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1、一种抗真菌抗生素发酵工艺优化及稳定性研究 摘要：镜检视察菌株菌落及细胞形态，用正交试验设计法确定菌株最佳发酵条件。结果表明，该菌株与链霉菌形态类似，革兰氏染色呈阳性，最佳发酵条件为葡萄糖 ，酵母液 ，装液量 L L，发酵时间 。所产抗生素对高温具有较高的稳定性，在酸性和中性环境中比较稳定。 关键词：菌株；抗真菌抗生素；发酵工艺 中图分类号：文献标识码：文章编号：0439114092050-02 ZHU Hai-dong，XIE Ping-hua，HUANG Tong-xin (Hangzhou Vocational and Technical College，Hangzhou 310118，C
2、hina) ： The colony and cell morphology of one strain was observed with microscopy. The orthogonal experiment was conducted to confirm the optimal fermentation conditions. The results showed that this strain was similar to Streptomyces on morphology. G+and the optimal fermentation conditions were glu
3、cose 15 g/L，yeast powder 40 g/L, loaded liquid 30 ml/250ml， fermentation time 73 h. The antibiotics produced by the actinomyces strain were highly stable in hot temperature， acidic or neutral environment. ： bacterial straim； antifungal antibiotic； fermentation process 现代医学的进步提高了重症病人的生存几率，然而由于这些病人的反抗
4、力较差，易发生条件致病真菌引起的深部感染。本探讨从土壤中筛选到一株放线菌Actinormyces ，前期试验证明该菌株的代谢产物能对部分导致深部真菌感染的微生物具有较好的抑制作用。本探讨通过试验了解该菌株的基本生长特点，运用正交试验优化其发酵工艺条件，并对该抗生素粗提物的相关性质进行了探讨，为后续对该菌株的进一步深化探讨打下基础。 材料与方法 试验材料 试验菌株由杭州职业技术学院生物制药探讨所供应。 主要培育基斜面培育基：可溶性淀粉 、 、 、蛋白胨 、琼脂 、土豆汁 ；平板培育基：高氏一号培育基；指示菌培育基：葡萄糖、蛋白胨、琼脂, , 蒸汽灭菌 ；种子培育基：葡萄糖、硫酸镁、蛋白胨、磷酸氢
5、二钾、硫酸亚铁、碳酸钙, 自然， 蒸汽灭菌 ；原始发酵培育基组成：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、氯化钠、碳酸钙、接种量为，培育基为，装液量 三角瓶。 试验方法 菌株生长过程视察将菌株接种至斜面培育基上，恒温 培育，当菌株生长至、 时，视察菌落特征，并用印片染色法视察菌株形态，用数码显微镜视察，拍摄并记录其生长过程。 发酵液中抗生素效价测定取 L发酵液 离心 ，取上清液，以白色念珠菌为指示菌株，用生物管碟法测定发酵液抗菌活性。 菌株发酵条件优化在原始发酵培育基的基础上，选择对培育基中的碳源葡萄糖、氮源酵母粉以及摇瓶装液量和发酵培育时间个因素采纳正交试验进行优化，其中因素分别为葡萄糖的浓度为
6、、，酵母液的浓度、，摇瓶装液量、，发酵培育时间、。 抗生素的稳定性探讨热稳定性试验。将发酵上清液置于 处理、 后，测定其抗生素效价。不同条件下的稳定性试验。将发酵液上清液分为份，调整，使之分别处于酸、中、碱性环境中，在 条件下处理 后，测定其抗生素效价。 结果与分析 菌株生长过程视察 恒温培育 后，平皿上出现紫色的小型菌落，表面光滑，四周略微可见稀疏菌丝。镜检视察可见少量气生菌丝，颜色较深，菌丝粗而长，分支较多。培育 后，菌落紫色渐退，颜色趋灰色，表面干燥丰满，边缘绒状菌丝增多。镜检发觉气生菌丝数量明显增多，相互缠绕，部分菌丝前端出现白色透亮的孢子丝。培育 后，菌落明显增大，颜色为灰色。此时气
7、生菌丝完全交织缠绕成团状，大量菌丝出现白色透亮孢子丝，同时可见有少量孢子散落，颜色多呈白色透亮。培育 后，肉眼可见菌落表面多褶皱突起或颗粒，颜色灰色。镜检视察到大量孢子形成，形成串状或散落成颗粒，具深色。培育 后，孢子散开成单个，或个甚至多个呈链状排列，孢子形态多为椭圆或圆形，颜色深色，菌丝已经完全消逝。由此可知该菌株斜面生长至 后完全成熟，其菌落和细胞形态上与链霉菌属放线菌相像。革兰氏染色结果显示菌株为阳性菌。 菌株发酵培育优化 依据正交表对发酵培育基及培育条件进行试验优化，结果及数据处理见表。由表可知，当葡萄糖为 ，酵母液 ，装液量 ，发酵培育时间保持在 时，菌株的发酵效价最高。根据该发酵
8、组合进行重复试验次，发酵液抑菌圈平均直径为 ，优化结果符合预期。 由值可知，以上个因素对发酵效价的影响程度由大到小依次为酵母液浓度、装液量、发酵培育时间、葡萄糖浓度，因此在后续的进一步发酵优化时，可重点考虑对结果影响较大的一些因素。 抗生素稳定性分析。 ）热稳定性试验数据显示，当离心分别后的发酵液处于 高温处理、 时，所对应的抗生素对指示菌所产生的抑菌圈直径分别为、 。以上数据表明，该抗生素在 条件下随时间的延长，抑菌效价的下降并不明显，常温下抑菌直径为 ，即使 高温处理 ，抑菌圈直径仍有 ，说明该抗生素对热具有较高的稳定性。试验过程发觉，该发酵上清液在高温下出现混浊现象，主要是蛋白质等物质发
9、生了变性并沉淀，预示可以采纳高温法去除发酵液中的部分蛋白质等物质。 ）抗生素在酸、中、碱性环境中的稳定性试验数据显示，发酵液处于原液状态时该抗生素对指示菌的抑菌圈直径为 ，当变更发酵液为、时，抑菌圈直径分别为、 。以上数据表明，当发酵上清液的为酸性和中性时，虽经高温处理，但该抗生素的抑菌效价改变很微小；而当发酵上清液的为碱性时，该抗生素效价急剧下降，抑菌圈直径由原液的 下降到 ，说明该抗生素在酸性和中性环境中比较稳定，而在碱性环境中不稳定。试验过程发觉，当发酵上清液在酸性条件下高温处理 后，溶液浊度要大于其他条件；当处于中性条件时，发酵上清液与其他条件相比最澄澈， 这个现象可能与发酵液中的蛋白
10、质变性有关，而且这些蛋白质在酸性条件下更易变性。这种现象预示着在对发酵液进行预处理时，可以通过变更其酸度来达到除去部分蛋白质的目的。 小结与探讨 本试验对筛选获得的一株产抗真菌抗生素的菌株进行了初步探讨。菌落和细胞形态的视察发觉，该菌株与链霉菌属相像，斜面培育至 菌株完全成熟。采纳正交试验设计法对该菌株的发酵工艺进行了优化，确定了最佳发酵工艺条件：葡萄糖 ，酵母液 ，装液量 ，发酵时间 。抗生素稳定性试验发觉，该抗生素具有较高的耐热性，并在酸性和中性环境下具有相对较高的抑菌活性， 表明该菌具有肯定的应用潜力。今后将通过系统分类学方法进一步明确该菌株的种属关系，全面探讨该抗生素分别纯化工艺及其理
11、化性质。 参考文献 姜楠，张德法，严冰，等条件致病真菌新型隐球酵母致病性探讨进展微生物学报， ： 席丽艳我国临床新现的条件致病真菌感染中国真菌学杂志，： e ，： 刘自贵，裘雁秋，谭明珍院内真菌感染及其药物的敏感性分析华西医学，： 沈萍，范秀容，李广武微生物学试验北京：高等教化出版社， 赵斌，何绍江微生物学试验北京：科学出版社， 任董春浅谈抗生素微生物检定管碟法操作留意要点安徽医药，： 正交试验法编写组正交试验法北京：国防工业出版社， 第8页 共8页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页第 8 页 共 8 页