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1、摘 要在生产完毕的茶树菇废料中仍含有大量的有机物质和各种营养成分，为探索滑菇菌种在液体培养基的不同茶树菇废料比例条件下对滑菇产生漆酶活性的影响，利用ABTS（2，2-联氮-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）的方法探讨茶树菇培养基废料比例对滑菇漆酶活性的影响。通过替代液体培养基的碳源和氮源分别设定为占总值的0%、20%、40%、60%、80%、100%。通过单因素实验方法，主要是测定在相同培养基配方的不同废料比例的条件下滑菇菌丝每日的漆酶活性。通过单一变量实验研查废料比例对滑菇漆酶活性的影响，可为以后废料利用研究提供参考。关键词：滑菇；培养基；微碱化；ABTS法；漆酶AbstractThe wast
2、e of edible mushroom production still contains a variety of nutrients and a large number of organic substances. In order to explore the influence of shiitake mushroom on the laccase activity of shiitake mushroom in different proportion of waste of chashugu mushroom in liquid culture medium, the infl
3、uence of the proportion of waste of chashugu mushroom culture medium on the laccase activity of shiitake mushroom was studied by using ABTS (2,2-diazo-3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid). The carbon source were set as 0%, 20%, 40%, 60%, 80% and 100% of the total value respectively. By single fact
4、or experiment, the laccase activity of shiitake mycelium was determined under the condition of different waste ratio of the same medium. The effect of waste proportion on laccase activity of shiitake mushroom was studied by single variable experiment, which can provide reference for the future study
5、 of waste utilization.Keywords: Shiitake; culture medium; micro alkalization; ABTS method; laccase目 录1.引言.11.2滑菇漆酶测定.11.3漆酶.12. 材料与方法.32.2.1原料.32.1.2仪器设备.32.1.3药品.32.2方法.42.2.1菌种活化以及扩种.42.2.2培养基的配置.42.2.3灭菌.52.2.4接种及培养.52.2.5粗酶液的提取.62.2.6酶活力的测定.63.实验结果与分析.73.1液体培养基茶树菇废料对漆酶活性的影响.74.结论与讨论.11参考文献.12致谢.
6、143茶树菇废料对滑菇漆霉活性变化规律的影响1 引 言1.1 滑菇漆酶测定滑菇作为一种白腐真菌十几年前就被证明可以产生漆酶。而漆酶（Laccase,苯二醇氧化还原酶），因为对多种有毒性物质的分解降解均有作用，所以漆酶能够降解木质素，这使漆酶在废水处理和生物漂白等方面发挥着重要的作用4。漆酶在工业上可用于除去废水毒性，最近几年来，在制造除草剂、饮料饮品加工、环境保护、造纸等各个方面也都得到了广泛的研究和应用。漆酶是一种含有铜离子的活性蛋白质，通过3种铜离子的协同传递电子以及变化价态的过程来实现对酚及其衍生物、羧酸及其衍生物、芳胺等物质的催化氧化作用，且漆酶的活性中心含有4个3种不同的铜离子，因此
7、起到对毒物的降解和对环境的保护。而香菇已经被证实可产生活性很强的漆酶，因为其具有价格低、易于栽、培产量大等特点。1.2漆酶：漆酶是一种含 Cu2+的多酚氧化酶1，能催化酚类等 6 大类约 250 多种不同类型底物的氧化反应2，是一类性质相近而又不完全相同的多酚氧化酶的总称，不同来源的漆酶其氧化能力和反应性能有较大的差异3。由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，所以其在木质素降解4、染料脱色5、绿色有机物质的合成6、纸浆漂白7、含酚废水检测及处8、生物燃料电池的阴极反应9、食品饮料中酚类物质的去除10。研究还发现很多食用菌菌体中富含漆酶，它有利于呼吸过程中电子传递的正常运行，呼吸过程正常运
8、转，为菌体的生命活动提供充足的可利用的能量，从而加速菌体的生长发育11。此外，在菌丝体生长发育过程中，漆酶在分解木质素的同时还会产生酚类或醌类化合物，而酚类或醌类物质是有毒物质，是 1 种很好的杀虫剂，能够抑制杂菌的生长，从而防止杂菌进一步污染，并影响菇类菌体的生长发育12。由此可见，漆酶参与真菌体内的许多生物化学反应，具有重要的生理功能13，影响着真菌的发育及形态的发生14。如何缩短食用菌生产周期及提高抗杂菌能力、降低成本，是为了针对目前有些珍贵食用菌生产周期长、生产成本高的实际情况，成为目前食用菌育种亟待解决的关键问题之一，这也体现了食用菌在不同条件下菌丝产漆酶规律的相关性研究甚少。等方面
9、具有广泛的应用潜力。漆酶可存活于空气中，不过漆酶普遍的存在菇、菌及植物中，本质上是一种环保型酵素，其反应后唯一的产物就是H2O。作为高效的生物检测器，漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用，可以成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有漆酶的测定方法较多，其中本次的实验采用的是分光光度法，因为它的实验条件要求低、并且还易于操作和灵敏度高等，其他方法还有比如高压液相色谱法、氧吸收法、极谱法及脉冲激光光声光谱法等。测定活性利用的可用底物还有邻苯二酚、2，6-甲氧基酚等，这次选择的底物是ABTS（2，2-联氮-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）。本实验通过探究香菇培养基微碱化对漆酶活性的影响，从而得出
10、不同的PH值对产生的漆酶活的性不同，同时对于香菇产漆酶的量以及活性强度提供一些的理论依据。2 材料与方法2.1.1 原料玉米粉、酵母膏、蔗糖均购于市场。磷酸二氢钾、七水硫酸镁、维生素B1由宁德师范学院生物实验中心食用菌研究室提供。茶树菇废料由古田食用菌基地提供滑菇菌种引进单位为三明真菌研究所接种日期为2018年12月，由宁德师范学院生物实验中心食用菌研究室保藏。2.1.2 仪器设备水浴锅、MC电子天平（YP802N）、超声细胞粉碎机、电磁炉、高压灭菌锅、生化培养箱（SPX-250B-Z型）、鼓风干燥箱（DHG-9070A）、超净工作台（SW-CJ-2D型）、摇床、离心机（TGL-15B）、紫外
11、可见分光度计（T6新世纪）、酒精灯、培养皿、打孔器、接种钩、烧杯、玻璃棒、25*200试管、30ml离心管、锥形瓶等。2.1.3药品琼脂粉；葡萄糖粉(购于福州贝尔曼公司)；氢氧化钠；磷酸二氢钾(购于福州贝尔曼公司)；七水硫酸镁；ABTS;98%乙醇；蛋白胨(购于福州贝尔曼公司)；酵母膏(购于福州贝尔曼公司)；维生素B1(购于福州贝尔曼公司);醋酸-醋酸钠缓冲液(宁德师范学院生物实验中心食用菌研究室提供）；试剂及其配置表 2-1-3 试剂配置方法表试剂名称试剂浓度配置方法准确称取 0.137g，ABTS 缓冲液0.25mol/L用.醋酸醋酸钠缓冲溶液定容到准确称取 3.86 克冰醋酸和醋酸醋酸钠
12、缓冲溶液0.1mol/L2.93 克醋酸钠加入到接近 1升的蒸馏水水中,充分搅拌,定容至 1 升2.2 方法2.2.1 菌种的活化以及扩种制备1000ml的PDA培养基，用高压灭菌锅（121摄氏度 20min）将灭菌工具放在干燥箱（60摄氏度 3小时）中烘干后放入超净工作台和并将灭菌后的PDA培养基进行倒皿冷却备用；将保存于4冰箱中的滑菇食用菌的试管母种进行活化，菌种取出放入25恒温培养箱中或者放在室内常温活化2448h,活化结束后将菌种转接到PDA试管培养基上。25恒温培养10-12天，待菌丝将要长满培养皿后，取后将剩余部分放入4的冰箱中保存备用，同时将未置于冰箱的PDA试管培养基利用打孔器
13、和镊子转接到固化培养基上，放入25恒温培养箱中培养1015天（具体天数依据菌丝长满培养基表面为准），放入冰箱备用。2.2.2培养基的配制本次实验设计一个培养基配方15：标准液体培养基（玉米粉30g、蔗糖20g、酵母膏3g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B1 0.05g、废料0g）培养基的制作：液体培养基的制作：称量（1）废料0g、酵母膏3g、维生素B1 0.05g、七水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、蔗糖20g、玉米粉30g；（2）废料10g、酵母膏3g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B1 0.05g、蔗糖16g、玉米粉24g；（3）废料20g、酵母膏3g、磷酸二氢钾1
14、g、七水硫酸镁0.5g、维生素B1 0.05g、蔗糖12g、玉米粉18g；（4）废料30g、酵母膏3g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B1 0.05g、蔗糖8g、玉米粉12g；（5）废料40g、酵母膏3g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B1 0.05g、蔗糖4g、玉米粉6g；（6）废料50g、酵母膏3g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.5g、维生素B1 0.05g、蔗糖0g、玉米粉0g；用1000ml烧杯，先加入500ml的自来水，再加入将上述称取的相应药品，搅拌均匀后倒入1000ml的量筒定容；取干燥洁净的500ml锥形瓶分装发酵液，在瓶口包上封口膜与报纸和包好的打孔器
15、（5mm）、镊子等接种器具进行高压灭菌，在121下灭菌20min后，将接种器具放入60的烘干箱烘3h。接种，待发酵液冷却后，与接种器具一起放入超净工作台进行紫外灯灭菌30min,接入上述平板菌种，每瓶接入5个5mm的菌球；培养，在28150r/min的摇床里摇床培养16d后备用；2.2.3 灭菌液体培养基的灭菌准备好500ml的锥形瓶，将上述的液体培养基分别装入，并贴好标签，和包好的打孔器、镊子和离心管等接一起放入高压灭菌锅内进行121高压灭菌，灭菌20min左右。取出，接种器和离心管放入烘干机60烘干。2.2.4 接种及培养液体培养基的接种将已经调节好pH的液体培养基分别倒入250ml的锥形
16、瓶中，然后和接种仪器置于超净工作台，紫外灯照消毒30min,然后用滑菇菌种对不同废料比例的培养基进行接种，用内直径为4mm的无菌打孔器，接种量为5个，将接完种的锥形瓶移入摇床中进行摇床培养，在28150r/min的摇床里摇床培养，2-16d左右进行酶活性检测。2.2.5 粗酶液的提取液体培养基粗酶液的提取：用四层纱布包扎，对粗酶液经过过滤处理后，使用规格为4000r/min 离心机进行离心10 min后取其上清液，即为粗酶液。可用 冷藏箱保存备用。2.2.6 酶活力的测定液体培养基的酶活力测定（1）ABTS溶液配制：用0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液将0.137g的ABTS定容至1L，配制
17、成浓度为0.25mol/L ABTS缓冲液。（2）将摇床培养2-16d左右的培养液利用过滤网过滤后得到滤液，再取滤液30ml于离心管中；（3）将离心管进行4000r/min离心,离心后放于4的冰箱中备用ABTS测定酶活：采用ABTS法，分别移取1ml粗酶液置于两只试管中，设立对照组，将作为对照的其中一只试管煮沸5min，作向两只试管中分别加入2mlABTS（浓度为0.25mmol/L）缓冲液放于40水浴锅中进行水浴，水浴时间为3分钟，水浴结束后取出后在410nm波长处测吸光度。一个酶活力单位用每分钟吸光度增加0.1为一个酶活力单位。式中：V1为反应总体积/mL；V2为测定酶活力时所取的酶液体积
18、/mL；N为酶液稀释倍数；t为反应时间的变化量； 为3.6104/(mol/(L cm)；A为吸光度的增量。3 实验结果与分析3.1液体培养基茶树菇废料比例对漆酶活性的影响菌丝培养2d后到设计的取样点，培养216d，每隔2d取样检测表3-2-1Day2配方酶活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复30.050.010%13.35512.0212.0212.470.885abA20%16.02613.35512.0213.82.226aA40%12.024.0112.029.355.34abcAB60%10.68410.6842.678.015.34 bcAB80%6.6774.012.674
19、.452.227 cd BC100%01.3400.450.89 d C表3-2-2Day4配方酶活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%380.609364.583212.34319.1892.87abAB20%563.568455.395401.976473.6582.33aA40%156.25328.526312.5265.7695.18 bABC60%397.97130.876130.876219.91154.21 bc BCD80%45.40674.78696.15472.1225.48 cd CD100%030.71616.02615.5815
20、.36 d D表3-2-3Day6配方酶活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%1017.6281069.712993.591026.9838.91aA20%1100.4271065.7051136.4851100.8735.39aA40%777.244572.917682.425677.53102.25 b B60%572.9166667711.806638.355641.0369.48 b B80%297.81156.25344.551266.298.05 c C100%74.78638.729104.16772.5632.78 d D表3-2-4Da
21、y8配方酶活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%1901.7091772.1691718.751797.5494.08 bAB20%2049.9472139.4232106.0362098.4745.22aA40%1406.251477.031860.311581.2244.3 b BC60%1237.9811335.471235.311269.5957.07 c C80%1069.712830.662771.902890.76157.74 d D100%136.218348.558132.212205.66123.77 e E表3-2-5Day10配方
22、酶活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%2180.8232353.0982114.0492215.99123.34 b B20%2697.652649.5732800.4812715.977.09aA40%2048.6112202.191681.3571977.39267.62 bc BC60%1621.2611778.8461956.4641785.52167.7 c C80%1366.1861284.7221266.0261305.6453.26 d D100%311.165439.37244.391331.6499.09 e E表3-2-6Day1
23、2配方酶活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%1945.781760.151741.4531815.79112.96 b B20%2067.3082122.0622122.0622103.8131.61aA40%1427.6181514.4231469.0171470.3543.42 c C60%1291.341371.5281179.221280.796.59 d C80%1067.041977.564892.094978.987.48 e D100%391.293393.964169.605318.29128.77 f E表3-2-7Day14配方酶
24、活力酶活力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%1316.7741172.5431499.7331329.68163.98aA20%1378.2051485.0431339.4761400.9175.39aA40%1140.4911080.3951033.6541084.8553.56 b B60%1005.609897.436981.571961.5456.8 bc BC80%968.216797.276805.289856.9396.46 c C100%174.947172.276129.541158.9225.48 d D表3-2-8Day16配方酶活力酶活
25、力平均值差异显著性重复1重复2重复3单位（U/L）0.050.010%1018.964830.6621088.408979.34133.36abAB20%1111.1111021.6351278.0451136.93130.14aA40%862.714813.301759.882811.9751.43 bc BC60%962.874685.096836.004827.99139.06 bc BC80%789.263564.904699.786684.65112.94 c C100%134.882110.84482.799109.5126.07 d D从表3-2-1至表3-2-8可以看出，废料浓
26、度20%的漆酶活力均值最高，其中当菌丝生长到第10天时酶活力峰值达到最高2715.977.09 U/L 。滑菇液体培养基在废料浓度20%时漆酶活性最强，培育基的废料比例能够影响漆酶的活力值大小。实验表明：滑菇液体培养基废料比例的不同对滑菇菌丝漆酶活性有影响，在废料比例为20%时漆酶活力最大，所以废料比例20%时对菌丝漆酶活性的促进作用最强。图3.1.1液体培养基不同茶树菇废料浓度滑菇的漆酶活力值从图3.1.1中可以看出滑菇液体培养基在不同的废料比例中，滑菇漆酶活性随着废料比例的上升呈先上升后下降的钟罩型，在时间2-16天的测试中都在第10天的菌丝酶活性达到最强。对比废料比例不同的漆酶酶活性的大
27、小和变化，可以看出随着废料比例的上升，漆酶活力值先上升再下降，废料比例为20%时滑菇有较高的分泌漆酶的能力。图3.1.1液体培养基不同日期滑菇的漆酶活力值4 结论与讨论液体培养基从菌丝的生长速度方面而言菌丝球差异较大，且废料比例为20%时，液体培养基的滑菇菌丝球的生长速度最快。经ABTS法检测菌丝漆酶活性，废料比例为100%时菌丝的吸光值最小，即漆酶活性最弱；废料比例为20%时菌丝的吸光值最大，即漆酶活性最强。计算后发现 酶活力在0%、20%、40%、60%、80%、100% 时差异显著。因此，为提高漆酶活性，可使用20%的茶树菇废料进行培养。生产培养基从菌丝的生长速度方面而言菌丝生长差异较大
28、，且废料比例为20%时，生产培养基的滑菇菌丝球的生长速度均很快。经 ABTS 法检测菌丝漆酶活性，从表3-1-4可以看出加废料比例在80%时菌丝的吸光值最小，即漆酶活性最弱；废料比例在20%时菌丝的吸光值均较大，即漆酶活性相对较强。计算后发现 酶活力在0%、20%、40%、60%、80%、100% 时差异显著。因此，为提高漆酶活性，可使用20%的茶树菇废料进行培养。参考文献1凌庆枝, 董丽辉, 高丽丽, 等. 亮菌漆酶的初步研究J. 食品科学,2009, 30(19): 190-193.2Bourbonnais R, Paice M G, Freiermuth B, et al. Reacti
29、vities of various mediators and laccases with Kraft pulp and lignin model compoundsJ. Appl Environ, Microbiol, 1997,63:4627-4632 .3胡平平, 付时雨. 漆酶催化活性中心结构及其特性研究进展J. 林产化学与工业, 2001, 21(3): 69-754SREBOTNIK E, HAMMEL K F. Degradation of nonphenoliclignin by the lassace/1-hydroxy-benzotriazole systemJ. Jour
30、nal of Biotechnology, 2002, 81(2/3): 179-188.5高恩丽, 张数江, 夏黎明. 云芝菌发酵产漆酶及其对靛蓝脱色的研究J.高校化学工程学报, 2007, 21(1): 111-115.6KARASMYSHEV A V, SHLEEV S V, KOROLEVA O V, et al. Laccase catclyzed synthesis of conducting polyanilineJ. Enzyme Microb Technol, 2003, 33(5): 556-564.7CALL H P, MCKE I. History of overvie
31、w and applications of mediated lignolytic systems, especially hccase-mediator-systems (Ligonzym-process)J. J Biotechnol, 1997, 53(2/3): 163-202.8Gomes SASS，Nogueira JMF，ebelo MJF An amperometric biosensorfor polyphenolic compounds in red wine J Biosensors and Bioelectronics，2004，20 ( 6) : 121112169F
32、abio V，Antonio C，Santa ，et al A high sensitivity amperometric biosensor using a monomolecular layer of laccase as biorecognition element J Biosensors and Bioelectronics，2004，20 ( 2) : 31532110Katz E，Filanovsky B，Willner I A biofuel cell based on two immiscible solvents and glucose oxidase and microp
33、er oxidase monolayer functionlized electrodes J New J Chem，1999 ( 23) : 48148711Servili M，De Stefano G，Piacquadio P，et al A novel method for removing phenols from grape must J Am J Enol Viticulture，2000(51):357-36112Turner EM，Wright M，Ward T，et al Production of ethylene and other volatiles and chang
34、es in cellulase and laccase activities during the life cycle of the cultivated mushroom，Agaricus bisporus JGen Microbiol，1975， 91 (1) : 16717613 Bollag JM，Shuttleworth KL，Anderson DH Laccase mediated detoxification of phenolic compounds J Appl Environ Microbiol，1988，54 ( 12) : 3086309114Bourbonnais
35、，Paice MG Oxidation of nonphenolic substrates:Anexpanded role for laccase in lignin biodegradationJ.Febs Letters，1990，267 ( 1) : 9910215熊艳 车振明 吕磊 爪哇香菇液体种子培养基的优化 食品工业科技2008,(05):138-140致 谢大学四年的时光匆匆流逝，回想四年间的每一段回忆，心里满满的都是感激之情。无论是浓厚的师生之情、难为的同窗友谊都在我心中深深的刻下，在此我想向那些关心我的、照顾我的、疼爱我的每一位恩师、同学、家人和朋友表示崇高的尊敬和由衷的感谢。首先需要感谢学校，给了我宝贵的大学四年的学习时光；其次需要感谢学院，接纳和培养着我；而后想要感谢我的恩老张维瑞老师，在最开始愿意跨专业的收我，不厌其烦一次又一次的教我之前没有接触过实验里的东西，在论文指导也是从选题到思路到构造巨细无遗的讲解，更是在生活、工作、学习中给了我许多的鼓励和支持，他为人师表的职业品德让我感受到一位优秀教师的感染力和影响力。借此机会我要向张维瑞老师表达最崇高的尊敬和最由衷的感谢。这次大学时光的结束，不是我的终点，而是新的起点。学习也不是就走到了尽头，而是开始的终身学习的初启祝愿所有帮助、照顾、关心我的人一愿识尽天下好人二愿读尽世间好书三愿看尽世间美景- 14 -