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1、目录目 录摘要1Abstract21前言31.1研究背景31.2辣椒炭疽病菌研究进展41.2.1辣椒炭疽病的发病症状41.2.2辣椒炭疽病菌的生长条件需求41.2.3辣椒炭疽病菌的致病机理41.2.4对辣椒炭疽病防治措施41.3研究目的及意义51.4研究内容与思路61.4.1研究内容61.4.2技术路线62 材料与方法72.1云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发的影响72.1.1试验材料72.1.2仪器设备72.1.3试验方法72.2云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌菌丝生长的影响82.2.1试验材料82.2.2仪器设备82.2.3试验方法93 试验结果分析103.1云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌孢子
2、萌发的影响103.2云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌菌丝生长的影响11讨论15结论17参考文献18致谢20 第23页（共25页）参考文献摘要辣椒作为我国种植历史悠久的植物，具有良好的食用价值与医疗价值，市场需求巨大。但近年来由于我国种植地区栽培条件限制,以及复杂气候环境条件的影响，导致辣椒因连作遭受病害程度不断加剧，其中辣椒炭疽病便是一种严重制约辣椒生产，降低辣椒品质的真菌性病害，其病原菌是辣椒炭疽病菌。本文根据在工业大麻轮作后，辣椒病害明显下降的生产实践下，首次以云南省主产工业大麻品种“云麻1号”为试验材料，提取大麻根、茎、叶浸提液，研究大麻不同器官对辣椒炭疽病菌孢子萌发、菌丝生长的影响。试验结
3、果发现，云麻1号根、茎、叶（浸提液）对孢子萌发抑制效果的强弱排序是根茎叶，其中根浸提液对炭疽病菌孢子萌发的平均抑制率为叶浸提液的1.5倍，5%浓度的根浸提液对辣椒炭疽病菌的孢子萌发抑制率达到了35% 以上。 对于辣椒炭疽病菌菌落直径而言，5%的根、茎、叶浸提液处理下皆能显著抑制菌丝直径，其中叶浸提液对辣椒炭疽病菌菌落直径抑制效果最好，其次为根。综合可知采用5%的大麻提取液对辣椒炭疽病抑制效果最好，抑制效果表现为：根叶茎。本研究为辣椒生产和工业大麻的产业开发利用增添了新的思路和理论支持。关键词：工业大麻、浸提液、辣椒炭疽病菌、孢子、菌丝 ABSTRACTAs a plant with a lon
4、g history in China, pepper has good edible value and medical value, and the market demand is huge. However, in recent years, due to the limitation of cultivation conditions in Chinese growing areas and the influence of complex climate and environmental conditions, pepper has suffered from continuous
5、 disease caused by continuous cropping. Among them, pepper anthracnose is one of the main fungal diseases in pepper production, which seriously restricts peppers. Production, its pathogen is pepper anthracnose.In this paper, based on the production practice of chilli diseases significantly reduced a
6、fter cannabis rotation, the main industrial hemp variety Yunma No. 1 in Yunnan Province was used as the test material for the first time to extract cannabis root, stem and leaf extracts to study different organs of cannabis. Effects on spore germination and mycelial growth of pepper anthracnose. The
7、 test results show that the order of the inhibitory effect of the root, stem and leaf (leaf extract) of Yunma 1 on the spore germination is root stem leaf, and the average inhibition rate of root extract on the germination of anthracnose spores. The leaf extract is 1.5 times, and the 5% concentratio
8、n of root extract can inhibit the spore germination rate of anthracnose of pepper to reach more than 35%. As for the colony diameter of pepper anthracnose, 5% root, stem, and leaf treatments can significantly inhibit the diameter of mycelium. Among them, the leaf extract has the best effect on inhib
9、iting the colony diameter of pepper anthracnose, followed by roots. It can be concluded that the use of 5% cannabis extract has the best inhibitory effect on pepper anthracnose, and the inhibitory effect is as follows: root leaf stem. This research provides new ideas and theoretical support for pepp
10、er production and industrial cannabis industrial development.Key words：industrial hemp, Extract, Capsicum anthrax, spores, hyphae 1前言1.1研究背景辣椒(Capsicum annuum L.)是茄科辣椒属，是一种一年生或多年生草本植物，全国各地均有种植。辣椒在我国种植历史悠久，已成为人类日常生活中一种重要的蔬菜和调味品，在我国拥有很大种植面积。由于耕地数量有限1，土地、气候等条件的限制2，导致辣椒的种植，必不可免的连年种植在同一区域，连作难以避免。辣椒随着连作年限
11、增长，即会产生连作障碍，导致辣椒产量降低、品质变差，而辣椒属于连作障碍比较严重的作物，引起辣椒连作障碍的原因很多，其中土传病害就是重要原因之一。辣椒炭疽病便是一种辣椒栽种阶段常见的土传病害，在连作辣椒生长后期，会造成辣椒大量落叶烂果，甚至死亡，产量损失可达20%30%，使种植辣椒的农户经济效益降低，生产积极性大为减退，已成为辣椒生产中的主要障碍和限制高产的重要因素3。目前，研究人员不断地从不同方面寻找辣椒炭疽病的防治方法。经过长时间的生产实践，公认有效的应付措施以化学防治为主，一些常用的化学杀菌剂如福美双、三唑类的氟硅唑，对防治辣椒炭疽病害有一定效果。但是仅仅利用化学方法防治很长一段时间后，会
12、使病菌产生对药的抗逆能力，药剂渐渐失去防治效果，还会污染环境。因此仍需探索更具有高效防治辣椒炭疽病害、无污染、保证农业生产可持续发展的防治方法。大麻（Cannabis sativa L.）是大麻科大麻属的一种一年生草本植物，也是我国主要的经济作物之一，工业大麻则是指大麻中四氢大麻酚(THC)含量0.3%的一种类型。Gorchs et al. 研究结果表明，大麻(Cannabis sativa L.)与小麦(Triticum aestivum L.)的轮作效应分别使小麦在第一年和第二年的产量与小麦单作相比显著提高4。Zhang et al. 在大豆多年连作的土地上，进行了工业大麻等作物的轮作，发
13、现工业大麻轮作后的大豆胞囊线虫(J2)二代幼虫数比连续种植大豆减少了29.8，农田上的病害有了明显的降低，根腐病、镰刀菌、立枯丝核菌等病害显著低于连作大豆5。也有科学家研究发现工业大麻根、茎、叶的化感作用可以促进甜瓜和向日葵的种子萌发6。本实验室从生产中发现，十字花科或茄科蔬菜的连作地种植工业大麻后，再种植蔬菜的发病率明显降低，但其生物学原因有待研究。这促使我们产生了研究工业大麻是如何降低辣椒病害的想法，鉴于前人曾研究过中草药提取物、作物秸秆热解液、生物质热解液，还有其它一些植物提取液对辣椒炭疽病菌的影响，并取得了不错的研究结果，因此本试验决定用云麻1号浸提液作为试验材料，测定云麻1号根、茎、
14、叶浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发、菌丝生长的影响，旨在探讨大麻轮作减轻辣椒病害发生的生物学原因，为解决辣椒等蔬菜连作障碍问题提供一定的理论依据。1.2辣椒炭疽病菌研究进展1.2.1辣椒炭疽病的发病症状辣椒炭疽病主要在辣椒生育期的中后期发生，在高温高湿的条件下，该病害的流行速度较快，作用时间较长，对红色成熟果实危害严重。果实发病，病斑呈圆形或近圆形，有水溃状黄褐色病斑，发病部位向下凹陷，部分病斑上出现红色或搔红色小点，当环境湿度过高时，病斑表面会溢出粘稠红色物，环境干燥时，病斑部位干燥收缩变薄，大多会开裂。叶片发病，病叶上呈现水侵状黄褐色圆斑，其上多生小黑点，继而发展到中央灰褐色，危害过重甚至落叶
15、。有时茎杆和果梗发病，形成褐色病斑，环境干燥时容易裂开，严重时还有可能断裂7。1.2.2辣椒炭疽病菌的生长条件需求辣椒炭疽病菌菌丝生长的最优C源是麦芽糖和葡萄糖，最优源是蛋白胨和牛肉膏，能促进其产孢的C源是山梨糖和淀粉，促进其产孢的源是酵母。适合辣椒炭疽病菌生长的培养基有辣椒果煎汁培养基、PDA培养基等。温度是影响该病菌孢子萌发的重要因素，辣椒炭疽病菌在53下暴露10min，孢子将会死亡。该病菌菌丝的生长温度在1238，最适生长的环境为中性环境，光暗交替可促进辣椒炭疽病菌菌丝的生长；产孢温度在1532，在光暗交替下可促进产孢。在25时，最适合菌丝生长，在30时，最适合产孢88。1.2.3辣椒炭
16、疽病菌的致病机理辣椒炭疽病菌大多以菌丝为寄主，隐藏于种子内部或者依靠分生孢子依附在种子表面上，或者利用多年生的病叶枝上的菌丝体或者分生孢子盘在病株上过冬，成为下一次植株染病的初侵染源。次年环境条件合适时，病菌将产生很多的分生孢子，传染到健康的植株上，寄主的伤口、皮孔、气孔是该病入侵的关键点。其病斑上的病菌可以通过雨水、露水传播，发病温度在25-28，相对湿度90以上，排水受阻、地势低凹潮湿、通风效果不好、施肥过多或过少等因素都可能造成辣椒炭疽病的发生和流行91011。1.2.4对辣椒炭疽病防治措施做好辣椒炭疽病的防控工作是实现辣椒增产的重要一环，近年来，国内外先后有部分研究学者开展了辣椒炭疽病
17、菌的抑菌研究。满益龙、谭新球等探索发现了4种不同辣椒炭疽病菌对唑菌酯的敏感性存在差别，在生产中要根据病原菌的不同而合理用药12；姚道忠，李运超等测定啶氧菌酯对辣椒炭疽病孢子产生、孢子萌发和菌丝生长的抑制能力，探究啶氧菌酯对辣椒炭疽病菌的抑制能力，结果显示，25%浓度的啶氧菌酯可明显抑制辣椒炭疽病菌孢子产生、孢子萌发和菌丝生长，具有最强的抑制能力，为生产中合理用药提供了参考依据13；任艳玲，王涛研究了多种杀菌剂对辣椒炭疽病菌的抑制能力，以筛选出对控制辣椒炭疽病最为理想的药剂，结果显示，这几种杀菌剂对辣椒炭疽病菌都有相应的抑制能力，但抑制的能力不同，研究结果成为防控辣椒炭疽病的重要理论依据14；陈
18、娟芳，任佐华等研究了甲基硫菌灵与吡唑醚菌酯按不同质量比进行混合的混合物对2种辣椒炭疽病菌的抑制能力。结果显示，混合物质量比不同，表现出的作用效果也不同，且存在最适宜的质量比，其作用效果最好15。国外也有许多学者进行辣椒炭疽病菌的研究，Naziya Banu利用从辣椒根际土壤分离出植物生长促进真菌，进一步试验探究其对炭疽病的抗性。结果表明植物生长促进菌在辣椒中诱导疾病保护和增强植物生长具有巨大潜力，而辣椒可以作为有害化学物质的可能替代品16；Jiumoni 和Debahuti 等以试验评估了铜绿假单胞菌JS29菌株产生的生物表面活性剂对炭疽病的控制的抗真菌效果。结果表明，利用生物表面活性剂对真菌
19、孢子进行抑制作用分析，能显著减少病害，生物表面活性剂可以有效地抑制病原菌孢子和菌丝体的生长。该研究证实，这种生物表面活性剂具有很大的潜力，可成为在田间和采后贮藏条件下管理炭疽病的可行、成本效益高、环境友好的替代品17。1.3研究目的及意义在农业生产中，辣椒病害一直不容忽视，辣椒炭疽病是一种在辣椒栽培阶段非常严重的病害，严重威胁辣椒生长和农业生产，影响果实外观和品质，甚至导致辣椒大面积死亡，在全世界范围内，分布广泛，造成辣椒品质与产量等损失巨大，是严重影响辣椒生产的因素之一。目前，公认有效的应付措施以化学防治为主，利用杀菌剂、化学农药杀死病菌，但长时间连续依靠化学物质杀菌容易使病菌变得耐药、抗药
20、，使杀菌剂失去防治效果，过量使用化学农药，还会造成土壤贫瘠、土壤盐碱化加重，同时，大量有毒农药残留也直接危害辣椒生长，并且引发一定的环境污染问题，由于生物富集作用，最终影响人类生命健康，故使用化学方法防治辣椒炭疽病害，在未来势必会受到了一定的制约。工业大麻，生物量大，生长速度快，一年可收获，具有很高的经济价值，应用于纺织、建筑材料、造纸、医疗保健、食品等各方面，其产品数量超过2500种18，特别是现今重要的药用价值成分CBD，具有非常高的医用价值，将工业大麻的大量生产推上新的高度20。根据已有生产实践和研究结果，工业大麻具有较强耐连作性，对病菌具有一定抑制能力。故本研究以生长至两对真叶的云麻1
21、号为研究对象，研究云麻1号幼苗根、茎、叶浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发、菌丝及菌落生长的影响；旨在确定大麻减少辣椒病害的能力，为减轻辣椒炭疽病害障碍提供一定的理论依据，为寻求经济、高效、低毒、无公害、无残留的新型杀菌剂，为有效控制辣椒炭疽病害提供一种新的思路。1.4研究内容与思路1.4.1研究内容对云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发抑制率、菌丝生长抑制率进行测定，确定工业大麻减少辣椒病害的能力。1.4.2技术路线附图：技术路线图2 材料与方法2.1云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发的影响2.1.1试验材料2.1.1.1供试菌种辣椒炭疽病菌，云南省农业科学院提供。2.1.1.2供试土壤泥炭基质
22、（挪威JIFFY公司生产的由高级爱沙尼亚泥炭藓制成）。2.1.1.3供试植物云麻1 号（Y1），云南省农业科学院提供。2.1.2仪器设备超净工作台、各种规格的移液枪及枪头、恒温水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、血球计数板、无菌滤纸、无菌培养皿、接种针、恒温培养箱、恒温摇床、酒精灯、电子显微镜、电热恒温鼓风干燥箱等。2.1.3试验方法2.1.3.1云麻1号浸提液制备云麻1号幼苗在自然采光的试验温室中进行培育，用育苗盘培育，每次培育两盘。每次培育大麻苗试验步骤相同，挑选籽粒饱满大小一致的云麻1号种子播种于有泥炭基质育苗盘中，每穴五粒，然后覆土，浇适量水置于温室中培养。每天定时定量浇水，大约五天左右大麻苗冲破
23、土层，继续浇水， 待幼苗长到四叶一心期，选取生长状况良好一致的200棵幼苗连同根系完整取出，并用清水将根系清洗干净，将整棵幼苗分为根、茎、叶三部分。用报纸包好放入烘箱中将温度设置为105 烘30min, 然后再将温度设置为80 烘干至恒重。烘干后，分别按照云麻1号根、茎、叶用高速粉碎机进行粉碎，装袋，贴上标签后备用。称取粉碎后的干粉按照料(根、茎、叶干重):水=1:20的比例混合 ，在160rpm、30 摇床上浸提24h，滤纸过滤即得水浸提母液，4 保存备用212223。2.1.3.2培养基配制PDA 培养基：将马铃薯清洗干净，然后去皮，切成大小相对均匀的细碎方块，注意去掉牙眼。称量 200
24、g 的马铃薯碎块，加 1L蒸馏水，煮沸约 15min，然后过滤，过滤后向滤液中加入琼脂粉15g，继续加热并用玻璃棒搅拌摇匀。琼脂完全溶于滤液后，再加入蔗糖 15g 搅拌均匀，然后加纯净水定容至 1 L，分装于容量瓶，121 高压蒸汽灭菌 15 min，备用。2.1.3.3辣椒炭疽病菌培养在无菌操作台上，使用接种针挑取少许分离纯化的辣椒炭疽菌菌丝块接种到PDA 培养基中央，用封口膜封好口，然后把接种好的培养皿放于28恒温培养箱中，关闭灯光，使其在黑暗条件下培养7-10 天。培养后，可观察到培养基中央向四周产生大量土白色孢子团，即得辣椒炭疽病菌。每次做 15个重复，以确保获得较多的辣椒炭疽病菌菌落
25、，满足实验需要。2.1.3.4孢子悬液的制备 将在PDA培养基上培养的辣椒炭疽病菌菌丝转移到装有100 ml无菌水的烧杯中，摇勾并用无菌的两层纱布过滤，把滤液置于血球计数板上，在电子显微镜下计数，通过计算，把滤液中孢子的浓度调整为1000个/ml，即为孢子母液。2.1.3.5孢子萌发法在PDA培养基灭菌冷却至55时，分别按照云麻1号根、茎、叶浸提液原液/PDA培养基的体积比为0%、1%、3%、5%的浓度，把云麻1号浸提液分别加入到PDA培养基中，摇匀，每个梯度重复3次。进行到平板，待培养基凝固后，吸取100 l孢子悬液，均匀涂布在加有云麻1号根、茎、叶浸提液的PDA培养基中，以100 l无菌水
26、作为对照，将平板置于28的恒温培养箱中黑暗培养2d后进行菌落计数24。孢子萌发抑制率计算公式如下：2.2云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌菌丝生长的影响2.2.1试验材料2.2.1.1供试菌种辣椒炭疽病菌，云南省农业科学院提供。2.2.1.2供试土壤泥炭基质（挪威JIFFY公司生产的由高级爱沙尼亚泥炭藓制成）。2.2.1.3供试植物云麻1 号（Y1），云南省农业科学院提供。2.2.2仪器设备电子显微镜、各种规格的移液枪及枪头、恒温水浴锅、恒温培养箱、无菌培养皿、超净工作台、无菌滤纸、接种针、恒温摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱等。2.2.3试验方法2.2.3.1培养基配制1% (W/
27、V)水琼脂培养基：称取琼脂10.0g，加入1L纯净水，然后加热煮沸至琼脂粉完全溶解，分装于容量瓶，封好口后置于高压蒸汽灭菌锅121灭菌15分钟，灭菌完成后为了防止琼脂在容量瓶底部沉积而结块，要摇匀，摇匀后放入超净工作台备用。2.2.3.2辣椒炭疽病菌培养同2.1辣椒炭疽病菌培养方法。2.2.3.3菌丝生长速率法采用生长速率法进行生物测定2526。将灭菌后的水琼脂培养基冷却至55 时分别加入过滤除菌后的云麻1号根、茎、叶浸提液，以加无菌水操作作为对照，根、茎、叶浸提液设置4个浓度梯度，分别是0%、1%、3%、5%，每个梯度重复三次。培养基摇匀后开始倒平板，使每个平板培养基的体积均为20 ml。
28、将平板在无菌操作台吹干冷却后接种辣椒炭疽病菌。接种后用封口膜封口，在28的恒温培养箱中暗培养4d后测定菌丝直径和菌落大小。菌丝直径在Motic BA310生物显微镜下观察，使用Motic Images Pius 3.0软件进行自动测量，菌落直径用刻度尺采用十字交叉法沿不同方向测3次，取其平均值作为试验数据。试验重复3次。基于云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌菌丝直径和菌落直径的抑制量，计算菌丝生长抑制率，计算抑菌率时，统一用cm作为菌落直径单位，用m作为菌丝直径单位。计算公式如下：菌丝生长抑制率%=(对照菌丝直径-处理菌丝直径对照菌丝直径+对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径)/2100%注：用水
29、琼脂培养基的原因是：要在培养基中加入根茎叶的浸提液，所以为了防止根茎叶残体浸提液中的微生物生长，影响炭疽病菌的生长，所以不能用营养培养基，只能用水琼脂培养基，这样既能使根茎叶中的抑菌物质发挥作用，又不会使其生长。3 试验结果分析3.1云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发的影响在所设置的浓度内，随着云麻1号根、茎、叶浸提液浓度的增加，辣椒炭疽病菌孢子萌发数呈下降趋势，处理浓度与炭疽病菌孢子萌发数呈负相关关系，且所有大麻根、茎、叶对孢子的萌发抑制效果相比对照都达到显著水平，其中3-5%效果最好，且孢子萌发数显著低于1%和0%（对照）(图1)。大麻的根、茎、叶各处理组与对照组差异显著，由此可见，大麻
30、对对辣椒炭疽病菌的孢子萌发有较强的抑制作用(图2)。云麻1号根、茎、叶（浸提液）对孢子萌发抑制能力的强弱排序是根茎叶，其中根浸提液对炭疽病菌孢子萌发的平均抑制率为叶浸提液的1.5倍(图2)。5%浓度的云麻1号浸提液对辣椒炭疽病菌孢子萌发的抑制能力显著高于1%和3%浓度的云麻1号浸提液。其中5%浓度的根浸提液对辣椒炭疽病菌的孢子萌发抑制率达到了35% 以上，抑制能力相对较好。图 1云麻1号根、茎、叶浸提液处理下辣椒炭疽病菌孢子萌发的数量(个)柱子上方的不同小写字母表示差异显著(P叶茎。参考文献1 Meyer W B, Iib L T. Human population growth and gl
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