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1、 中文题目: 引起犬细菌性皮肤病主要致病菌的生物学分析 英文题目: Biological analysis of the main pathogens causing canine bacterial skin diseases 目 录1 引言31.1 犬皮肤病现状31.2 犬细菌性皮肤病的研究进展31.2.1 病原31.2.2 致病机制51.2.3症状51.2.4 治疗61.3 DNA测序技术的研究进展61.3.1 DNA测序在细菌性皮肤病鉴别诊断中的应用71.4 研究目的及意义72 材料与方法72.1 实验对象72.2 实验材料82.3 实验方法92.4 数据统计及分析113 结果与分析1
2、13.1 定性分析113.2 定量分析124 讨论 145 结论 18参考文献19致谢23附录1：相关英文文献原文24附录2：英文文献中文译文35摘 要为了了解引起犬细菌性皮肤病的主要致病菌菌属及其生物学性质，从临床病例情况，细菌分离培养，革兰氏染色观察，血平板培养，细菌DNA检测等方面，对天津农学院附属动物医院5只患细菌性皮肤病犬只及其患处所分离出的可疑致病菌进行生物学分析。试验结果显示：5只研究对象均为长毛或毛发浓密犬种，60%处于2-4岁阶段，80%犬细菌性皮肤病病例为单纯感染细菌性皮肤病，20%为寄生虫与细菌混合感染，且患犬均为继发性感染。菌落形态均为淡黄色或白色、圆形、大小相似、光滑
3、突起、边缘齐整。革兰氏染色镜检单独菌落均是革兰氏阳性菌，其中有97.29%革兰氏阳性葡萄球菌，10.81%菌株检出含有革兰氏阳性杆菌，60%血平板上出现透明溶血环。结果说明犬细菌性皮肤病常发于2-4岁长毛犬，多为继发感染，革兰氏阳性葡萄球菌是引起犬细菌性皮肤病的最主要致病菌，多种细菌可同时感染致病。通过结合相关文献理论分析，推测引起犬细菌性皮肤病主要致病菌可能为伪中间型葡萄球菌、中间型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、产色葡萄球菌、短小芽孢杆菌，试验为确定犬细菌性皮肤病的主要致病菌以及临床及时有效对因治疗犬细菌性皮肤病提供参考。关键词: 犬类；细菌性皮肤病；DNA技术 ABSTRACT
4、In order to understand the main pathogenic bacteria that cause bacterial skin diseases in dogs and their biological properties, the biological analysis of the suspected pathogens isolated from 5 dogs and their affected areas in the affiliated Animal Hospital of Tianjin Agricultural College was carri
5、ed out from the aspects of clinical cases, bacterial isolation and culture, Gram staining observation, blood plate culture, bacterial DNA detection, etc. The experimental showed that the 5 research subjects were all long-haired or thick-haired dog breeds, 60% of them were in the stage of 2-4 years o
6、ld, 80% of canine bacterial skin disease cases were pure bacterial skin disease, 20% were mixed infection of parasites and bacteria, and all the dogs were secondary infection. The colony forms are pale yellow or white, round, similar in size, smooth and protruding, with neat edges. The isolated colo
7、nies were all Gram-positive bacteria, of which 97.29% were Gram-positive staphylococci, 10.81% were Gram-positive bacteria, 60% of bacterial colonies have hemolytic rings on blood plates. The results show that canine bacterial skin diseases often occur in 2-4 year old long-haired dogs, and most of t
8、hem were secondary infections. Gram-positive Staphylococcus was the main pathogen causing bacterial skin diseases in dogs, and many kinds of bacteria could infect and cause diseases at the same time. Based on the theoretical analysis of related literature, it is speculated that the main pathogenic b
9、acteria may be Staphylococcus pseudintermedius, S. aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus chromogenes, Bacillus. The experiment provides reference for the determination of the main pathogenic bacteria of bacterial skin disease of dogs and the timely and effective treatm
10、ent of bacterial skin disease of dogs. Key words: canines; bacterial skin disease; DNA引起犬细菌性皮肤病主要致病菌的生物学分析陈可欣（天津农学院 动物科学与动物医学学院）1 引言1.1 犬皮肤病现状随着社会经济发展的进步，宠物犬数量与日俱增1，狗作为伴侣动物中的一员，在当今社会的家庭生活中开始更多作为人类精神寄托的存在，宠物犬疾病也逐渐受到人们的关注。在所有宠物疾病中，犬皮肤病是临床首诊中较常见的疾病之一。此种疾病治疗后易复发、治疗病程长、发病情况与犬自身诸多因素及周围环境条件等有很大关系，在诊断和治疗上有一
11、定难度，且其病原可在人与动物间交叉感染，具有一定的危害性。相关文献2中提出犬患皮肤病的病因主要有以下几种：寄生虫性皮肤病、真菌性皮肤病、细菌性皮肤病。研究数据中还显示出犬皮肤病全年均有发病，且每年7至10月的病例数是3至6月病例数的3倍。1.2 犬细菌性皮肤病的研究进展 有研究1显示，在临床中，几乎所有种类的犬都可能患上细菌性皮肤病，发病数约占犬患皮肤病数的40%。犬细菌性皮肤病常发生为外寄生虫、真菌、外伤等造成的继发感染，继发感染病例达 75.77%3，病因具有复杂性。从病原方面可将犬细菌性皮肤病分成球菌感染和杆菌感染；从致病机制方面可分为继发性感染和原发性感染；从临床症状，可分脓皮病、蜂窝
12、织炎和红癣等。其中在犬细菌性皮肤病临床病例症状中，以脓皮病最为常见，约占18%4。近些年来，在常见能引起全细菌性皮肤病的致病菌中，由于广谱抗生素的滥用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methiclliin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌（Methiclliin-resistant Staphylococcus pseudintermedius， MRSP）等耐药型细菌被许多研究5-7发现，耐药性细菌数量急剧增加，病原菌的耐药性严重影响着临床治疗效果，进一步加大了治疗的难度。1.2.1 病原能引起犬细菌性皮肤病的病原菌种类有很多
13、，其中不仅包括常见的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、绿脓杆菌（又名铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa）、中间型葡萄球菌（S. aureus）等常在机会致病菌，近年来，许多研究者还从患细菌性皮肤病病例中分离出其他菌种，如2007年Bannoehr8鉴别出伪中间型葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius），同年，Sasaki9等研究者发现MRSP菌株，其次还有2002年Pappalardo 等10从患有脓皮病犬患处分离的病原菌有奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、产色葡萄球菌（Staphyloco
14、ccus chromogenes）、芽孢杆菌（Bacillus）、大肠杆菌（E. coli）及粪链球菌（Streptococcus faecalis），以及Summers等11报道中所提到的施氏葡萄球菌（Staphylococcus schleiferi）、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、微细棒状杆菌（Coryne bacterium minutissimum）、分枝杆菌（Mycobacterium）等致病菌。 伪中间型葡萄球菌是犬黏膜上的常在菌，能够暂时存在于犬黏膜上而不致病，当该菌因犬只免疫力低下，或是皮肤受损、黏膜完整结构被破坏等情况转变为致病菌时，引起脓皮病
15、、伤口感染发炎、外耳道炎以及尿道感染等症状12。在童胜涛的研究4中数据显示，武汉地区引起犬患细菌性皮肤病的致病菌中伪中间型葡萄球菌约占比58.16%，此比例远高出其他致病性分离菌株的5倍之多。2014年，Karen H R，Alexander H W所著书13及国外外文文献14中也均表明伪中间型葡萄球菌为犬患细菌性皮肤病最主要的致病菌。其次，辽宁锦州及江西等多地区的犬细菌性皮肤病临床病例的患处分离验证伪中间型葡萄球菌是引起犬患细菌性皮肤病的病原菌15-16。在2007年Bannoehr8所发表的相关外文研究表明从中间型葡萄球菌中鉴别出伪中间型葡萄球菌，推断之前研究中从犬细菌性皮肤病患处分离出的
16、伪中间型葡萄球菌可能被误诊为中间型葡萄球菌。中间型葡萄球菌具有一定的侵袭性17-18，严重的甚至可造成菌血症、皮肤脓肿、各器官炎症等。在曾婉秋19等的研究中，犬源中间型葡萄球菌的分离率为9.71%，且39%的犬口腔中存在中间型葡萄球菌。当宠物的免疫力下降或皮肤免疫系统有所损伤时，中间型葡萄球菌极易通过舔舐在患处引发感染，造成病症。2001年马丽平20及陆江等21的研究报道中提到中间型葡萄球菌为引起犬细菌性皮肤病主要的病原菌，薛占永22等的研究数据中，中间型葡萄球菌的检出率为38.9%，占有相当的比重。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界环境、各种动物的皮肤和呼吸道以及食物中，感染该菌可在犬皮肤上造成
17、溃烂，发炎肿胀，脱毛等症状，严重者甚至可能造成死亡。金黄色葡萄球菌在许多文献中被提及是犬细菌性皮肤病重要致病菌之一23-24，曾在过去被认为是对研究犬细菌性皮肤病治疗有临床意义的重要菌属。在武汉地区犬细菌性皮肤病的研究4中松鼠葡萄球菌检出率达10.2%，仅次于伪中间型葡萄球菌检出率，在薛占永等22的研究中，该菌的检出率占有2.8%的比重，说明在宠物临床中犬细菌性皮肤病患犬的患处有一定可能会检测出松鼠葡萄球菌的存在，此菌也是犬细菌性皮肤病致病菌之一。产色葡萄球菌是人类少见的病原菌，是存在于动物机体身上的低毒力条件致病菌25。其可用一种产色葡萄球菌选择性培养基26进行鉴别，因其产生色素，故取名产色
18、葡萄球菌。在北京地区，薛占永等22的研究报告数据中产色葡萄球菌检出率高达55.6%，且菌种构成比占31.7%。在童胜涛4相关研究得出的数据显示，短小芽孢杆菌在引起犬细菌性皮肤病病原菌中占比7.14%，是杆菌属中最高的菌种。1.2.2 致病机制临床中，细菌性皮肤病可分为继发感染和原发感染。正常完整的皮肤是机体中最大的免疫系统，作为防御外界病原侵害机体的第一道防线，具有一定防御功能。在表皮免疫系统存在缺陷或者犬免疫力的降低时，易诱导原发病的继发感染。当犬的表皮系统被破坏后，原存在于犬黏膜的常在菌通过犬的舔舐等方式转移到患处，患处渗出物及表皮脱落物为这些细菌提供了适宜的生长环境，使细菌快速大量繁殖，
19、引发细菌性皮肤病。外寄生虫感染的病犬与过敏患犬极易继发细菌性感染皮肤病，患犬会因极度瘙痒对患部舔舐、挠、蹭，使其表皮系统被破坏，给细菌创造了感染的机会，引起皮肤病。犬皮肤不洁、毛囊口被污物堵塞、引起皮脂腺机能障碍等因素也都可导致细菌在患处滋生，造成原发性细菌性皮肤病27。1.2.3症状细菌性皮肤病的致病菌以化脓杆菌为主，发病部位常常出现脓包、疖子、丘疹等28。犬细菌性皮肤病根据不同类型的感染，其主要的表现形式有脓皮病、蜂窝织炎和红癣等。脓皮病常集中于皮褶多、生活环境差的犬的腋下、四肢皱褶、腹股沟、皮肤黏膜结合处等。根据患处的严重程度可将脓皮病分为表层脓皮病、浅层脓皮病、深层脓皮病29。表层脓皮
20、病表现症状稍轻，脓疱、丘疹、鳞屑、结痂、表皮脱屑等；浅层脓皮病表现与表层脓皮病症状相似，在其病变区域可能会出现色素沉着和脱毛的现象；深层脓皮病则主要表现为结痂、溃烂、脓疱、丘疹，症状较前两者严重，病变区域会有脱失色素、掉毛等情况，有时还会形成窦道，有血清血浆样脓性物质渗出。蜂窝织炎，刚开始在发病部位出现弥漫型渐进性肿胀30，触诊可明显地感觉皮肤发烫，按压患部，病犬有疼痛反应，甚至可能会出现机能障碍，随后肿胀的坚实感慢慢消失，可感觉到病灶有局部波动感，穿刺患处可见有脓汁流出。严重者，治疗不及时，极易引起全身感染，发展成败血症而死亡。红癣是由微细棒状杆菌感染所引起的一类细菌性皮肤病症状31。其表现
21、为患犬皮肤上出现界限清楚的红色或褐色斑块，起初表面光滑湿润，随后逐渐开始出现皱褶、鳞屑，轻触患部，犬会有瘙痒感，常发生于腋下、趾间、腹股沟等部位。1.2.4 治疗薛占永等22研究药物敏感性试验结果表明，引起细菌性皮肤病的致病菌对青霉素耐药，但对其他-内酰胺酶稳定青霉素、-内酰胺酶抑制剂复合药物、相关头孢类以及碳青霉烯类抗生素等敏感。在治疗犬细菌性皮肤病时，使用抗生素是必不可少的。解决如何合理选用适宜的抗生素，尽量准确对因治疗，避免抗生素滥用使细菌产生耐药性，是当务之急。治疗时，结合患犬的身体情况以及病情等来用药，确定适当剂量并给予足够疗程。 犬细菌性皮肤病，在犬体表无明显溃烂，伤口等的情况下，
22、除抗生素治疗外，还可以用抗细菌感染香波进行药浴治疗32。在最新研究33中还发现使用具有抗生物膜活性的植物提取物对患细菌性皮肤病犬的患处进行局部治疗也有相当的疗效。若确诊为其他疾病的继发感染时，应尽快治疗原病因，从根本上解决问题。1.3 DNA测序技术的研究进展 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构后，1977年Sanger 测序法出现，到人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）完成，生物学研究也逐渐深入到了分子水平。研究34显示，DNA 测序法的进步在人类生物分子生物学研究领域起到至关重要的作用。与此同时，DNA测序技术变得更加的低成本、高通量以及多
23、功能。DNA测序技术的未来发展必定对疾病临床治疗等方面产生深刻的影响，不仅是单纯的测序们还将与基础生物学产生更加紧密的联系。在周晓光等的研究35中发现在过去的数十年的历史发展中，每经几年, DNA测序速度就呈指数增长。这种高速发展, 很大程度地改变了人们研究生命科学的方式，极大程度地推动了基因组学及其分支乃至其他诸如比较基因组学、系统生物学、生物信息学以及合成生物学等相关学科的创立与发展。在某种程度上，测序技术的进展已然可以从测量局部、单一的基因的片段或基因转变至可以检测整个基因组。快速、低廉的测序能力将会引领我们进一步促进比较基因组学分析、疾病诊断等发展，在未来，DNA技术极有可能可以帮助人
24、类进一步发现并掌握全部生物的基因组及对其有意义的变异进行分析解释。预测可发生突变的异常基因，掌握生物基因突变性质及其所表达出的信息，防患于未然。1.3.1 DNA测序在细菌性皮肤病鉴别诊断中的应用通过DNA测序技术测出致病菌DNA序列进行细菌同源性比对结果，可确定引起犬细菌性皮肤病的细菌种类。同时，DNA测序在测出细菌DNA序列后，通过耐药基因检验，在帮助人们了解其耐药性方面也起着不可忽视的重要作用。细菌产生耐药性与耐药菌株基因中出现的mecA等耐药基因有很大的关系。自 2005 年Devriese36发现了 MRSP，近 15年来 MRSP 的流行越来越严重，2008年CLSI正式将MRSP
25、定义为含有mecA基因的伪中间型葡萄球菌，其基因可编码表达PBP2a蛋白，促进细胞壁的合成，使得细菌更易存活和繁殖。此外，mecA基因使得细菌对所有-内酰胺抗生素以及它们的衍生物（包括所有的青霉素类与头孢类）都具有了耐药性，并且还出现有联合抵抗现象37。1.4 研究目的及意义通过DNA技术检测出病因细菌序列，对在临床患病病例患处采集的病料中分离出的主要致病细菌进行细菌同源性鉴别分析，准确鉴别致病细菌种属，为宠物医生对患病犬进行有针对性的诊断提供准确的依据，辅助临床综合诊治，使患病宠物能够早预防早治疗早康复。研究引起犬皮肤病的细菌主要类型并了解其生物学性质，为研究预防和治疗犬细菌性皮肤病方面打好
26、基础。2 材料与方法2.1 实验对象 2019年12月26日-2020年1月10日期间来天津农学院附属动物医院检查的5只患细菌性皮肤病患犬及从其患处采集的脓汁、痂皮等病料。病例1：7岁，萨摩耶，公犬，15kg。左侧大腿皮肤破溃处有脓汁，患处周围有红斑。病例2：4岁，博美，母犬，3kg。腹部皮肤发红，脱毛、脓泡破溃有脓汁。病例3：5岁，德牧，公犬，22kg。情绪激动，有瘙痒抓挠以及其舔咬患处行为。臀部外侧皮肤发红、皮肤破损，患处有脓汁和痂皮。病例4：2岁，泰迪，公犬，体重为3kg。情绪萎靡，腰部皮肤患处脱毛，有少许痂皮，破溃。病例5：1岁半，串串（贵宾混种），母犬，5kg。背部患处发现寄生虫，有
27、刮蹭痕迹，皮肤瘙痒，不停抓挠。患处周围脱毛，破溃，有些许小脓疱，黄色痂皮。 2.2 实验材料2.2.1设备YX280B型高压蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）、DZF-6030型烘干箱（苏州纳美瑞电子科技有限公司）、SPX-600PE型恒温培养箱（力辰科技有限公司）、TS-211A卧式恒温摇床（常州亚特实验器材有限公司）、LIOO S600T型三目生物显微镜、FYL-YS-230L型冰箱（北京福意电器有限公司）、SW-CJ-1FD型无菌操菌工作台（苏州净化设备有限公司）、ZSBB-712 恒温水槽（上海智诚公司）、台式高速冷冻离心机TGL-16（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、XH-T旋涡混
28、合器（常州市万丰仪器制造有限公司）、10-1000l移液器、PCR 扩增仪（美国Bio-Rad公司），DYY-6C稳压稳流电泳仪（泰州星火生化仪器制造有限公司），BIO-RAD ChemiDoc XRS凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）、ThermoFisher超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc）等。2.2.2 试剂革兰氏染液（购自南京建成科技有限公司）、溶菌酶（Lysozyme,10mg/ml）、DNA提取试剂盒（KG203）、普通肉汤琼脂培养基（购自北京博奥生物有限公司）、普通液体培养基（北京博奥生物有限公司）、血平板（购自广州市鸿洲实验器材科技
29、有限公司）、生理盐水（鹿泉）、无菌水、蒸馏水、500ml无水乙醇（天津市广成化学试剂有限公司）。2.2.3耗材一次性无菌采样棉拭子、酒精灯、接种环、90mm玻璃培养皿、载玻片、试管、100ml量筒、500ml烧杯、250ml锥形瓶、1.5mlEP管、一次性无菌手套、移液管、1.5ml离心管、标签纸、记号笔、封口胶、脱脂棉。2.2.4 培养基配制及引物设计普通肉汤琼脂培养基：取15g固体粉末加入500ml蒸馏水。加热煮沸，搅拌至充分溶解，高压灭菌处理。普通液体培养基：取5.5g成品粉末加入500ml蒸馏水。加热煮沸，搅拌至充分溶解，高压灭菌处理。根据相关文献38及Vanderhaeghen W等
30、39相关研究设计出16S rRNA引物片段及mecA基因引物片段，由相关生物公司合成。根据相关研究报告38及Bannoehr J等8与童胜涛4的研究中的PCR扩增方法对16S rRNA基因引物及mecA基因引物进行PCR扩增。具体引物序列见表1。表1 16s rRNA 引物序列及扩增片段大小引物名称引物设计引物序列（5-3）片段大小16s rRNA 27F GAGTTTGATCCTGGCTCAG 1503bp1492RCGGTTACCTTGTTACGACTT mec AmecA-F AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C 532bp mecA-RAGT TCT GCA GT
31、A CCG GAT TTG C 2.3 实验方法2.2.1采样 根据赵熠群29研究文献中对患细菌性皮肤病犬患处病料所进行的采样方法对本次试验中的研究对象进行病样采集。所有样品病料采集均使用一次性无菌棉拭子，尽量减少污染物的影响。采集后的棉拭子储存于无菌管中，无菌管上做对应标记。2.2.2 细菌培养及分离2.2.2.1 细菌培养（1）脓汁处理方法：取出装有脓汁的无菌管，在无菌操作台里将接种环在酒精灯火焰上灼烧至红，待其冷却后，从管内蘸取一环脓汁，划线涂于平板上，四分法划线，每次分区划线前对接种环进行灼烧灭菌，从上一分区尾端接着划线，便于培养出单独菌落。（2）无菌棉拭子处理方法：取出装有棉拭子的无
32、菌管，在无菌操作台里将棉拭子取出直接涂于平板上，接种环接着划线，只需开始时灭菌一次即可。（3）痂皮及皮屑处理：用灭菌后接种环从无菌管中少量多次取病料点样划线于平板上，每次取样均需对接种环再次灭菌。将处理好的平板倒置放于37恒温箱中，5组样本10个平板，平板上做好样本组及组号标记，培养1224h，至长出明显菌落。2.2.2.2 细菌分离将可疑单独菌落挑出，接种于液体培养基中，摇床增菌培养待用，每日对其进行传代。2.2.3 染色镜检、鉴别 挑取单独菌落，进行革兰氏染色，放于显微镜下，观察细菌形态及特征，并统计细菌检出率。镜检后，挑取相应单独菌落划线接种于血平板中进行细菌培养，观察细菌在血平板中的溶
33、血情况。2.2.4 细菌DNA鉴定2.2.4.1 细菌DNA的提取 （1）用适宜移液器吸取200l样本菌液至2ml离心管后，加入1.4ml缓冲液GSL（试剂盒配套溶液），间歇振荡1分钟至样品混匀。（2）70水浴5min。由于革兰氏阳性菌细胞壁厚，需对其进行破壁处理，可离心静置，小心清除上清液后冷冻放置10min取出，在样品中加入适量溶菌酶溶液，在水浴锅中将温度提高至90以促进其细胞壁裂解。（3）将水浴后的样本于涡旋机上涡旋15s，后置于离心机中12000rmp（13400g）离心1分钟。取上清液102ml至新的2ml离心管中。将一粒抑制剂吸附片InhibitEX置入样本中，振荡至吸附片打开重悬
34、，室温水浴1min，使吸附片完全作用。（4）离心机12000rmp（13400g）离心3min。取上清液至1.5ml离心管，12000rmp（13400g）离心3min。再取上清液200l至新1.5ml离心管中，加入15lProteinase K。加入200l缓冲液GB，涡旋机涡旋15s。（5）70水浴加热10min。（6）加入200l无水乙醇，适当涡旋。溶液加入至一个吸附柱CR2中（套有收集管），12000rmp（13400g）离心30秒，倒掉废液，再将吸附柱CP2放入收集管中。（7）往吸附柱中加入已加入无水乙醇的500l缓冲液GD，12000rmp（13400g）离心30s，倒掉废液。再向
35、吸附柱CR2中加入600l事先加入过无水乙醇的漂洗液PW离心30s，倒掉废液，重复一次。（8）吸附柱CR2放回收集管中，再次离心2min，倒掉废液，于室温中放置数分钟至彻底晾干吸附材料中残余漂洗液，防止漂洗液中乙醇的残留对后续DNA实验造成影响。（9）将吸附柱CR2转放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部分悬空滴加50l洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12000rmp（13400g）离心2分钟，将溶液收集至离心管中。将回收DNA产物分装保存于冰箱中冷冻，防止裂解待用，做好标记。2.2.4.2 DNA浓度及纯度检测回收DNA产物可通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测其浓度，若有目的条带（1
36、503bp）出现明显，可不进行PCR扩增。若不明显需以所提取的DNA 作为模板，用细菌 16S rRNA引物在PCR仪进行扩增反应。2.2.4.3 细菌基因测序及序列比对分析 将最终获得的DNA片段及引物送至测序公司测定序列，所得结果在NCBI（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上进行比对，确定细菌种属，了解所提取的可疑致病菌的DNA中是否含有耐药基因。2.4 数据统计及分析通过目测观察法及显微镜镜下观察法统计不同样本中不同的可疑菌株检出率，检出率计算公式如下：检出率(%)=(某种菌检出样本数/受检标本总数)100%3 结果与分析3.1 定性分析3.1.1细菌形态及性
37、质鉴定根据细菌在普通肉汤培养基平板上及血平板上的生长情况及经革兰氏染色后显微镜下所观察到的细菌形态及特征对细菌进行鉴定。5组样本普通肉汤培养基上均长出淡黄色或白色、圆形、大小相似、光滑突起、边缘齐整的菌落（见图1、2）且5组样本组中的大部分单独菌落均出现有葡萄串状、蓝紫色的革兰氏阳性葡萄球菌（见图3），仅样本2中含有一株单独菌落中为短杆状或链状的革兰氏阳性杆菌（见图4）以及一株革兰氏阳性葡萄球菌与少量杆菌混合的单独菌落（见图5）。血平板中2、3、5号样本组中所挑取的单独菌落出现透明溶血环（见图6），样本组1号、4号未见有明显溶血环（见图7），菌落形态与普通培养基上相似。图3 样本3.1革兰氏染
38、色镜检情况图2 样本5.2普通培养基上的生长情况图1 样本1.1普通培养基上的生长情况312图4 样本2.2中出现革兰氏阳性杆菌染色镜检情况图7 样本组1血平板上的生长情况65图5 样本2.2中出现球菌及少量短杆菌染色镜检情况图6 样本组3血平板上的生长情况473.1.2 DNA鉴定结果 DNA片段分装保存，结果还需进一步实验鉴定。3.2 定量分析3.2.1 犬细菌性皮肤病病因比例情况 于天津农学院附属动物医院检查的5只患皮肤病患犬初诊断结果，样本4为寄生虫与细菌混合感染引起的细菌性皮肤病，所有样本均为继发性感染引起的细菌性皮肤病（见表2）。表2 犬细菌性皮肤病病因比例情况 病因混合感染单纯感
39、染总计继发性感染原发性感染总计病例数/例145505比例/% 20801001000100由表中可以看出，20%为寄生虫与细菌混合感染性皮肤病，80%为单纯感染细菌性皮肤病，临床中单纯感染细菌性皮肤病发生比例较高，但也有混合感染造成皮肤病的比例存在。且5只研究对象均为继发性感染，由此可见，继发性感染所造成的细菌性皮肤病在临床病例中占据着相当高的比例。3.2.2 单独菌落菌种分布情况对5个样本组的10个平板中单独菌落进行革兰氏染色后，置于光学显微镜下进行观察。检查结果见表3。表3 单独菌落菌种分布情况 菌种/株样本编号革兰氏阳性葡萄球菌 革兰氏阳性杆菌 球菌+杆菌 总计未检出1.1400411.
40、2300322.1211502.2202413.1400413.2500504.1300324.2300325.1200235.240041总计33133713由表3可知，有97.29%（36/37）的检出样本中含有革兰氏阳性葡萄球菌，可确定革兰氏阳性葡萄球菌为引起犬细菌性皮肤病的主要致病菌，而10.81%（4/37）的菌株中染色镜检结果中出现革兰氏阳性杆菌，且其中8.11%（3/37）为革兰氏阳性球菌与革兰氏阴性球菌的混合菌落，2.70%（1/37）只含有革兰氏阳性杆菌，推测革兰氏阳性杆菌为犬细菌性皮肤病的致病菌之一，但不是最主要致病菌。相较于革兰氏阳性杆菌的检出率来说，革兰氏阳性葡萄球菌的
41、检出率远高出10倍之多，可确定革兰氏阳性葡萄球菌属为本次研究试验患细菌性皮肤病犬的最主要致病菌，具体为何种葡萄球菌还未确定，需进一步试验。4 讨论4.1 犬细菌性皮肤病临床情况本试验在临床中所研究的5只患犬中60%集中在2-4岁，7岁老年犬一只，寄生虫与细菌混合型皮肤病一只为1岁半幼犬，统计结果与沈丽40就上海地区犬患细菌性皮肤病病例调查报告中所提到的犬细菌性皮肤病在2-6岁犬中发病率最高，其次为6岁以上的结论相符，且病例5年龄符合文献中对于混合型感染病例在犬的各年龄阶段均可发生的描述。2-4岁犬年轻有活力，在户外喜欢四处乱跑，对新鲜事物充满好奇，极易刮蹭破皮，给细菌提供感染入口。老年犬由于免
42、疫力降低容易使细菌转变为致病菌而导致细菌感染，引起细菌性皮肤病。试验时间处于冬季，仅在天津农学院附属动物医院采集到的5例患细菌性皮肤病犬病例，与刘洁等相关研究41-44中皮肤病常发于夏秋季节，冬季病例较少的结论相符合。能引起犬细菌性皮肤病的主要致病菌喜好潮湿温暖的环境，冬季气温低气候干燥，细菌活性相对于夏秋两季来说较低，繁殖速度较慢，因此患病犬只较少。5只病例中母犬占40%，公犬占60%，比重相差不大，公犬比重略高于母犬，符合孙彦婷45等对于郑州金水区多个病例研究得出雄性犬较雌性犬易感的结论。同时也说明犬细菌性皮肤病在所有性别的犬中均可发生。公犬较母犬好动，脾气较躁，皮肤感染细菌的可能性相对较
43、高一些。试验中的研究对象均为长毛、毛发较为浓密的犬种，与陈兴娟46就福建漳州78例犬分析结果相符。毛发浓密给细菌提供了良好的附着环境，若不及时清理毛发，毛孔易堵塞，细菌更易滋生。试验中中小型犬较大型犬易感，可能与天津地区近年来饲养小型犬数量较大型犬稍多有关，因此只能间接地说明了犬细菌性皮肤病在所有体型的犬种中均有可能发生，主人应注意护理宠物犬皮肤卫生，及时清理毛发，定时给犬只洗澡，保持宠物犬的皮肤表面干燥清洁。本试验得出80%的犬为单纯细菌感染，此结果与童胜涛4中的24.24%存在出入，原因可能为：（1）环境及患犬个体差异；（2）样本数量小，存在偶然性，推测后者可能性更大。有100%犬患细菌性
44、皮肤病是继发感染，此结果大于沈丽40研究中数据，但结合李纯林等4，40，47的文献结论均可以说明犬细菌性皮肤病主要为继发感染。且存在与寄生虫、真菌等其他致病因素混和型感染病例，临床宠物医生在治疗时应结合病因综合治疗。4.2 犬细菌性皮肤病致病菌预测本试验中联系目前试验所得结果，通过细菌培养及血平板溶血环形态与细菌DNA测序技术相关文献理论分析相结合，推测引起犬细菌性皮肤病主要致病菌的种属可能为伪中间型葡萄球菌、中间型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、产色葡萄球菌、短小芽孢杆菌，其中伪中间型葡萄球菌为最主要致病菌的可能性最大，预测结果还需要进一步验证。且犬细菌性皮肤病可由多种菌种共同感染引起，在使用抗生素治疗时，需注意联合抗菌治疗同时合理使用适宜抗生素，防止抗生素滥用。4.2.1 根据细菌培养及血平板溶血环 本试验5组样本组在普通肉汤培养基上均长出淡黄色或白色、圆形、大小相似、光滑突起、边缘齐整的菌落。革兰氏染色显微镜观察结果显示97.29%菌为葡萄串状、蓝紫色的革兰氏阳性葡萄球菌以及少量短杆状或链状的革兰氏阳性杆菌，此结果与曲强、管庆松等文献中48-49提及革兰氏阳性葡萄球菌是导致犬患细菌性皮肤病的主要致病菌结论一致。60%血平板上出现透明溶血环，40%血平板未出现明显溶血环。4.2.