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1、病毒感染的实验室诊断病毒感染的实验室诊断病毒感染的实验诊断方法 病原学诊断病原学诊断 病毒分离培养病毒分离培养病毒分离培养病毒分离培养显微镜检查显微镜检查显微镜检查显微镜检查抗原检测抗原检测抗原检测抗原检测核酸检测核酸检测核酸检测核酸检测血清学诊断血清学诊断 抗体检测抗体检测抗体检测抗体检测 IgMIgM、IgGIgG一、标本采集与运送（一）标本采集（一）标本采集（一）标本采集（一）标本采集采集时间：尽早采集（越早越好）采集时间：尽早采集（越早越好）采集时间：尽早采集（越早越好）采集时间：尽早采集（越早越好）标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类：根据感染的部位、可能感染的病
2、毒类型选择标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择（二）标本的运送与保存1.1.低温送检低温送检低温送检低温送检 4 4可保存数小时可保存数小时可保存数小时可保存数小时-7070可长期保存可长期保存可长期保存可长期保存 -10 10 -2020下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 对冷冻标本应避免反复冻融对冷冻标本应避免反复冻融对冷冻标本应避免反复冻融对冷冻标本应避免反复冻融2.2.保湿送检保湿送检保湿送检保湿送检 50%50%甘油盐水保存
3、送检甘油盐水保存送检甘油盐水保存送检甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（病毒转运培养基（病毒转运培养基（病毒转运培养基（virus transport medium virus transport medium，VTMVTM）含）含）含）含0.5%0.5%明明明明胶或牛血清白蛋白的胶或牛血清白蛋白的胶或牛血清白蛋白的胶或牛血清白蛋白的HankHank s s液液液液3.3.无菌送检无菌送检无菌送检无菌送检 抑制细菌生长抑制细菌生长抑制细菌生长抑制细菌生长 100U/ml100U/ml青霉素青霉素青霉素青霉素100g/ml100g/ml链霉素链霉素链霉素链霉素 抑制真菌生长抑制真菌生长抑制真菌生长
4、抑制真菌生长 2.52.5gggg/ml/ml二性霉素二性霉素二性霉素二性霉素B B 或或或或40 g/ml40 g/ml制霉菌素制霉菌素制霉菌素制霉菌素二、病毒的分离与鉴定（一）病毒分离和鉴定的一般程序（一）病毒分离和鉴定的一般程序 动物接种动物接种组织培养组织培养标本采集标本采集标本处理后接种标本处理后接种鸡胚接种鸡胚接种卵黄囊膜卵黄囊膜尿囊液尿囊液羊膜腔液羊膜腔液绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜观察囊膜病变观察囊膜病变血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验CPEEM包涵体包涵体空斑试验空斑试验红细胞吸附红细胞吸附中和试验中和试验观察发病观察发病抗原检测抗原检测抗体检测抗体检测病理检查病理检查（二）
5、病毒的分离组织培养组织培养组织培养组织培养鸡胚培养鸡胚培养鸡胚培养鸡胚培养动物接种动物接种动物接种动物接种1.组织培养将将将将人人人人或或或或动动动动物物物物离离离离体体体体的的的的活活活活组组组组织织织织或或或或分分分分散散散散的的的的活活活活细细细细胞胞胞胞在在在在体体体体外外外外人人人人工工工工控控控控制制制制的的的的条件下使其生长繁殖的一种技术。条件下使其生长繁殖的一种技术。条件下使其生长繁殖的一种技术。条件下使其生长繁殖的一种技术。组织培养的类型组织培养的类型组织培养的类型组织培养的类型（1 1）组织块培养）组织块培养）组织块培养）组织块培养（2 2）器官培养）器官培养）器官培养）器
6、官培养 人胚气管呼吸道病毒；人胚肠肠道病毒人胚气管呼吸道病毒；人胚肠肠道病毒人胚气管呼吸道病毒；人胚肠肠道病毒人胚气管呼吸道病毒；人胚肠肠道病毒（3 3）细胞培养）细胞培养）细胞培养）细胞培养 最常用最常用最常用最常用 原代和次代细胞培养原代和次代细胞培养原代和次代细胞培养原代和次代细胞培养 二倍体细胞培养二倍体细胞培养二倍体细胞培养二倍体细胞培养 传代细胞培养传代细胞培养传代细胞培养传代细胞培养 动动动动物物物物新新新新鲜鲜鲜鲜组组组组织织织织（人人人人胚胚胚胚肾肾肾肾等等等等）胰胰胰胰酶酶酶酶消消消消化化化化营营营营养养养养液液液液培培培培养养养养单层细胞（原代细胞）单层细胞（原代细胞）单
7、层细胞（原代细胞）单层细胞（原代细胞）原代细胞原代细胞原代细胞原代细胞胰酶消化胰酶消化胰酶消化胰酶消化转种培养（次代培养细胞）转种培养（次代培养细胞）转种培养（次代培养细胞）转种培养（次代培养细胞）对病毒敏感，但制备费时费力，只能传对病毒敏感，但制备费时费力，只能传对病毒敏感，但制备费时费力，只能传对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2 23 3代。代。代。代。二二二二倍倍倍倍体体体体细细细细胞胞胞胞株株株株 原原原原代代代代细细细细胞胞胞胞反反反反复复复复传传传传代代代代（50507070代代代代）仍仍仍仍保保保保持持持持二二二二倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。倍体染色体特性。
8、病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。传传传传代代代代细细细细胞胞胞胞系系系系 来来来来源源源源于于于于肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞或或或或突突突突变变变变的的的的二二二二倍倍倍倍体体体体细细细细胞胞胞胞，能能能能在在在在体体体体外外外外无无无无限限限限增增增增殖殖殖殖。增增增增殖殖殖殖快快快快，不不不不易易易易衰衰衰衰老老老老，易易易易于于于于传传传传代代代代保保保保存存存存。常常常常用用用用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。于病毒的分离鉴定，但不能用于制备
9、疫苗。于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。原代和次代培养细胞原代和次代培养细胞2.2.鸡胚培养鸡胚培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养接种途径及方法接种途径及方法接种途径及方法接种途径及方法 新鲜受精卵新鲜受精卵新鲜受精卵新鲜受精卵 接种病毒接种病毒接种病毒接种病毒3839713d卵黄囊接种卵黄囊接种羊膜腔接种羊膜腔接种尿囊腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤3.动物接种常常常常用用
10、用用动动动动物物物物 小小小小鼠鼠鼠鼠、大大大大白白白白鼠鼠鼠鼠、豚豚豚豚鼠鼠鼠鼠、家家家家兔兔兔兔、猴猴猴猴等等等等。不不不不同同同同病病病病对对对对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。接种途径接种途径接种途径接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：乙型脑炎病毒及狂犬病毒乙型脑炎病毒及狂犬病毒乙型脑炎病毒及狂犬病毒乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种小鼠脑内接种小鼠
11、脑内接种小鼠脑内接种柯萨奇病毒柯萨奇病毒柯萨奇病毒柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种乳鼠腹腔接种乳鼠腹腔接种乳鼠腹腔接种乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒乙肝病毒 黑猩猩静脉注射黑猩猩静脉注射黑猩猩静脉注射黑猩猩静脉注射流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒 鼻腔滴种鼻腔滴种鼻腔滴种鼻腔滴种用途用途用途用途分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清（三）病毒的鉴定病毒的初步鉴定病毒的初步鉴定病毒的初步鉴定病毒的初步鉴定动物感染范围及潜伏期动物感染范围及潜伏期动物感染范围及潜伏期动物感染范围及潜伏期对鸡胚的敏感性对鸡胚的敏感性对
12、鸡胚的敏感性对鸡胚的敏感性在细胞培养中的表现在细胞培养中的表现在细胞培养中的表现在细胞培养中的表现理化性质的测定理化性质的测定理化性质的测定理化性质的测定最后鉴定最后鉴定最后鉴定最后鉴定血血血血清清清清学学学学鉴鉴鉴鉴定定定定:中中中中和和和和试试试试验验验验、补补补补体体体体结结结结合合合合试试试试验验验验、血血血血凝凝凝凝抑抑抑抑制制制制试验等试验等试验等试验等分离的新病毒，必须进行系统的鉴定分离的新病毒，必须进行系统的鉴定分离的新病毒，必须进行系统的鉴定分离的新病毒，必须进行系统的鉴定病毒在细胞培养中的表现病毒在细胞培养中的表现（1 1）细胞代谢作用改变）细胞代谢作用改变）细胞代谢作用改
13、变）细胞代谢作用改变（培养液颜色变化）（培养液颜色变化）（培养液颜色变化）（培养液颜色变化）正常细胞代谢：正常细胞代谢：正常细胞代谢：正常细胞代谢：培养液由红变黄培养液由红变黄培养液由红变黄培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红 病病毒毒在在细细胞胞内内增增殖殖后后，使使宿宿主主的的形形态态发发生生不不同同程程度度改改变变，这这种种由由病病毒毒增增殖殖引引起起的细胞形态变化，称为细胞病变效应。的细胞形态变化，称为细胞病变效应。（2 2）细胞病
14、变效应）细胞病变效应（cytopathic effect cytopathic effect，CPECPE）细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。某些病毒感染细胞后不出现某些病毒感染细胞后不出现CPE（3）空斑现象空斑（空斑（plaque）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由）是指在单层细胞中，由活细胞包围的由病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒病毒感染引起的死细胞的区域。一个空斑由一个病毒颗粒感染感染 所致，利用空斑可纯化病毒。所致，利用空斑可纯化病毒。不同种类病毒形成不同种类病毒形
15、成 的空斑大小和形状不同，可用于鉴定的空斑大小和形状不同，可用于鉴定病毒。病毒。（4 4）干扰现象干扰现象干扰现象干扰现象当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。（5 5）红细胞吸附及吸附抑制试验）红细胞吸附及吸附抑制试验 受受感感染染的的宿宿主主
16、细细胞胞膜膜含含病病毒毒抗抗原原（血血凝凝素素），可可吸吸附附鸡鸡、豚鼠或猴红细胞豚鼠或猴红细胞 如如果果在在培培养养瓶瓶中中加加入入相相应应的的血血凝凝素素抗抗血血清清，则则不不出出现现红红细细胞胞吸吸附附现现象象，即即红红细细胞胞吸吸附附抑制试验阳性抑制试验阳性（6 6）血凝及血凝抑制试验）血凝及血凝抑制试验 含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的
17、血凝素抗体抑制，红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于分型。称为血凝抑制试验，可用于分型。称为血凝抑制试验，可用于分型。称为血凝抑制试验，可用于分型。病毒的理化性质测定主要用于新发现病毒的鉴定主要用于新发现病毒的鉴定主要用于新发现病毒的鉴定主要用于新发现病毒的鉴定（1 1）病毒的大小及形态）病毒的大小及形态）病毒的大小及形态）病毒的大小及形态 电镜直接观察电镜直接观察电镜直接观察电镜直接观察（2 2）核酸类型）核酸类型）核酸类型）核酸类型 5-5-溴溴溴溴-2-2-脱氧尿苷（脱氧尿苷（脱氧尿苷（脱氧尿
18、苷（BUDRBUDR）能抑制）能抑制）能抑制）能抑制DNADNA复制，而不抑制复制，而不抑制复制，而不抑制复制，而不抑制RNARNA病毒。病毒。病毒。病毒。（3 3）乙醚敏感试验）乙醚敏感试验）乙醚敏感试验）乙醚敏感试验 有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性（4 4）耐酸试验）耐酸试验）耐酸试验）耐酸试验 肠道病毒耐酸，在肠道病毒耐酸，在肠道病毒耐酸，在肠道病毒耐酸，在pH3pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，的环境下稳定
19、，鼻病毒不耐酸，的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，在在在在pH3pH3的环境下被灭活的环境下被灭活的环境下被灭活的环境下被灭活病毒的血清学鉴定中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等三、病毒的血清学诊断单份血清单份血清单份血清单份血清IgMIgM测定测定测定测定 早期诊断早期诊断早期诊断早期诊断双份血清双份血清双份血清双份血清IgGIgG测定测定测定测定 4 4倍以上增长，有诊断意义倍以上增长，有诊断意义倍以上增长，有诊断意义倍以上增长，有诊断意义病毒血清学试验常用方法（一）中和试验（一）
20、中和试验 原理原理原理原理 抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。抗体与相应病毒结合后，能够使病毒失去感染性。V.V.Ab Ab 失去感染易感细胞的能力失去感染易感细胞的能力失去感染易感细胞的能力失去感染易感细胞的能力 一定量抗体可中和一定量病毒。一定量抗体可中和一定量病毒。一定量抗体可中和一定量病毒。一定量抗体可中和一定量病毒。中和试验的必要条件：中和试验的必要条件：中和试验的必要条件：中和试验的必要条件：1.1.活病毒活病毒活病毒活病毒 2.2.敏感细胞、鸡胚或动物敏感细胞、鸡胚或动物敏感细胞、鸡
21、胚或动物敏感细胞、鸡胚或动物中和试验的常用方法中和试验的常用方法中和试验的常用方法中和试验的常用方法：固定固定固定固定V.V.，稀释血清，测定抗体效价，稀释血清，测定抗体效价，稀释血清，测定抗体效价，稀释血清，测定抗体效价 （常用）（常用）（常用）（常用）固定血清，稀释固定血清，稀释固定血清，稀释固定血清，稀释V.V.，求中和指数，求中和指数，求中和指数，求中和指数中和试验的优缺点中和试验的优缺点中和试验的优缺点中和试验的优缺点特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。特异，敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。特异，
22、敏感，既可检测抗体，也可测定抗原（定属、定型）。既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。既可用细胞培养做，也可用动物或鸡胚接种，以细胞最常用。检测检测检测检测IgGIgG，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。，不能用于早期诊断，常用用于流行病学调查。（二）补体结合试验检测检测检测检测IgMIgM，常用于早期诊断。，常用于早期诊断。，常用于早期诊断。，常用于早期诊断。不需活细胞，比中和试验
23、简单，省时。不需活细胞，比中和试验简单，省时。不需活细胞，比中和试验简单，省时。不需活细胞，比中和试验简单，省时。（三）（三）IF及及ELISA方法简单、快速、敏感性高。方法简单、快速、敏感性高。方法简单、快速、敏感性高。方法简单、快速、敏感性高。四、病毒感染的快速诊断（一）病毒的形态学检查（一）病毒的形态学检查 1.光学显微镜检查光学显微镜检查 病变组织中找包涵体。病变组织中找包涵体。简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成包涵体包涵体 狂犬病毒胞浆内包狂犬病毒胞浆内包涵体（内基小提）涵体（内基小提）巨细胞病毒胞核内巨细胞病毒胞核内包涵
24、体包涵体2.2.电镜及免疫电镜检查电镜及免疫电镜检查直接检查标本中的病毒颗粒，快速，直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（可确诊。但敏感性低（106/ml）免疫电镜敏感性高，但只能用于已知免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测）病毒的检测）乙型肝炎病毒电镜图 轮状病毒电镜图（二二）病毒抗原检查）病毒抗原检查 用免疫标记技术检测：用免疫标记技术检测：DFA、IFA、IEA等等可检测细胞内、外的游离病毒抗原。敏感、特异，简便、可检测细胞内、外的游离病毒抗原。敏感、特异，简便、快速。适用于多种病毒性疾病的早期快速诊断。快速。适用于多种病毒性疾病的早期快速诊断。Influenzavirus A培养物DFA染色阳性 Influenzavirus B培养DFA染色阳性 生殖道HSV-2涂片DFA染色阳性（三）病毒核酸检测 多种分子生物学方法。检测以不同形式存在的病毒基因片多种分子生物学方法。检测以不同形式存在的病毒基因片断。敏感、特异、简便、快速，标本用量少。断。敏感、特异、简便、快速，标本用量少。核酸电泳技术核酸电泳技术核酸杂交技术核酸杂交技术PCR基因芯片技术基因芯片技术（四）早期抗体检测 检测特异性检测特异性检测特异性检测特异性IgMIgM。IFA检测血清SARS-CoV IgM抗体阳性