，49：73 16WallaartTE，BouwmeesterHJ，HilleJ，etalAmorpha4，11dienesynthase：cloningandfunctionalexpressionofakeyenzymeinthebiosyntheticpathwayofthenovelantimala
23、rialdrugartemisininJPlanta，2001，212：465 17LCkerJ，SchwabW，HautumBV，etalIncreasedandalteredfragranceoftobaccoplantsaftermetabolicengineeringusingthreemonoterpenesynthasesfromlemonJPlantPhysiol，2004，134：519 责任编辑吕冬梅 第12页 共12页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页第 12 页 共 12 页