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1、感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断 重点介绍两个内容重点介绍两个内容n分子诊断学分子诊断学n感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断第一节第一节 分子诊断学分子诊断学 现代生物学和现代医学研究都已经证明，除外现代生物学和现代医学研究都已经证明，除外伤和非正常死亡以外，人类所有疾病的发生、伤和非正常死亡以外，人类所有疾病的发生、发展和转归都与遗传物质发展和转归都与遗传物质(DNA)的直接或间接的直接或间接变化相关，这标志着现代医学的发展已逐步进变化相关，这标志着现代医学的发展已逐步进入入“基因组医学基因组医学”时代。时代。而基因组医学对疾病诊治的首要贡献便是而基因组医学对疾病诊治的首要贡献
2、便是“预预测医学测医学”(predictive medicine)。所谓预测医所谓预测医学就是在受精卵及其卵裂期、胚胎期、胎儿期、学就是在受精卵及其卵裂期、胚胎期、胎儿期、婴幼儿期或个体发病前期对遗传物质婴幼儿期或个体发病前期对遗传物质(DNA)的的直接或间接变化进行分析，以识别出疾病相关直接或间接变化进行分析，以识别出疾病相关基因的结构异常或功能异常或识别出发病风险基因的结构异常或功能异常或识别出发病风险基因的携带者，从而进行有效的预防和治疗。基因的携带者，从而进行有效的预防和治疗。很显然预测医学是以分子诊断很显然预测医学是以分子诊断(molecular diagnosis)技术为基础的。人
3、类常见的遗传性技术为基础的。人类常见的遗传性疾病有疾病有150200种，较为罕见的疾病有种，较为罕见的疾病有600800种，它们可能与人类种，它们可能与人类3000040000个基因个基因中的几千个基因相关。中的几千个基因相关。人人类类基基因因组组DNADNA全全序序列列数数据据的的公公布布以以及及几几十十种种细细菌菌、啤啤酒酒酵酵母母、秀秀丽丽线线虫虫、黑黑腹腹果果蝇蝇、拟拟南南芥芥等等多多种种模模式式生生物物全全基基因因组组序序列列测测定定的的完完成成，都都为为人人类类遗遗传传病病和和感感染染性性疾疾病病的的分分子子诊诊断断奠奠定定了了基础。基础。一、分子诊断学的发展一、分子诊断学的发展
4、现代预测医学现代预测医学分子诊断的诞生可追溯到分子诊断的诞生可追溯到1978年，著名美籍华裔科学家简悦威年，著名美籍华裔科学家简悦威(YuetWai Kan)首先应用液相首先应用液相DNA分子杂交技术对镰刀分子杂交技术对镰刀形细胞贫血形细胞贫血(S)实现了产前基因诊断。实现了产前基因诊断。诊断的基本原理诊断的基本原理 某一疾病的基因与某一遗传性标志连锁在一起，某一疾病的基因与某一遗传性标志连锁在一起，当时的遗传性标志就是限制性片段长度多态性当时的遗传性标志就是限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLPs)，即不同个体的即不
5、同个体的DNA用同一限制酶用同一限制酶切割产生片段的大小可不同，而这种不同与某切割产生片段的大小可不同，而这种不同与某种疾病或疾病的基因连锁在一起，从而间接地种疾病或疾病的基因连锁在一起，从而间接地诊断疾病。诊断疾病。这之后，基因诊断技术虽然只有短短的这之后，基因诊断技术虽然只有短短的20多年多年历史，但对疾病诊断学的影响作用却是革命性历史，但对疾病诊断学的影响作用却是革命性的。遗传标志从第的。遗传标志从第l代的代的RFLP，到第到第2代遗传代遗传标志标志(短串联重复序列短串联重复序列)，到第，到第3代遗传标志代遗传标志(单单核苷酸多态性：核苷酸多态性：SNP)，到直接检测基因；分到直接检测基
6、因；分析的层次从析的层次从DNA到到RNA到蛋白质；到蛋白质；分析的方法分析的方法DNADNA液相杂交和固相点杂交；液相杂交和固相点杂交；基因限制酶酶谱分析；基因限制酶酶谱分析；限制性片段长度多态性连锁分析；限制性片段长度多态性连锁分析；RNARNA杂交；杂交；PCRPCR体外扩增；体外扩增；荧荧 光光 原原 位位 杂杂 交交(fluorescence fluorescence insituinsitu hybridizationhybridization，FISH)FISH)；DNADNA测序；测序；生物芯片生物芯片(DNA chip)DNA chip)技术；技术；蛋白质印迹；蛋白质印迹；免
7、疫细胞化学免疫细胞化学使使传传统统的的基基因因诊诊断断(DNADNA诊诊断断)概概念念发发展展到到更更全全面面的的分分子子诊诊断断(DNADNA诊诊断断、RNARNA诊诊断断和和蛋蛋白白质质诊诊断断)的新概念。的新概念。19991999年年3 3月月，美美国国医医学学委委员员会会(ABMS)ABMS)批批准准美美国国医医学学遗遗传传学学委委员员会会(ABMG)ABMG)和和美美国国病病理理学学委委员员会会(ABP)ABP)创创立立一一项项旨旨在在推推动动美美国国分分子子诊诊断断的的认认证证资资格格培培训训计计划划：分分子子遗遗传传病病理理学学(MGP)MGP)，要要求求MGPMGP的的地地位位
8、必必须须等等同同于于医医学学及及人人类类遗遗传传学学和和病病理理学学。申申请请MGPMGP培培训训的的医医师师必必须须拥拥有有MDMD或或DODO博博士士学学位位，并并已已经经获获得得医医学学专专业业委委员员会会颁颁发发的的行行医医资资格格认认证证，等等等等。19991999年年1111月月，美美国国病病理理学学会会 创创 办办 的的 JoumalJoumal of of Molecular Molecular DiagnosticsDiagnostics杂杂志志正正式式出出版版，标标志志着着分分子子诊诊断的发展掀开了新的一页。断的发展掀开了新的一页。二、分子诊断的常用技术二、分子诊断的常用技
9、术 分子诊断的基础是分析被筛查者的组织细胞、分子诊断的基础是分析被筛查者的组织细胞、毛发、抗凝血或干血迹，甚至甲醛毛发、抗凝血或干血迹，甚至甲醛(福尔马林福尔马林)固定、石蜡包埋的组织中的基因。固定、石蜡包埋的组织中的基因。目目前前用用于于分分子子诊诊断断的的技技术术主主要要包包括括PCR-STRPCR-STR、原原 位位 PCRPCR、FISHFISH、RT-PCRRT-PCR、PCR-RFLPPCR-RFLP、PCR-PCR-SSCPSSCP、多多重重PCRPCR、定定量量PCRPCR、DNADNA测测序序、DCGEDCGE、异异源源双双链链分分析析、化化学学裂裂解解和和酶酶裂裂解解错错配
10、配分分析析、蛋蛋白白截截断断测测验验、质质谱谱法法(mass mass spectrometry)spectrometry)以及以及DNADNA芯片等。芯片等。1 1SouthernSouthern印迹技术印迹技术 SouthernSouthern印印迹迹是是分分析析DNADNA结结构构的的一一种种技技术术，由由于于人人体体内内除除了了红红细细胞胞外外几几乎乎所所有有的的细细胞胞均均可可分分离离到到足足量量的的供供SouthernSouthern分分析析的的DNADNA，所所以以用用SouthernSouthern印印迹迹技技术术可可对对缺缺失失、重重复复及及点点突突变变引引起的疾病诊断。起的
11、疾病诊断。DNA分分子子经经限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶酶酶切切，经经琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳将将所所得得DNA片片段段按按分分子子量量大大小小分分离离，然然后后将将含含DNA片片段段的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶变变性性，并并将将其其中中的的单单链链DNA片片段段转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或其其它它固固相相支支持持物物上上，而而各各DNA片片段段的的相相对对位位置置保保持持不不变变。这这种种滤滤膜膜即即可可用用于于下一步的下一步的杂杂交反交反应应。2 2WesternWestern印迹技术印迹技术 WesternWestern印印迹迹技技术术是是检检测测特特定定的的蛋蛋白白质质
12、的的方方法法。X X连连锁锁隐隐性性遗遗传传的的DuchenneDuchenne肌肌营营养养不不良良(DMD)DMD)是是由由 于于 基基 因因 缺缺 陷陷 而而 使使 肌肌 细细 胞胞 增增 强强 蛋蛋 白白(dystrophindystrophin)合合成成异异常常，用用WesternWestern法法可可检检测测患患者者肌肌细细胞胞增增强强蛋蛋白白，从从而而对对DMDDMD及及症症状状较较DMDDMD轻的进行分子诊断轻的进行分子诊断3 3PCRPCR技术技术 PCRPCR技技术术及及在在此此基基础础上上发发展展起起来来的的RT-PCRRT-PCR、PCR-PCR-RFLPRFLP、PCR
13、-SSCPPCR-SSCP、多多重重PVRPVR、定定量量PCRPCR等等技技术术已已成成为为目目前前进进行行分分子子诊诊断断必必不不可可少少的的技技术术。珠珠蛋蛋白白生生成成障障碍碍性性贫贫血血的的各各种种类类型型中中以以BartBart胎胎儿儿水水肿肿综综合合征征最最为为严严重重，本本病病患患者者两两条条1616号号染染色色体体上上的的4 4个个。基基因因均均有有异异常常。用用两两段段核核苷苷酸酸PCOPCO1 1，和和PC0PC02 2作作为为 基基因因的的扩扩增增引引物物；PCO3PCO3和和PC04PC04作作为为1111号号染染色色体体上上的的 基基因因的的扩扩增增引引物物并并以以
14、此此为为内内参参照照。从从羊羊水水细细胞胞中中提提取取DNADNA，以以PCRPCR法法扩扩增增，经经20203030个个周周期期后后，将将扩扩增增样样品品电电泳泳、染色后即可作诊断。染色后即可作诊断。4 4FISHFISH技术技术 FISHFISH技技术术即即荧荧光光原原位位杂杂交交速速、简简便便、灵灵敏敏等等优优点点。尤尤其其是是与与传传统统的的染染色色体体技技术术比比较较更更易易检检出出易易位位、倒倒位位、微微小小缺缺失失等等异异常常。FISHFISH技技术术还还可可以作为肿瘤的辅助诊断方法。以作为肿瘤的辅助诊断方法。5 5生物芯片生物芯片 生生物物芯芯片片的的发发展展将将是是分分子子诊
15、诊断断的的一一次次重重要要革革命命。DNADNA芯芯片片又又称称DNADNA微微列列阵阵，它它利利用用徼徼点点阵阵技技术术，将将探探针针(通通常常是是DNADNA或或cDNAcDNA)以以高高密密度度点点阵阵的的形形式式按按一一定定的的顺顺序序固固定定排排列列在在1 1 cm2的的硅硅片片(玻玻片片、尼尼龙龙膜膜等等)表表面面上上，再再将将所所研研究究的的样样本本材材料料如如DNADNA、RNARNA或或cDNAcDNA用用荧荧光光标标记记，在在芯芯片片上上与与探探针针杂杂交交；然然后后通通应应用用于于染染色色体体病病诊诊断断和和产产前前诊诊断断，具具有有过过激激光光共共聚聚焦焦显显微微镜镜等
16、等对对芯芯片片进进行行扫扫描描，井井配配合合计计算算机机系系统统进进行行分分析析，从从而而快快速速、准确地得出所需信息。准确地得出所需信息。DNADNA芯芯片片将将生生命命科科学学研研究究中中的的许许多多不不连连续续的的分分析析过过程程，如如样样品品制制备备、化化学学反反应应和和分分离离检检测测等等，移移植植到到芯芯片片中中并并使使其其连连续续化化和和微微型型化化。为为快快速速检检测测病病原原体体和和疾疾病病组组织织中中的的突突变变序序列列提提供供了了手手段，并可实现高通量、大规模的操作。段，并可实现高通量、大规模的操作。目前已研制出用于检测目前已研制出用于检测HIV基因、囊性纤维性基因、囊性
17、纤维性变相关基因、变相关基因、P53基因、乳腺癌相关基因等基因、乳腺癌相关基因等20多种基因芯片。例如已有人用有多种基因芯片。例如已有人用有96000个核苷个核苷酸探针的芯片，成功检调出乳腺癌和卵巢癌基酸探针的芯片，成功检调出乳腺癌和卵巢癌基因因BRCA-1第第11外显子上的外显子上的24个杂合突变。个杂合突变。三、分子诊断技术的应用三、分子诊断技术的应用目前已经能够进行分子诊断的疾病包括如下几种。目前已经能够进行分子诊断的疾病包括如下几种。1 1染色体疾病的诊断和产前筛查染色体疾病的诊断和产前筛查 染染色色体体疾疾病病包包括括染染色色体体数数目目异异常常和和结结构构畸畸变变。目目前前已已发发
18、现现的的人人类类染染色色体体疾疾病病约约1000010000多多种种，已已确确定定或或已已描描述述过过的的综综合合征征约约100100多多种种。例例如如最最常常见见的的染染色色体体疾疾病病DownDown综综合合征征(在在新新生生儿儿中中的的发发病病率率约约为为1/6001/6001/800)1/800)、神神经经管管缺缺陷陷症症以以及及性性腺腺发发育育不不全全等等多多种种染染色色体体异异常常造造成成的的先先天性缺陷。天性缺陷。染色体疾病可在光学显微镜下观察和识别，而染色体疾病可在光学显微镜下观察和识别，而特异的特异的FISHFISH诊断技术已成型、成熟。不仅可以诊断技术已成型、成熟。不仅可以
19、进行染色体诊断，还可以进行产前筛查，指导进行染色体诊断，还可以进行产前筛查，指导优生优育。优生优育。2 2单基因疾病的分子诊断和产前诊断单基因疾病的分子诊断和产前诊断 单单基基因因疾疾病病由由单单个个基基因因发发生生突突变变引引起起的的遗遗传传性性疾疾病病。已已发发现现的的人人类类单单基基因因病病多多达达400400种种以以上上。迄迄今今，已已经经了了解解许许多多单单基基因因疾疾病病的的致致病病基基因因以以及及发发病病机机制制，例例如如苯苯丙丙酮酮尿尿症症、G6PDG6PD缺缺乏乏症症、肝肝豆豆状状核核变变性性(Wilson Wilson 病病)、Huntington Huntington 舞
20、舞蹈蹈症症、脆脆性性X X综综合合征征、MarfanMarfan综综合合征征、血血友友病病A A、血血友友病病B B、血血红红蛋蛋白白病病、珠珠蛋蛋白白生生成成障障碍碍性性贫贫血血、软软骨骨发发育育不不全全、先先天天性性肾肾上上腺腺皮皮质质增增生生症症、糖糖原原累累积积症症、多多囊囊肾肾、家家族族性性高高胆胆固固醇醇血血症症、家家族族性性单单纯纯生生长长激激素素缺缺乏乏症症、某某些些神神经经肌肌肉肉系系统统疾疾病病(如如进进行行性性肌肌营营养养不不良良)、线线粒粒体体疾疾病病(如如LeberLeber视神经萎缩视神经萎缩)等。等。对对于于单单基基因因疾疾病病，诊诊断断越越早早、治治疗疗越越早早
21、，则则预预后后越越好好。例例如如一一旦旦筛筛查查确确诊诊为为苯苯丙丙酮酮尿尿症症患患儿儿，即即应应喂喂苯苯丙丙氨氨酸酸含含量量低低的的奶奶粉粉，进进行行饮饮食食控控制制疗疗法法，可可防防止止智智力力受受损损，甚甚至至智智力力发发育育可可达达正正常常水水平平。而而有有些些单单基基因因疾疾病病属属于于X X性性染染色色体体连连锁锁遗遗传传方方式式，具具有有性性别别遗遗传传的的特特点点，或或只只传传男男或或只只传传女女，因因此此通通过过产产前前诊诊断断进进行行性性别别选选择择，可可以以达达到到优优生生优优育育的的目目的的，解解除除患患者者的的切切身身痛痛苦苦。3 3多基因疾病的分子诊断多基因疾病的分
22、子诊断 多多基基因因疾疾病病是是大大面面积积危危害害人人群群健健康康的的多多发发病病、常常见见病病，如如恶恶性性肿肿瘤瘤、心心血血管管类类疾疾病病(动动脉脉粥粥样样硬硬化化、高高血血压压等等)、糖糖尿尿病病、神神经经系系统统疾疾病病(早早老老性性痴痴呆呆、重重症症肌肌无无力力等等)、精精神神-心心理理疾疾病病(精精神神分分裂裂症症、抑抑郁郁症症等等)、白白血血病病、哮哮喘喘、自自身身免免疫疫性性疾疾病病(系系统统红红斑斑狼狼疮疮、类类风风湿湿关关节节炎、白塞病等炎、白塞病等)、近视眼等。、近视眼等。这这些些疾疾病病的的分分子子病病因因十十分分复复杂杂，大大多多尚尚未未找找到到疾疾病病易易感感基
23、基因因，可可采采用用已已知知基基因因标标志志(geneicgeneic marker)marker)的的连连锁锁分分析析和和关关联联分分析析方方法法，对对疾疾病病进进行行亚亚型型的的基基因因分分型型和和鉴鉴定定等等辅辅助助诊诊断断，以以利利于疾病的正确治疗。于疾病的正确治疗。4 4感染性疾病的分于诊断感染性疾病的分于诊断 近近年年来来，感感染染性性疾疾病病如如伤伤寒寒和和副副伤伤寒寒、痢痢疾疾、结结核核、流流行行性性出出血血热热、病病毒毒性性肝肝炎炎、细细菌菌性性食食物物中中毒毒、败败血血症症、性性病病以以及及艾艾滋滋病病(AIDS)AIDS)等等的的发发病病日日益益上上升升。感感染染性性疾疾
24、病病的的诊诊断断目目前前主主要要依依靠靠病病原原学学及及免免疫疫学学检检测测，但但由由于于抗抗生生素素的的广广泛泛应应用用，细细菌菌感感染染性性疾疾病病的的病病原原学学及及免免疫疫学学检检测测的的敏敏感感性性受受到到一一定定影影响响，使使得得感感染染性性疾疾病病的的诊诊断受到限制。断受到限制。特特别别是是结结核核杆杆菌菌、幽幽门门螺螺杆杆菌菌、人人类类免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒、丙丙型型肝肝炎炎病病毒毒、人人类类乳乳头头瘤瘤病病毒毒、汉汉坦坦病病毒毒感感染染的的诊诊断断问问题题尤尤为为突突出出。分分子子诊诊断断技技术术具具有有快快速速、准准确确、特特异异性性高高、敏敏感感性性强强等等特特点点，不
25、不仅仅可可以以对对感感染染性性疾疾病病的的病病原原体体进进行行定定性性，而而且可以定量。且可以定量。目目前前可可以以开开展展分分子子诊诊断断的的感感染染性性疾疾病病病病原原体体主主要要有有结结核核杆杆菌菌(引引起起结结核核病病)、幽幽门门螺螺杆杆菌菌(与与消消化化性性溃溃疡疡、胃胃癌癌的的发发生生密密切切有有关关)、乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒(引引起起乙乙型型病病毒毒性性肝肝炎炎)、丙丙型型肝肝炎炎病病毒毒(引引起起丙丙型型病病毒毒性性肝肝炎炎)、庚庚型型肝肝炎炎病病毒毒(引引起起庚庚型型病病毒毒性性肝肝炎炎)、人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒(主主要要引引起起尖尖锐锐性性湿湿疣疣等等，其其中中某某些些
26、型型别别可可能能与与宫宫颈颈癌癌的的发发生密切有关生密切有关)、汉汉坦坦病病毒毒(引引起起流流行行性性出出血血热热)、类类风风湿湿因因子子(用用于于辅辅助助诊诊断断类类风风湿湿性性关关节节炎炎)、c c反反应应蛋蛋白白(为为肺肺炎炎球球菌菌的的c c多多糖糖物物质质，在在急急性性炎炎症症时时增增加加，主主要要用用于于辅辅助助诊诊断断活活动动性性风风湿湿热热等等)、淋淋球球菌菌(引引起起淋淋病病，其其中中性性病病淋淋巴巴肉肉芽芽肿肿亚亚种种主主要要引引起起化化脓脓性性淋淋巴巴结结炎炎和和慢慢性性淋淋巴巴肉肉芽芽肿肿)、沙沙眼眼衣衣原原体体(引引起起沙沙眼眼)、梅梅毒毒螺螺旋旋体体(引引起起梅梅毒
27、毒)、生生殖殖器器支支原原体体(引引起起泌泌尿尿生生殖殖系系感感染染与与不不育育)、单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒(其其中中HSV-2HSV-2主主要要引引起起原原发发性性生生殖殖器疱疹器疱疹)、人人类类嗜嗜T T细细胞胞病病毒毒(可可引引起起T T细细胞胞白白血血病病)、EBEB病病毒毒(可可能能与与儿儿童童恶恶性性淋淋巴巴瘤瘤、鼻鼻咽咽癌癌的的发发生生有有密密切切关关系系)、巨巨细细胞胞病病毒毒(孕孕妇妇早早期期子子宫宫内内感感染染可可引引起起死死胎胎、早早产产和和先先天天畸畸形形)、水水痘痘-带带状状疱疱疹疹病病毒毒(可可引引起起水水痘痘、带带状状疱疱疹疹，孕孕妇妇患患水水痘痘可可引引起起胎胎
28、儿儿畸畸形形、流流产产和和死死胎胎)、卡卡氏氏肺肺囊囊虫虫(主主要要引引起起AIDSAIDS的的继继发发感感染染)、嗜嗜肺肺军军团团菌菌(引引起起呼呼吸吸道道感感染染)、腺腺病病毒毒(引引起起呼呼吸吸道道、眼眼结结膜膜或或胃胃肠肠感感染染)、伯伯氏氏疏疏螺螺旋旋体体(引引起起莱莱姆姆病病)、阴阴道道毛毛清清虫虫(引引起起滴滴虫虫性性阴阴道道炎炎)、疟疟原原虫虫(引引起疟疾起疟疾)、HIV(HIV(引起引起AIDS)AIDS)。对上述感染性疾病病原体基因的检测，主要采对上述感染性疾病病原体基因的检测，主要采用用PCR结合结合ELISA的方法，以降低特异性差及的方法，以降低特异性差及PCR污染带来
29、的误诊问题。污染带来的误诊问题。5 5恶性肿瘤的分子诊断恶性肿瘤的分子诊断 目目前前肿肿瘤瘤的的治治愈愈率率仍仍不不高高，主主要要原原因因就就是是早早期期诊诊断断及及正正确确选选择择化化疗疗药药物物敏敏感感性性存存在在较较大大困困难难。造造成成到到医医院院确确诊诊的的癌癌症症患患者者，85%85%属属晚晚期期，70%70%以以上上已已有有远远处处转转移移。因因而而，肿肿瘤瘤的的早早期期发发现现和和诊断对肿瘤的预防和治疗至关重要。诊断对肿瘤的预防和治疗至关重要。n 肿肿瘤瘤标标志志在在诊诊断断肿肿瘤瘤、检检测测肿肿瘤瘤复复发发与与转转移移、判判断断疗疗效效和和预预后后以以及及人人群群普普查查等等
30、方方面面都都有有较较大大的实用价值。的实用价值。n肿肿瘤瘤标标志志可可分分为为基基因因标标志志和和基基因因表表型型标标志志，基基因因标标志志是是指指基基因因本本身身突突变变和和表表达达异异常常，能能反反映映癌癌前前启启动动阶阶段段的的变变化化；基基因因表表型型标标志志是是指指基基因因产产物物表表达达和和调调控控异异常常，表表现现为为其其所所编编码码的的表表达达产产物物合合成成紊紊乱乱，产产生生胚胚胎胎性性抗抗原原、异异位位蛋蛋白白，一般出现较晚。一般出现较晚。因此，寻找特异性肿瘤基因标志进行肿瘤基因因此，寻找特异性肿瘤基因标志进行肿瘤基因诊断，对于肿瘤早期发现具有重要意义，并可诊断，对于肿瘤早
31、期发现具有重要意义，并可在患者临床症状出现以前预测肿瘤的易感性。在患者临床症状出现以前预测肿瘤的易感性。通过检测通过检测AFP、CEA、CA、abl、AFC、ras、myc、p53、p16、bcl2、BRCA1、BRCA2、c-erbB2、MMR、KALI、微卫星微卫星DNA不稳定不稳定性、性、LOH等肿瘤标志或癌基因、抑癌基因的等肿瘤标志或癌基因、抑癌基因的变化，可以为肿瘤患者提供一个可靠的诊断指变化，可以为肿瘤患者提供一个可靠的诊断指标。标。例如导致女性的例如导致女性的“第一杀手第一杀手”乳腺痛，在乳腺癌乳腺痛，在乳腺癌大家系中大家系中2/3的患者身上可检测到的患者身上可检测到BRCAl和
32、和BRCA2基因。基因。四、疾病分子诊断的展望四、疾病分子诊断的展望 任任何何疾疾病病的的发发生生都都是是遗遗传传物物质质和和环环境境因因素素相相互互作作用用的的结结果果。人人类类疾疾病病基基因因和和相相关关基基因因的的定定位位、分分离离和和克克隆隆为为现现代代医医学学带带来来了了空空前前的的机机遇遇。一一般般而而言言，某某一一致致病病基基因因被被发发现现后后，几几个个月月内内即即可可用用于于诊诊断断，而而疾疾病病相相关关基基因因可可能能也也只只需需要要2-2-3 3年年就就可可被被用用于于评评估估患患病病风风险险。疾疾病病基基因因突突变变谱谱尤尤其其是是SNPSNP图图谱谱的的建建立立，势势
33、必必为为分分子子诊诊断断提提供强有力的工具。供强有力的工具。未来的分子诊断将朝着未来的分子诊断将朝着3 3个主要方向发展：个主要方向发展：胚胚胎胎着着床床前前诊诊断断：在在囊囊胚胚8 8个个细细胞胞期期，通通过过对对细细胞胞的的染染色色体体核核型型分分析析和和原原位位杂杂交交，从从而而将将人人类的遗传缺陷控制在最早期阶段；类的遗传缺陷控制在最早期阶段；母母体体外外周周血血中中胎胎儿儿细细胞胞分分析析技技术术：通通过过检检测测母母体体外外周周血血中中胎胎儿儿细细胞胞而而非非通通过过羊羊膜膜穿穿刺刺或或采采集集绒绒毛毛进进行行产产前前诊诊断断，是是一一种种非非常常有有潜潜力力的的无无创创伤产前诊断
34、方法；伤产前诊断方法；对对常常见见病病、多多发发病病如如心心血血管管系系统统疾疾病病、糖糖尿尿病病、精精神神疾疾病病、神神经经系系统统疾疾病病、恶恶性性肿肿瘤瘤、哮哮喘喘、近视眼等进行准确的分子诊断。近视眼等进行准确的分子诊断。遗传性疾病除给患者本人带来痛苦外，还造成遗传性疾病除给患者本人带来痛苦外，还造成家庭与社会的巨大负担。虽然目前大多数遗传家庭与社会的巨大负担。虽然目前大多数遗传病没有有效的治疗方法，但若能得到及时诊断，病没有有效的治疗方法，但若能得到及时诊断，根据该病的遗传方式、再发风险、有无产前诊根据该病的遗传方式、再发风险、有无产前诊断的方法，就有可能防止再生一个患类似疾病断的方法
35、，就有可能防止再生一个患类似疾病的孩子。的孩子。总之，随着后基因组学的深入和分子诊断技术总之，随着后基因组学的深入和分子诊断技术的不断更新，特别是与其他学科如胚胎学、妇的不断更新，特别是与其他学科如胚胎学、妇产科学、生殖生理学和仪器分析技术等的相互产科学、生殖生理学和仪器分析技术等的相互交叉和渗透，分子诊断将朝着高效、准确、灵交叉和渗透，分子诊断将朝着高效、准确、灵敏和无创伤的方向发展。敏和无创伤的方向发展。分子诊断主要存在的问题，是其准确性、稳定分子诊断主要存在的问题，是其准确性、稳定性和复杂性。性和复杂性。以女性常见的乳腺癌为例，以女性常见的乳腺癌为例，1996年美国的年美国的Myriad
36、 Genetics公司向市场推出了检测乳腺公司向市场推出了检测乳腺癌易感基因癌易感基因BRCAl和和BRCA2携带者的试剂盒携带者的试剂盒BRAC Analysis，深受欢迎。但实践发现这种深受欢迎。但实践发现这种预测并非万无一失。研究表明，携带乳腺癌基预测并非万无一失。研究表明，携带乳腺癌基因并有家族史的女性，罹患乳腺癌的风险最多因并有家族史的女性，罹患乳腺癌的风险最多只有只有50%，而不是通常认为的，而不是通常认为的85%。预预测测医医学学固固然然为为疾疾病病的的早早期期预预防防提提供供了了便便利利，但但同同时时也也可可能能带带来来一一系系列列伦伦理理、法法律律和和社社会会学学问题。问题。
37、首先，由于基因检测能很容易地推定一个胎儿首先，由于基因检测能很容易地推定一个胎儿是否含有某种缺陷基因，且这种基因将有可能是否含有某种缺陷基因，且这种基因将有可能使胎儿在某个年龄段比如少年时代夭折，那么，使胎儿在某个年龄段比如少年时代夭折，那么，胎儿的父母和其他家庭将做何选择胎儿的父母和其他家庭将做何选择?顾念骨肉顾念骨肉深情坚持保留，是人类的本能和传统的选择，深情坚持保留，是人类的本能和传统的选择，但基因检测的但基因检测的“死亡之约死亡之约”又使人能预见未来又使人能预见未来的的“丧子之痛丧子之痛”。其其次次，基基因因歧歧视视(genetic genetic discrimination)dis
38、crimination)，基基因因图图的的公公开开和和共共享享将将使使个个人人的的基基因因信信息息因因此此成成为为像像身身份份证证之之类类的的个个人人信信息息之之一一。但但对对于于被被检检测测出出存存在在有有基基因因缺缺陷陷的的人人，有有可可能能受受到到来来自自各方面的歧视各方面的歧视(就业、恋爱、婚姻、保险等就业、恋爱、婚姻、保险等)。最最后后，传传统统上上患患者者的的医医疗疗信信息息仅仅限限于于患患者者和和医医师师之之间间，于于其其他他人人无无关关。但但将将来来如如果果基基因因检检测测出出患患者者患患有有某某种种遗遗传传性性疾疾病病，那那么么医医师师将将如如何何处处置置?告告诉诉患患者者正
39、正打打算算怀怀孕孕或或已已经经怀怀孕孕的的妻妻子子或或姐姐妹妹他他们们的的后后代代将将同同样样有有这这样样的的遗遗传传病病?把把这这种种不不祥祥信信息息通通告告给给患患者者所所有有的的家家庭庭成成员员，使使他他们们的的心心灵灵乌乌云云密密布布、生生活活上上手手足足无无措措?同同时时，西西方方天天主主教教思思想想中中的的激激烈烈反反节节育育和和反反堕堕胎胎的的教教义将受到必然的全面的冲击。义将受到必然的全面的冲击。第二节第二节 感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断一、感染性疾病基因诊断的策略一、感染性疾病基因诊断的策略 感染性疾病是由于感染了某种病原体而引起的感染性疾病是由于感染了某种病原体
40、而引起的一类疾病。过去对这类疾病的病因诊断是通过一类疾病。过去对这类疾病的病因诊断是通过检测病原体的形态或通过病原体的培养观察其检测病原体的形态或通过病原体的培养观察其生态、生化特性以及毒性试验等，或检测病人生态、生化特性以及毒性试验等，或检测病人体内特异性抗体等方法作出判断。这些方法存体内特异性抗体等方法作出判断。这些方法存在较大缺陷。在较大缺陷。病原体都是生物体，每种生物都有各自种族特病原体都是生物体，每种生物都有各自种族特异的基因。异的基因。DNA重组技术的发展，对多种病重组技术的发展，对多种病原体的基因作了大量的分析工作，对常见病原原体的基因作了大量的分析工作，对常见病原体的特异基因或
41、体的特异基因或DNA片段的组成特点积累了片段的组成特点积累了大量的资料。大量的资料。采用核酸分子杂交技术，针对病原体特异的核采用核酸分子杂交技术，针对病原体特异的核酸序列设计探针来进行杂交；酸序列设计探针来进行杂交；应用应用PCR技术扩增病原体基因的保守序列；技术扩增病原体基因的保守序列；将核酸分子杂交技术与将核酸分子杂交技术与PCR技术联合应用，能技术联合应用，能够对大多数感染性疾病作出明确的病原体诊断，够对大多数感染性疾病作出明确的病原体诊断，而且能诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病而且能诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分类、分型鉴定。原体进行分类、分型鉴定。二、病毒性肝炎的基因
42、诊断二、病毒性肝炎的基因诊断(一一)肝炎病毒基因中可用于基因诊断的序列肝炎病毒基因中可用于基因诊断的序列 1.1.甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒(hepatitis A virushepatitis A virus，HAV)HAV)只只有一个血清型，其基因组为线状、单股正链有一个血清型，其基因组为线状、单股正链RNARNA分子，仅含一个开放阅读框，迄今已有几分子，仅含一个开放阅读框，迄今已有几株甲肝病毒基因全序列得到克隆，如株甲肝病毒基因全序列得到克隆，如HMl75,HMl75,MBB,LAMBB,LA等。等。以以HMl75HMl75序列为例，甲肝病毒基因的结构可表序列为例
43、，甲肝病毒基因的结构可表示为：示为：5-5-非编码区（非编码区（noncodingnoncoding region,region,NCR)-pNCR)-p1 1区区-P P2 2区区-P P3 3区区-3-3-NCR-NCR-多聚腺苷尾。其多聚腺苷尾。其中中P P1 1编码病毒核壳蛋白，编码病毒核壳蛋白，P P2 2是转录及基因调节是转录及基因调节区；区；P P3 3区编码非结构蛋白。而区编码非结构蛋白。而5-5-NCRNCR是是HAVHAV基基因组中最保守的部分，各病毒株间核苷酸序列因组中最保守的部分，各病毒株间核苷酸序列的一致性达的一致性达96%96%97%97%。全长。全长734734b
44、pbp。3-NCR3-NCR约约为为6060bpbp，也相对较保守。也相对较保守。2 2乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒(HBV)HBV)基基因因组组包包含含4 4个个开开放放阅阅读读框框(ORF)ORF)，分分别别为为S S、C C、P P和和X X区区。C C区区编编码码IBVIBV的的HBcAgHBcAg，变变异异性性较较小小，是是HBVHBV基基因因中中较较为为保保守守的的区区段段，是是扩扩增增的的最最佳佳部部位位。S S区区、P P区区和和X X区区中中亦有较保守的序列，可作为靶序列进行扩增。亦有较保守的序列，可作为靶序列进行扩增。3丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 丙型肝
45、炎病毒丙型肝炎病毒(HCV)基因组为单股正链基因组为单股正链RNA，基因组由基因组由5-NCR、开放阅读框开放阅读框(ORF)和和3-NCR组成。其中组成。其中ORF包括靠近包括靠近5端的结构基因端的结构基因区，该区内含有核心蛋白基因区，该区内含有核心蛋白基因(C)、包膜蛋白包膜蛋白基因基因(E1)，以及靠近以及靠近3端的非结构基因区端的非结构基因区（NS1/E2，NS2-NS5)。在在HCV HCV RNARNA基基因因组组中中，5-5-NCRNCR长长322322个个核核苷苷酸酸。该该区区是是HCVHCV基基因因组组中中最最保保守守的的区区域域，在在不不同同病病毒毒分分离离株株间间，最最多
46、多只只有有8%8%的的核核苷苷酸酸发发生生改改变变。核核心心蛋蛋白白基基因因区区(C C区区)的的保保守守性性也也较较高高，仅仅次次于于5-5-NCRNCR；此此外外，非非结结构构基基因因区区部部分分序序列列也也具具有有相相对对保保守守的的序序列列；3-3-NCRNCR是是变变异异性性最最大大的的区区域域，具具有有一一个个polyupolyu片片段段尾尾，此此结结构构为为HCVHCV所所特特有；而包膜蛋白基因区有；而包膜蛋白基因区(E1)E1)的变异性较大。的变异性较大。4 4丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒 丁丁型型肝肝炎炎病病毒毒(HDV)HDV)基基因因组组为为共共价价闭闭合合的的单单股股负负链
47、链RNARNA，全全长长为为16781678个个核核苷苷酸酸，是是已已知知动动物物病病毒毒中中最最短短小小的的。RNARNA中中G G、C C含含量量高高，约约占占60%60%，且且含含有有多多个个集集中中保保守守序序列列。这这种种RNARNA分分子子的的另另一一特特征征是是具具有有次次级级结结构构，像像一一种种双双链链棒棒状状RNARNA，还还有有它它的的二二聚聚体体及及三三聚聚体体，它它们们可可能能是是复复制制的的中中间间体体。利利用用单单链链探探针针证证明明确确实实存存在在基基因因组组全全长长单单体体和和墓墓因因组组二二聚聚体体及及反反义义基基因因组组二二聚体聚体(反义基因组二聚体占优势
48、反义基因组二聚体占优势)。5戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒 戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒(HEV)基因组为单股正链基因组为单股正链RNA，具有具有3个开放阅读框，其中第个开放阅读框，其中第2、第、第3开放阅读开放阅读框中部分序列高度保守。框中部分序列高度保守。(二二)病毒性肝炎的基因诊断病毒性肝炎的基因诊断1 1PCRPCR方法方法(1)(1)引物设计：引物设计：引引物物是是PCRPCR扩扩增增的的关关键键，决决定定着着扩扩增增的的特特异异性性和和敏敏感感度度。一一般般根根据据肝肝炎炎病病毒毒基基因因的的保保守守区区来来设计引物。设计引物。如如HBVHBV的的检检测测可可根根据据其其C C、S S、P
49、P、X X基基因因中中的的高高度度保保守守区区来来设设计计引引物物；检检测测HCVHCV则则通通常常用用5-5-NCRNCR区区设设计计的的引引物物来来扩扩增增，该该区区引引物物的的阳阳性性检检出出率率达达90%90%。HDV HDV RNARNA易易形形成成二二级级结结构构，会会影影响响扩扩增增效效率率，可可用用较较高高温温度度破破坏坏RNARNA的的二二级级结结构构，并并在在一一定定温温度度下下进进行行逆逆转转录录，同同时时，所所应应用用的的PCRPCR引物最好是根据引物最好是根据ORF 5ORF 5区区33端的序列来设计。端的序列来设计。(2)(2)方法选择：方法选择：除除HBVHBV外
50、外，HAVHAV、HCVHCV、HDVHDV、HEVHEV都都是是RNARNA病病毒毒，所所以以采采用用RT-PCRRT-PCR方方法法(即即先先将将RNARNA逆逆转转录录成成cDNAcDNA后后再再作作PCR)PCR)进进行行检检测测；为为提提高高检检测测的的灵灵敏敏度度可可采采用用巢巢式式PCRPCR方方法法。为为定定量量检检测测HCV HCV RNARNA，也也可可采采用用竞竞争争性性PCRPCR和和分分支支DNA(branched DNA(branched DNADNA，bDNAbDNA)检测法。检测法。(3)(3)扩增产物分析：扩增产物分析：常常用用琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳来来