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1、生物课标版第36讲基因工程(包括PCR技术)考点一基因工程的工具与操作程序考点一基因工程的工具与操作程序教材研读教材研读一、基因工程的工具1.限制酶(1)存在:原核生物中。(2)作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)形成末端类型2.DNA连接酶(1)作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。(2)种类种类EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只“缝合”黏性末端黏性末端和平末端都可“缝合”3.载体(1)条件:能在受体细胞中复制并稳定保存;具有一至多个限制酶切点;具
2、有标记基因。(2)种类(3)作用:携带外源DNA片段进入受体细胞。(4)特点:可在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA进行同步复制。二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(1)目的基因:主要指编码蛋白质的基因,也可以是一些具调控作用的因子。(2)方法2.基因表达载体的构建基因工程的核心(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的构成(3)构建过程:3.将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法转化法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到T
3、i质粒的T-DNA上导入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达基因表达载体受精卵新性状个体Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定考点二基因工程的应用与蛋白质工程考点二基因工程的应用与蛋白质工程一、动物基因工程与植物基因工程1.动物基因工程:用于提高动物生长速度从而提高产品产量;用于改善畜产品品质;用转基因动物生产药物;用转基因动物作器官移植的供体等。2.植物基因工程:培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物;利用转基因改良植物的品质。二、基因诊断与基因治疗1.基因诊断:又称为DNA诊断,是采用基因检测的方法
4、来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。2.基因治疗(1)概念:把正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的。(2)成果:将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞中,治疗复合型免疫缺陷症。3.类型三、蛋白质工程1.蛋白质工程的概念疑难诊室疑难诊室(1)既然存在基因工程,为什么还要改造蛋白质?提示基因工程只能产生自然界已存在的蛋白质。(2)蛋白质工程中为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造?提示蛋白质具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;改造后的基因可以遗传给下一代,被改造的蛋白质无法遗传。考点三转基因生物的安全性与生物武器1.转基因生物存在安全
5、性问题的原因(1)目前对基因的结构、基因间的相互作用及基因的调控机制等都了解得相当有限。(2)目的基因往往是异种生物的基因。(3)外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的。2.对转基因生物安全性的争论:在食物安全、生物安全、环境安全三个方面存在激烈的争论。3.理性对待转基因技术:趋利避害,不能因噎废食。4.基因身份证(1)否定的理由:个人基因资讯的泄露造成基因歧视,势必造成遗传学失业大军、个人婚姻困难和人际关系疏远等。(2)肯定的理由:一些遗传性疾病在后代中复现率很高,通过基因检测可以及早预防,适时治疗,达到挽救患者生命的目的。5.生物武器(1)种类:致病菌、病毒、生化毒剂,以及经过基因重组的
6、致病菌等。(2)中国政府的态度:在任何情况下不发展、不生产、不储存生物 武 器,并 反 对生物武器及其技术和设备的扩散。1.判断有关基因工程工具说法的正误。(1)(2014江苏单科,23A)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别 6 个 核 苷 酸 序 列。()(2)(2014江苏单科,23C)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记 基 因。()(3)限制酶只能用于切割目的基因。()(4)DNA连接酶能使两碱基间通过氢键连接起来。()(5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工 具 酶。()(6)EcoliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。()2.判断
7、有关基因工程操作程序说法的正误。(1)(2015重庆理综,6A)表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反 转 录 获 得。()(2)(2015重庆理综,6C)借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞 筛 选 出 来。()(3)(2015重庆理综,6D)启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起 作 用。()(4)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。()(5)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。()(6)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。()(7)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为 受 体。()(8)由大肠杆菌工程菌获
8、得人的干扰素后可直接应用。()(9)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术。()3.判断下列有关蛋白质工程和转基因技术说法的正误。(1)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。()(2)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分 子 的 结 构。()(3)(2014重庆理综,2D)生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病 菌 等 来 形 成 杀 伤 力。()(4)目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性、生物安全性 和 环 境 安 全 性 上。()(5)(2014江苏单科,23D)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未 必 能 正 常 表 达。()突
9、破一基因工程的操作工具与操作程序突破一基因工程的操作工具与操作程序考点突破考点突破1.基因工程操作程序中的“三、三、二、一”(1)目的基因“三种获取方法”从基因文库中获取(基因组文库、cDNA文库)利用PCR技术扩增:其实质是在体外对目的基因进行大量复制。用PCR仪控制温度:变性(95)复性(55)延伸(72)通过DNA合成仪用化学方法人工合成(用于序列已知,且核苷酸数目较少者)、利用mRNA反转录法合成。(2)将目的基因导入受体细胞的“三种类型”导入植物细胞农杆菌转化法(花粉管通道法、基因枪法);导入动物细胞显微注射法(导入受精卵);导入微生物细胞使用Ca2+处理受体细胞。(3)目的基因检测
10、与鉴定的“两个水平”(4)基因工程操作的“一个核心”基因表达载体的构建2.PCR技术(1)原理:DNA复制,即:过程说明图解变性当温度上升到90以上时,双链DNA解聚为单链复性温度下降到50左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸72左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5端向3端延伸(2)PCR反应过程(3)结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。3.突破基因工程的五个易错点(1)基因组文库与部分基因文库不同(2)目的基因的插入位点不是随意的:基
11、因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间,若目的基因插入启动子内部,启动子将失去原功能。(3)启动子起始密码子,终止子终止密码子启动子:一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。基因文库类型基因组文库部分基因文库(cDNA文库)构建基因文库的过程某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体终止子:一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。(4)切取目的基因与切割载体时“只能”使用“同一种酶”
12、?在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体,使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。(5)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象:第一步存在PCR或人工合成法获得DNA,第二步存在黏性末端连接现象,第四步检测存在分子杂交方法。4.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理(2)操作流程考向一依托实例分析考向一依托实例分析,考查基因工程的基本操
13、作工具考查基因工程的基本操作工具1.(2016课标全国,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。图(a)图(b)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接,理由是。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA
14、片段连接起来的酶,常见的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。答案答案(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分)(2)甲和丙(2分)甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3分,其他合理答案可酌情给分)(3)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给分)解析解析(1)分析图(a)可知,限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基因能在宿主细胞中成
15、功表达,目的基因应插入在启动子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不符合要求,目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。考向二借助实例考向二借助实例,考查基因工程的操作程序考查基因工程的操作程序2.(2014课标,40,15分)植物甲具有极强的耐旱性,其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因,并将其转移到耐旱性低的植物乙中,有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题:(1)理论上,基因组文库含有生物的基因;而cDNA文库中含有生物的基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因,可首先建立该植物的基因组
16、文库,再从中出所需的耐旱基因。(3)将耐旱基因导入农杆菌,并通过农杆菌转化法将其导入植物的体细胞中,经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达,应检测此再生植株中该基因的,如果检测结果呈阳性,再在田间试验中检测植株的是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交,子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为31时,则可推测该耐旱基因整合到了(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。答案答案(15分)(1)全部(2分)部分(2分,其他合理答案也给分)(2)筛选(2分,其他合理答案也给分)(3)乙(2分)表达产物(2分,其他合理答案也给分)耐旱性(2分)(4)
17、同源染色体的一条上(3分)解析解析(1)基因组文库包含某种生物的全部基因,cDNA文库又称为部分基因文库,含有某种生物的部分基因。(2)植物甲基因组文库中有该种植物的全部基因,从中可筛选出耐旱基因。(3)植物乙的耐旱性低,所以植物乙体细胞作为受体细胞;要确定耐旱基因是否正确表达,应检测该基因的表达产物,对于个体水平的检测,应在干旱的田间进行试验,检测植物乙耐旱性是否得到了提高。(4)将耐旱基因看作A,不耐旱基因看作a,AaAa耐旱与不耐旱数量比为31,则耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。突破二基因工程的应用与蛋白质工程突破二基因工程的应用与蛋白质工程一、基因工程的应用1.植物基因工程外源基因
18、类型及举例成果举例抗虫转基因植物抗虫基因:Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米抗病转基因植物(1)抗病毒基因:病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因;(2)抗真菌基因:几丁质酶基因、抗毒素合成基因抗病毒烟草、抗病毒小麦抗逆转基因植物抗逆基因:调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米改良品质的转基因植物优良性状基因:必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与植物花青素代谢有关的基因高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛2.动物基因工程外源基因类型及举例成果举例提高生长速度的转
19、基因动物外源生长激素基因转基因鲤鱼改善畜产品品质的转基因动物肠乳糖酶基因乳汁中含乳糖较少的转基因牛生产药物的转基因动物药用蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子转基因动物具有乳腺生物反应器作器官移植供体的转基因动物导入外源的抑制抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因无免疫排斥反应的转基因猪3.基因治疗与基因诊断基因治疗基因诊断原理基因重组及基因表达DNA分子杂交方法将正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥功能,以达到治疗疾病的目的制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况,判断患者是否出现了基因异常或携带病原体进展临床实验临床应用体型巨大的个体。(4)并非所有个体都可作为乳
20、腺生物反应器,制备乳腺生物反应器通常是针对雌性个体进行的操作。易混易错易混易错(1)用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”,如含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株。而青霉素是诱变后的高产青霉菌产生的,不是通过基因工程改造的工程菌产生的。(2)用基因工程生产的药品,从化学成分上分析都应该是蛋白质类。(3)动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质,不是为了产生二、蛋白质工程与基因工程项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测脱氧核苷酸序列合成DNA表达出蛋白质获取目的基因构建基因表达载体导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生
21、产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果生产自然界没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程,因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质,必须通过基因修饰或基因合成实现考向一依托实例分析考向一依托实例分析,考查基因工程的应用考查基因工程的应用1.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技
22、术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是(填写字母,单选)。A.人血细胞启动子B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子D.农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是。(4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比,选择途径获取rHSA的优势是。(5)为证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与的生物学功能一致。答案答案(12分)(1)总RNA(或m
23、RNA)(2)B(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工(5)HSA解析解析(1)总cDNA是以mRNA为模板逆转录合成的,所以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA复制,DNA复制时,两条子链的延伸方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达,需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞,使农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物,无内质
24、网和高尔基体,不能对多肽进行高效加工,而水稻是真核生物,具有内质网和高尔基体,可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与HSA的生物学功能一致。考向二借助实例考向二借助实例,考查蛋白质工程考查蛋白质工程2.(2015课标,40,15分)已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的进行改造。(2)以P基因序列为基础,获得
25、P1基因的途径有修饰基因或合成基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即:。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过和,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物进行鉴定。答案答案(1)氨基酸序列(或结构)(1分,其他合理答案也给分)(2)PP1(每空2分,共4分)DNA和RNA(或遗传物质)(2分)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3分)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列(每空2分,共4分)功能(1分)解析解析(1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括DNA的复制、RNA的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生物功能进行鉴定。