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1、沙棘林地土壤细菌群落结构及组成分析n素是高植物体生长发育过程中最需要的含矿量养分。然而,在全球范围内，处于温带地区 的森林土壤中N素的有效性是极其低的,N素常常成为限制林木生长和发育主要营养因子土壤微生物是森林生态系统的重要组成部分,参与着土壤动植物残体的腐烂和腐殖质的形 成、腐殖质(有机质)的分解、土壤养分转化和养分循环、植物对土壤养分的吸收等过程， 进而影响着林木的生长发育、森林群落的生产力以及森林生态系统的稳定性。特别是其中 的一些真菌(如菌根菌)沙棘(本试验利用高通量测序技术对陕西省中部和北部4个中国沙棘(1材料和方法1.1 采样地的选取2017年8月中旬，分别在陕西省咸阳市永寿县马坊
2、镇马坊林场(108.142。E, 34. 820 N)和 榆林市榆阳区转龙湾村(109.651 E, 38.457 N)沙棘林地选取林龄相近、且郁闭的3块纯 林样地，面积约15 mX20 mo2个采样地的具体信息见表1。在每块样地随机选取3株健康、 高度和胸径均接近样地沙棘林木平均水平的树木。在每个树木的4个不同方位、距离树干 2050 cm范围，去除地表面的枯枝落叶和腐殖质层厚,采集土壤表层(520 cm)的土壤样 品混匀。1.2 土壤中主要养分的测定将40 g自然风干的土壤样品过100目筛子，使用重铭酸钾外加热法测定土壤有机质含量， 浓H1.3 U3000试验步骤提取土壤总 DNA 使用的
3、试剂盒为 FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA), 具体试验步骤参照说明书进行。DNA的纯度和浓度用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)检测,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。1.4 物种分类单元用带有 barcode 的细菌通用引物：515F/907R(5 -GTGCCAGCMGCCGCGG-37 /5 -CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3z)对提取到的土壤总 DNA 的 16S rDNA V4-V5 区进行 PCR 扩增 对MiSeq测序得到的双端序列
4、数据进行过滤处理，以得到优化的序列数据。然后，按照97% 的相似性对非重复序列（不含单序列、并去除嵌合体）进行操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）聚类，得到OTU的代表序列；使用软件平台Usearch7.0（. com/uparse/）将所有优化序列按照97%的相似性归类到OTU代表序列, 生成OTU表格。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法 对97%相似水平的OTU代表序列进行物种分类分析,通过比对数据库（Releasel28 http :www. arb - si Iva. de）,分别在门（phylum
5、）、纲（class）、目（order）、科（family）、 属（genus）等分类水平上统计各样本的群落组成。在此基础上,利用mothur（http:www. mothur. org/wiki/Schloss SOPttAlpha diversity）进行 a 多样性指数分 析,R语言工具对各样本的群落组成等进行多元分析。1.5主要环境因子与几代堡菌属相对丰富的相关分析2个林地各个参数之间的显著性差异采用SPSS 2L0统计分析软件（Ducan）进行分析（2结果与分析2. 12理化指标和各物质量从沙棘根系分布主要区域内土壤pH值和主要营养成分含量来看,2个林地土壤均表现为弱 碱性,pH值之间
6、差异不显著，但马坊林地的有机质、全N和碱解N、速效P和速效K的含量 均显著高于转龙湾林地,而全P和全K含量则明显低于转龙湾林地（表2）。2.2在细菌群落的特征分析中2. 2. 1细菌群落的多样性从群落丰富度指数来看，马坊林地土壤细菌群落的Ace指数和Chaol指数值均低于转龙湾 林地（表3）;从衡量群落多样性指标的Shannon指数和Simpson指数来看,马坊林地的 Shannon指数值略低于转龙湾林地、但差异并不显著,而Simpson指数值则显著高于转龙湾 林地,因而马坊林地的细菌群落多样性也低于转龙湾林地（Shannon指数值越大,群落多样性 越高;Simpson指数值越小,群落多样性越
7、高）。本试验中，样本测序深度值均在98%以上,表 明测序覆盖率比较高,测序深度良好,测序结果合理可靠。2. 2.2门和纲水平的相似性依据测序数据和分析结果，马坊林地共获得89 467条测序序列，可归类为2 658条OTU代 表序列，分属于26个门66个纲144个目275个科474个属；而转龙湾林地共获得85 279 条序列，可归类为2 887条OTU代表序列，30个门75个纲164个目322个科584个属,且二 者在门和纲水平的相似度高达83%和78%O在目水平上,不同沙棘林地土壤细菌群落中，相 对丰度较高的细菌目的组成具有较高的相似性,但同一细菌目在不同林地土壤的相对丰度存在明显差异（图1）
8、 0马坊林地中，酸杆菌门未命名目（norank_Acidobacteria）和根瘤菌目 （Rhizobiales）细菌占优势地位（相对丰度分别为14. 79%和8. 73%）,转龙湾林地中占优势地 位的菌目为norank_Acidobacteria和根瘤菌目细菌（相对丰度分别为13. 78%和7. 88%）。 弗兰克氏菌目（Frankiales）在马坊和转龙湾2个林地土壤细菌群落中的相对丰度均较低， 分别为0. 44%和0. 76%O对图1中细菌目在科水平上的组成进一步分析表明，不同沙棘林地在科水平上（在所属目中 相对丰度1%）的组成几乎是完全一致的，只是在优势科以及各科的相对丰度上存在差异（
9、表 4）o2. 2.3阿利克氏菌目细菌的科分布隶属于放线菌门放线菌纲的弗兰克氏菌是一种革兰氏阳性细菌。本试验从分类信息中共筛 选得到弗兰克氏菌目下的20条OTUs代表序列,其中，转龙湾的19条OTUs完全与马坊林地 所共有,马坊地区有1条特有的OTU序列（图2A）o从2个林地的OTU代表序列相对丰度热图（图2B）来看,归属于地嗜皮菌科 （Geodermatophi laceae）芽生球菌属（对弗兰克氏菌目细菌在科水平的分析表明,2个林地均存在弗兰克氏菌目下的7个科，即地 嗜皮菌科（Geodermatophilaceae） 弗兰克氏菌目未命名科（norank_Frankiales） 鱼抱菌 科（
10、Sporichthyaceae）、中村氏菌科（Nakamurellaceae）、隐胞囊菌科 （Cryptosporangiaceae） 弗兰克氏菌科（Frankiaceae）和弗兰克氏菌目未分类科 （unclassif ied Frankiales）;而且地嗜皮菌科均占绝对主导地位，但各菌科在不同地区弗 兰克氏菌目细菌群落中的相对丰度存在显著差异（图3）。弗兰克氏菌科在该菌目中的相对 丰度均较低,马坊林地为6. 07%,而转龙湾林地仅为1. 5%o进一步分析结果表明，这7个科中共含有12个属的细菌,且2个林地的绝对优势菌属均为 地嗜皮菌科芽生球菌属（根据表1中年平均降雨量和表2中土壤营养因子的
11、数据（有机质、全N、碱解N、速效P和 速效K）与弗兰克氏菌科2个菌属相对丰度所进行的相关性分析（表5）表明，沙棘林地表层 土壤中弗兰克氏菌属（3细菌群落的组成尽管人们对于土壤微生物在土壤养分循环和生态系统中重要作用的认识越来越清晰，但由 于其组成种类非常庞大,且在当前条件下绝大部分土壤微生物种类的可培养率较低,对其群 落特征的认识必须要借助新的技术手段才能实现，而免培养的高通量测序技术提供了一个 很好的技术途径本研究结果表明，无论是生长于降雨量较为充沛、土壤有机质和矿质营养较为丰富的永寿 县马坊林场,还是生长于降雨较为稀少、土壤养分较为贫瘠的榆林转龙湾,沙棘林地表层土 壤中细菌群落在种类组成上
12、均是极其丰富和多样的,涵盖了细菌的31个门，79个纲，170个 目，329个科,603个属,这种调查结果与前期他人采用不同方法得到的研究结果也是相近的综上所述,无论是马坊还是转龙湾沙棘林地,表层土壤中细菌群落在种类组成上均是极其丰 富和多样的，且表现出较高的相似性;2个林地表层土壤中弗兰克氏菌目细菌在科水平，以及 其中弗兰克氏菌科细菌在属水平的组成上是完全一致的，但能与沙棘共生结瘤的弗兰克氏 菌科弗兰克氏菌属细菌的相对丰度均很低;在降雨较为充沛、土壤有机质和矿质养分较为 丰富的马坊林地土壤中，弗兰克氏菌属细菌的相对丰度显著高于降雨较为稀少、土壤养分 较为贫瘠的转龙湾林地。因而，良好的土壤营养（包括有机质和矿质营养）和水分条件，有利 于沙棘林地表层土壤中弗兰克氏菌属细菌的相对丰度的提高。