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1、学兔兔标准下载11.220CCSB41备案号：XXXX-XXXX中华人民共和国农业行业标准5722023代替NY/T5722016、NY/T29602016兔出血症诊断技术Diagnostictechniquesforrabbithaemorrhagicdisease20240501实施20231222发布中华人民共和国农业农村部发布学兔兔标准下载学兔兔标准下载NY/T前言本文件按照GB/T标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草.本文件代替NY/T兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法和NY/T兔病毒性出血症病毒RTPCR检测方法,与NY/T和NY/T相比
2、,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:a)增加了临床诊断(见第章);b)更改了兔出血症病毒血凝和血凝抑制试验方法的试剂(见,年版的和)、样品(见,年版的)、HA试验(见,年版的第章)、HI试验(见,年版的第章);c)删除了玻片血凝法(年版的第章);d)更改了RTPCR试验的引物(见,年版的第章)、RTPCR步骤
3、(见,年版的、)、结果判定(见,年版的第章);e)增加了实时荧光定量RTPCR试验(见);f)增加了综合判定(见第章).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.S本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(AC/TC)归口.本文件起草单位:江苏省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心.本文件主要起草人:王芳、胡波、宋艳华、王志亮、陈萌萌、邵卫星、魏后军、范志宇、仇汝龙、朱伟峰.本文件及其所代替文
4、件的历次版本发布情况为:年首次发布为NY/T,年第一次修订;年首次发布为NY/T,本次为第一次整合修订.学兔兔标准下载学兔兔标准下载NY/T兔出血症诊断技术范围本文件规定了兔出血症临床诊断、血凝和血凝抑制试验、RTPCR试验、实时荧光定量RTPCR试验的技术要求.本文件适用于兔出血症流行病学调查、诊断、检疫以及病原鉴定.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB实验室生物安全通用要求NY/T兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义
5、本文件没有需要界定的术语和定义.缩略语下列缩略语适用于本文件.ririRHD:兔出血症型(abbithaemorrhagicdeasetype)RHD:兔出血症型(abbithaemorrhagicdeasetype)rirrirRHDV:兔出血症病毒型(abbithaemorrhagicdeaseviustype)RHDV:兔出血症病毒型(abbithaemorrhagicdeaseviustype)临床诊断易感动物兔出血症病毒型(RHDV)主要感染月龄以上家兔并出现明显的临床症状.兔出血症病
6、毒型(RHDV)可感染家兔和野兔,家兔更易感,日龄以上的哺乳仔兔出现明显的临床症状和死亡.RHDV对其他动物,如地中海松田鼠和白齿鼩等,也有易感性.临床症状兔出血症(RHD)具有高度传染性和致死率,病兔的死亡率可达.最急性型:主要表现为突然死亡,死前表现短暂的兴奋,突然倒地,划动四肢呈游泳状继之昏迷,濒死时抽搐,角弓反张,典型病例可见鼻孔流出血样液体,肛门松驰,肛周有少量淡黄色黏液附着.急性型:主要表现为精神不振,食欲减退,渴欲增加,呼吸迫促乃至呼吸困难.
7、死前有短期兴奋、挣扎、狂奔、咬笼,全身颤抖,四肢划动.肛门松弛,肛周有少量淡黄色黏液附着,少数病死兔鼻孔中流出血样液体.慢性型:主要表现为精神不振,食欲减退或废绝,消瘦严重,衰竭而死.少数耐过兔,则发育不良,生长迟缓.RHDV感染死亡兔与RHDV感染死亡兔的症状相似.剖检病变肝脏淤血、肿大、质脆,表面呈淡黄色或灰白色条纹,切面粗糙;脾脏淤血、肿大,呈黑紫色;肾脏肿学兔兔标准下载NY/T大、淤血,并有出血点.胸腺水肿、
8、肿大、出血;肺脏有不同程度充血、淤血、水肿、出血;心脏淤血,心包膜有点状出血.鼻腔、喉头和气管黏膜淤血、出血;气管和支气管内有泡沫状血液.胃肠多充盈,浆膜出血;小肠黏膜充血、出血;肠系膜淋巴结水样肿大,其他淋巴结多数充血.胸腔和腹腔有血液样渗出物.结果判定出现、、的情况,初步判为兔出血症临床疑似病例,需要进一步开展实验室诊断.实验室诊断样品采集、保存、运输和处理
9、8;总则样品采集、保存和运输按照NY/T的规定执行.涉及病原检测应在生物安全二级实验室操作,按照GB的规定执行.组织样品采集无菌采集病死兔肝脏组织,装入无菌采样袋或一次性灭菌的mL或mL离心管并编号.样品保存和运输样品采集后置于保温箱中,加入预冷的冰袋,密封,h内送实验室;如未能在h送达实验室,应冰冻样品,加冰袋低温运输.样品应尽快处理,在保存宜不超过h;若需长期保存,样品应放在以下冰箱中.样品处理
10、;取兔肝脏组织,剪碎、研磨或匀浆,按g组织加mLPBS的比例配成悬液,反复冻融次,再以r/min离心min,取上清液作为血凝和血凝抑制试验材料.取兔肝脏组织,剪碎、研磨或匀浆,按g组织加mLDEPC水的比例配成悬液,反复冻融次,再以r/min离心min,取上清液作为核酸检测材料.(血凝HA)和血凝抑制HI)试验试剂PBS配置方法应符合附录A中A的规定.
11、049008;人“B”型或“O”型红细胞悬液(首选“B”型)应符合A的规定.高岭土悬液配方应符合A的规定.抗兔出血症病毒型特异性血清、抗兔出血症病毒型特异性血清、阴性血清(SPF兔血清)血清需进行非特异性凝集和非特异性抑制因子处理,见附录B.用于抗原检测时,用PBS稀释将阳性血清至HI效价为.样品待检兔肝脏悬液、阳性对照RHD病死兔肝脏悬液(或RHDV重组VP蛋白)、阳性对照RHD病死兔肝脏悬液(
12、或RHDV重组VP蛋白)、阴性对照健康兔肝脏悬液.RHDV重组VP蛋白的制备,将重组兔出血症病毒型VP杆状病毒接种Sf昆虫细胞d后,收集细胞培养物,反复冻融次后,以r/min离心min,取上清液即为RHDV重组VP蛋白,置于条件下备用.RHDV重组VP蛋白的制备,将重组兔出血症病毒型VP杆状病毒接种Sf昆虫细胞d后,收集细胞培养物,反复冻融次后,以r/min离心min,取上清液即为RHDV重组VP蛋白,置于条件下备用.HA试验h
13、9008;在孔U型微量反应板上,从第孔至第孔,每孔加入LPBS.学兔兔标准下载NY/T在第、第孔加入待检兔肝脏悬液L.从第孔开始,充分混合后用L微量移液器等量倍比稀释至第孔,稀释后第孔弃去L.第孔加入RHD病死兔肝脏悬液(或RHDV重组VP蛋白)L、第孔加入RHD病死兔肝脏悬液(或RHDV重组VP蛋白)L作为阳性对照,第孔加入健康兔肝脏悬液L为阴性对照.每孔
14、加人红细胞L,立即置于微型振荡器上摇匀,于静置minmin,待阴性对照孔中红细胞完全沉积后观察结果.结果判定.当RHD病死兔肝脏悬液(或RHDV重组VP蛋白)、RHD病死兔肝脏悬液(或RHDV重组VP蛋白)阳性对照红细胞凝集,健康兔肝脏悬液红细胞沉积时,试验成立.被检样品红细胞凝集的最高稀释度作为其血凝效价,HA效价判为阳性,HA效价判为阴性;HA效价为或判为可疑,应重复试验,重复后HA效价的判为阳性,否则判为阴性.HI试验(个血凝单位
15、HAU)悬液配置.根据测定的待检兔肝悬液HA效价,用PBS配制成HAU的悬液.在孔U型微量反应板上,自第孔至第孔,每孔加入PBSL.吸取处理后的血清L于第、第孔,第孔充分混匀后用L移液器等量倍比稀释至第孔,稀释后第孔弃去L.第第孔,每孔分别加HAU的抗原L,摇匀,温箱作用minmin.每孔各加人红细胞L,立即置于微型振
16、荡器上摇匀,于冰箱静置minmin,待PBS对照孔的红细胞完全沉积后观察结果.P每次测定须设已知效价的阳性血清对照、阴性血清对照(SPF兔血清)、HAU抗原对照、被处理血清对照(含PBSL、待检处理血清L、人红细胞L)、BS对照(含PBSL、人红细胞L).结果判定.当阳性血清HI效价与已知结果相比,误差不高于个滴度时,阴性对照血清HI效价不高于,个血凝单位对照HA效价为,试验成立.以完全抑制HAU抗原凝集的血清最高稀释度为被检血清HI抗体效价.用于抗体检测时,被检血清HI效价
17、时,判为阳性.用于抗原(病毒)检测时,HAU待检兔肝悬液能被抗兔出血症病毒型特异性血清和抗兔出血症病毒型特异性血清抑制,判为疑似RHDV阳性;HAU待检兔肝悬液的血凝能被抗兔出血症病毒型特异性血清抑制,不能被抗兔出血症病毒型特异性血清抑制,判为疑似RHDV阳性.注:在实际检测工作中,由于人的血细胞不易获取,也不易保存,而且不同操作者的判定结果缺乏一致性,所以可用其他方法代替HA和HI试验.RTPCR试验仪器设备PCR扩增仪.Й
18、008;高速冷冻离心机(最大离心力在g以上).核酸电泳仪和水平电泳槽.微量移液器(LL;LL;LL;LL).凝胶成像系统或紫外透射仪.试剂与材料引物,见附录C中的C.TAE储存液,配制方法按照附录A中的A
19、8;执行.学兔兔标准下载NY/T琼脂糖凝胶,配制方法按照A执行.DEPC水,配制方法按照A执行.F样品.待检兔肝脏悬液、阳性对照RHD病死兔肝脏悬液(或重组质粒pMDTvp,p基因序列GenBank:J)、阳性对照RHD病死兔肝脏悬液(或重组质粒pMDTvp,p基因序列GenBank:MT)、阴性对照健康兔肝脏悬液(或DEPC水).
20、049008;肝脏样品RNA的提取i取样品L,加入TrzolL,振荡混匀后,室温放置min;加入氯仿L,剧烈振荡后,室温放置min,以r/min离心min;取上层水相L,加入L异丙醇,混匀,放置min,以r/min离心min;去上清液,缓缓加入乙醇mL洗涤,以r/min离心min;去上清液,室温干燥min,加入DEPC水L,使充分溶解.或者按RNA抽提试剂盒的方法进行.RTPCR步骤反转录反应取提取的RNAL加入反转录反应液(配方见附录D中的D)中,瞬间离心混匀后置于PCR仪
21、中,反应参数为:反应min,孵育h,min,同时设立阴性对照和阳性对照,产物于保存备用.PCR反应取反转录产物L加入PCR反应液(配方见D)中,反应参数为:min;然后进入循环s,s,s,个循环;于延伸min,保存.结果观察将PCR反应产物于琼脂糖凝胶进行电泳,电压为V,时间为min,紫外灯下观察结果,并进行拍照.结果判定RHDV阳性对照有唯一一条约bp的目的条带,RHDV阳性对照有唯一一条约bp的目的条带,阴性对照
22、、空白对照无相应的目的条带的情况下,检测样品出现与阳性对照相同目的条带的判为阳性,即判定为RHDV或/和RHDV核酸阳性.实时荧光定量RTPCR试验仪器设备实时荧光定量PCR仪.其他器材同.试剂与材料
23、引物和探针,见附录E中的E.DEPC水,配置方法按照A执行.F样品.待检兔肝脏悬液、阳性对照RHD病死兔肝脏悬液(或重组质粒pMDTvp,p基因序列GenBank:J)、阳性对照RHD病死兔肝脏悬液(或重组质粒pMDTvp,p基因序列GenBank:MT)、阴性对照健康兔肝脏悬液(或DEPC水).肝脏样品RNA的提取同.
24、;实时荧光定量RTPCR操作取提取的RNAL加入反应液(配方见E)中,瞬间离心混匀后,置于实时荧光定量PCR仪中.按下列参考反应条件进行扩增(可根据仪器及试剂进行适当调整):min,s;然后进入循环s,s,个循环.学兔兔标准下载NY/T结果观察试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果.结果判定阳性对照品Ct值且扩增曲线有明显对数增长期,同时阴性对照扩增曲线无对数增长期的情况下,试验成立.检测样品的Ct值,且出现标准的S形扩增曲线,判为阳性,即样品中存在RHDV或/和RHDV核酸;无Ct
25、值或Ct值,且无标准扩增曲线,判为阴性,即样品中不存在RHDV或/和RHDV核酸.当检测样品Ct值,且扩增曲线均呈标准的S形曲线,判为可疑,需进行一次重复实验,如重复后仍然为上述结果,判为阳性;如Ct值,判为阳性;如Ct值,判为阴性.综合判定疑似RHDV感染引起的RHD符合、、,且病原样品HA试验阳性,判定为疑似兔出血症;可根据病原样品HI试验进一步分型,HI试验为疑似RHDV阳性的判定为疑似兔出血症型,HI试验为疑似RHDV阳性的判定为疑似兔出血症型.确
26、诊RHDV感染引起的RHD符合,且或试验结果为RHDV核酸阳性,判定为兔出血症型.符合,且或试验结果为RHDV核酸阳性,判定为兔出血症型.符合,且或试验结果为RHDV和RHDV核酸阳性,判定为RHDV、RHDV混合感染的兔出血症.学兔兔标准下载NY/T附录A(规范性)试剂的配制A(
27、;核酸电泳缓冲液TAE)ATAE储存液:分别称量NaEDTAHOg、冰醋酸mL、TrisBaseg,加灭菌双蒸水定容至mL.或商品化的试剂.AATAE溶液:取mL储存液加mL蒸馏水即可.琼脂糖凝胶将g琼脂糖干粉加到mLTAE溶液中,沸水浴或微波炉加热至琼脂糖熔化,待凝胶稍冷却后加入溴化乙锭,终浓度为g/mL.A/pPBS溶液(Й
28、008;molLPBS,H)分别量取KHPOg、NaHPOg、NaClg、KClg,加灭菌双蒸水定容至mL,调节pH至,保存备用.或商品化的试剂.ABO人“”型或“”型红细胞悬液的制备Blp取人“”型或“O”型红细胞以倍量PBS(mo/L,H)混匀洗涤红细胞,以r/min离心min,弃上清液,重复洗涤次.最后,将沉积的红细胞用PBS配成和(体积分数)的红细胞
29、悬液,置于条件下备用.A高岭土悬液取高岭土粉末g,加入按A配置的PBS溶液,定容至mL,保存.使用前摇匀.ADEPC水将DEPC加入去离子水中至终浓度为,充分混匀后作用h,分装,高压灭菌min,冷却后置于条件下备用.学兔兔标准下载NY/T附录B(资料性)血清非特异性凝集因子和非特异性抑制因子的处理方法B血清非特异性凝集因子的处理B兔血清会对人红细胞产生非特异性凝集,可用人红细胞对待检血清进行吸附.具体方法:取L血清,水浴灭活min,加入L人“”型红细胞悬液,振荡混匀,作用h后(其间振荡混匀次),
30、以r/min离心min(),收集上清液.B血清非特异性抑制因子的处理利用高岭土处理血清中的非特异性抑制因子.具体方法:将按B处理的兔血清加入L高岭土的沉淀中,振荡混匀,作用h后(其间振荡混匀次),以r/min离心min,收集的上清液即为稀释的血清.检测目的引物序列()扩增大小,bpRHDVvp基因上游引物:TATTCTGGGAACAACTCCAC下游引物:AACAGTCCGGTTGGATTTTGRHDVvp基因上游引物:CCCTGGAAGCAGTTCGTCAAAC下游引物:GATGTCAACAAGGTCTGACAG准学兔兔标下载NY/T附录C(资料性)R
31、TPCR试验用引物C引物vp基因扩增引物序列如表C所列.C表vp基因扩增引物序列C兔出血症病毒型中国WF/株PCR扩增vp基因靶序列TATTCTGGGAACAACTCCACCAACGTGCTTCAGTTTTGGTACGCTAATGCTGGGTCTGCGATTGACAACCCTATCTCCCAGGTTGCACCAGACGGCTTCCCTGACATGTCATTCGTGCCCTTTAACAGCCCCAACATTCCGACCGCGGGGTGGGTCGGGTTTGGTGGTATTTGGAACAGTAACAACGGTGCCCC
32、CGCTGCTACAACTGTGCAGGCCTATGAGTTAGGTTTTGCCACTGGGGCACCAAACAGCCTCCAGCCCACCACCAACACTTCAGGTGCACAGACTGTCGCTAAGTCCATTTATGCCGTGGTAACCGGCACAAACCAAAATCCAACCGGACTGTT(bp)C兔出血症病毒型中国SC/株PCR扩增vp基因靶序列CCCTGGAAGCAGTTCGTCAAACGTGCTTGAGCTTTGGTATGCTAGTGCCGGGTCTGCAGCTGACAACCCCATCTCCCAAATTGCTCCAGATGGTTTCCCTGACATGT
33、CATTTGTACCCTTCAGCGGTATCACCATCCCTACCGCAGGGTGGGTCGGGTTCGGTGGGATCTGGAACAGCAGTAATGGTGCCCCCTACGTCACGACCATGCAGGCTTATGAGTTGGGTTTTGCCACTGGAGTACCGAGCAACCCCCAACCCACCACCACCACTTCAGGGGCTCAGATTGTTGCCAAGTCCATCTATGGCGTTGCAAATGGCATAAACCAGACAACAGCCGGGTTGTTTGTGATGGCATCTGGTGTCATATCCACTCCAAACAGCAGTGCCACTACGTACACACCTCAGC
34、CAAACAGGATTGTTAACGCACCTGGCACCCCTGCTGCTGCCCCTATTGGCAAGAACACACCCATCATGTTCGCGTCTGTTGTTAGGCGCACCGGCGACATCAACGCTGAGGCCGGTTCAACTAACGGAACCCAGTACGGCGCGGGATCACAACCGCTGCCGGTGACAATTGGACTTTCACTGAACAATTATTCATCGGCACTTATGCCTGGGCAGTTCTTCGTTTGGCAGCTAAACTTTGCTTCCGGCTTCATGGAACTTGGCTTGAGTGTTGATGGATACTTCTACGCGGGAACAGGGG
35、CTTCAGCCACCCTCATTGACCTGTCAGACCTTGTTGACATC(bp)组分个检测体系的加入量,LRapidTaqMasterMixRHDV上游引物(mol/L)RHDV下游引物(mol/L)RHDV上游引物(mol/L)RHDV下游引物(mol/L)反转录产物组分个检测体系的加入量,LAnchoredOligo(dT)Primer(g/L)TSReactionMixTransScriptRT/RIEnzymeMixgDNARemoverRNasefreeWaterRNA模板标学兔兔准下载NY/T附录D(资料性)RTPCR反应液配制D反
36、转录反应液反转录反应液的配方见表D.D表反转录反应液配方DPCR反应液PCR反应液的配方见表D.D表PCR反应液配方组分个检测体系的加入量,LOneStepRTPCRBufferTaKaRaExTaqHS(U/L)PrimeScriptRTEnzymeMix上游引物(mol/L)下游引物(mol/L)ROXReferenceDyeII()RHDV荧光探针(mol/L)RHDV荧
37、光探针(mol/L)RNA产物灭菌水注:无需ROX的荧光定量PCR检测仪,反应液中以灭菌水替代ROX.检测目的引物序列()扩增大小,bpRHDVvp基因上游引物:CGGTTTGCCGMCATTG下游引物:CCAAARCTSAAGCACGTTKGRHDV探针:VICAGTGCAAGTTATTCTGGSAACAACTCBHQRHDV探针:FAMAACGCAAGTTTCCCTGGAAGCAGTTCBHQ准兔学兔标下载NY/T附录E(资料性)实时荧光定量RTPCR引物及反应液E引物和探针vp基因扩增引物和探针序列见表E.E表
38、;vp基因扩增引物和探针序列E兔出血症病毒型中国WF/株PCR扩增vp基因靶序列CGGTTTGCCGACATTGACCATCGAAGAGGCAGTGCAAGTTATTCTGGGAACAACTCCACCAACGTGCTTCAGTTTTGG(bp)E兔出血症病毒型中国SC/株PCR扩增vp基因靶序列CGGTTTGCCGCCATTGACCACGACAGAGGCAACGCAAGTTTCCCTGGAAGCAGTTCGTCAAACGTGCTTGAGCTTTGG(bp)E实时荧光RTPCR反应液实时荧光RTPCR反应液的配方见表E.E表实时荧光RTPCR反应液配方