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1、分子生物学分子生物学万万 敏敏13504314715分子生物学教研室分子生物学教研室基础医学院基础医学院2019-09-23分子生物学课程安排分子生物学课程安排基因表达基因表达调控控 原核生物的基因表达原核生物的基因表达调控控 真核生物的基因表达真核生物的基因表达调控控 简介基因表达介基因表达调控的控的将中心法则动起来将中心法则动起来分子间相互作用分子间相互作用操作基因（操作基因（DNA）核酸核酸杂交及交及测序的分子基序的分子基础及原理及原理 分子克隆（基因克隆）分子克隆（基因克隆）转基因及基因敲除基因及基因敲除分子生物学研究分子生物学研究的技术支撑的技术支撑基因基因诊断和基因治断和基因治疗分
2、子生物学技术在疾病分子生物学技术在疾病诊治中的应用诊治中的应用实验课操作操作DNA的感觉的感觉微观世界的研究手段微观世界的研究手段DNADNA重组（重组（DNA recombinationDNA recombination）重组重组DNADNA技术技术（recombinant DNA technologyrecombinant DNA technology）不同不同DNADNA分子经断裂和连接，产生新分子经断裂和连接，产生新DNADNA分子的过程。分子的过程。在体外，将两个或两个以上在体外，将两个或两个以上DNADNA分子重新组合，形成新分子重新组合，形成新DNADNA分子，并在适当细胞中克隆
3、扩增的方法。分子，并在适当细胞中克隆扩增的方法。第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第一节 自然界DNA重组和基因转移 经常发生 遗传多样性 保守性 变异性 流动性第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第一节 自然界DNA重组和基因转移 经常发生 遗传多样性主要方式：同源重组（homologous recombination）位点特异性重组（site-specific recombination）转座重组（transpositional recombination）接合作用（conjugation）转化作用（transformation）转导作用（transduction）第二十一章 DNA
4、重组及重组DNA技术一、同源重组是最基本的DNA重组方式发生在两个相同或相似DNA同源序列之间的单链或双链核苷酸片段互换的过程。1989年 基因打靶技术Martin Evans Mario Capecchi Oliver Smithies 2019年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖基因敲除小鼠模型基因敲除小鼠模型一、同源重组是最基本的DNA重组方式发生在两个相同或相似DNA同源序列之间的单链或双链核苷酸片段互换的过程。同源重组缺陷与人类癌症高度相关。缺少抑癌基因BRCA1和BRCA2，同源重组率减少，增加患乳腺癌和卵巢癌的易感性。一、同源重组是最基本的DNA重组方式二、位点特异性重组发生在特异位点由整合
5、酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。二、位点特异性重组（一）噬菌体的DNA整合：插入片段-噬菌体DNAE.coli 染色体DNAatt Bgal+bio+att Pcoscosatt Lgal+att Rbio+-噬菌体DNA整合到宿主染色体中溶源噬菌体（二）细菌的位点特异性重组：倒转片段 H片段PPhinhixhixH2rH1Hin倒转酶H2鞭毛蛋白H1阻遏蛋白hixH2rH1PPPhinhixhixH2rH1H片段Hin倒转酶H1H1鞭毛蛋白位点之间H片段发生倒转重组位点靠近（三）免疫球蛋白基因的重排：删除片段 CV1V2V3V4V5D1 D2 D3 D4J1 J2 J3 J4
6、D1D2D3D4RSSRSS放大D片段区D1D2D3D4RSSRSS位于D3片段两侧的RSS位点靠近D1D2D4RSS切除不需要的D3片段切除不需要的V片段和D片段V1V2D2CJ4V5D1V3V4CV D JV和DJ外显子重组VDJ重组三、转座重组可使基因移位（一）插入序列转座（二）转座子转座基因组中可移动的DNA序列：插入序列（insertion sequences，IS）转座子（transposon，Tn）转座重组（transpositional recombination）：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排也称转座（transposition）（一）插入序列转座插入序列：长度：7
7、501500 bp两端：941 bp的反向重复序列（inverted repeat，IR）外侧：412 bp的正向重复序列（direct repeat,DR）中间：转座酶（transposase）编码基因转座酶基因9-41bp9-41bpIRIRDRDR4-12bp4-12bp转座酶靶点4-12bpTAGC保守型转座：复制型转座：复制TAGC复本DRTAGCTAGCIRDRTAGCTAGCIR保守性转座（conservative transposition）复制性转座（duplicative transposition）（一）插入序列转座（二）转座子转座转座子：与插入序列结构相似除转座酶编码基
8、因外，一般还有其他编码基因小结第一节 自然界DNA重组：同源重组（同源序列之间的交换）位点特异性重组（诱导插入、倒转或删除）转座重组（可移动DNA元件）moleculeCell colonyorganismDNA clone克隆：通过无性繁殖产生的子代群体。这个子代群体与亲代完全相同。第二节 重组DNA技术 又称分子克隆或DNA克隆技术或基因工程技术。第二十一章 DNA重组及重组DNA技术 在体外将目的DNA与载体连接，形成重组DNA分子，然后再转入细胞，进行复制和扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第二节 重组DNA技术 Gene TherapyGe
9、ne analysisGene modificationMedicineVaccineTransgenegene knockoutExpression基因工程：克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备，以及定向改造基因结构。第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第二节 重组DNA技术Paul Berg保罗保罗伯格伯格1980年，年，诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖1972年，第一个重组DNA分子诞生猿猴病毒猿猴病毒DNA片段片段噬菌体噬菌体DNA片段片段Ligation 重组重组DNA分子分子第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第二节 重组DNA技术关键因素：发现了能特异性切割DNA的酶限
10、制性核酸内切酶Werner ArberHamilton O.SmithDaniel Nathans 第二节 重组DNA技术1973年，Cohen和Boyer第一次完整地建立了DNA重组技术又称基因克隆技术或基因工程技术Stanley Cohen(Stanford)Herbert Boyer(UCSF)Paul Berga biochemistry at Stanford1980年，年，获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1972年，诞生了世界上第一个重组DNA分子 l限制性核酸内切酶 Restriction endonuclease lDNA连接酶 Ligasel碱性磷酸酶 Alkaline phos
11、phatasel反转录酶 Reverse transcriptasel末端转移酶 Terminal transferaselDNA聚合酶 DNA polymerase lDNA聚合酶I大片段 Klenow fragmentlTaq DNA聚合酶 Taq DNA polymerasel多核苷酸激酶 一、重组DNA技术中常用的工具酶 Werner ArberHamilton O.SmithDaniel Nathans 1970年，年，第一个限制性内切酶第一个限制性内切酶定点剪切定点剪切DNA操作操作DNADNA重组技术重组技术1978年，年，获诺贝尔奖获诺贝尔奖分子生物学的核心技术分子生物学的核心
12、技术亚伯史密斯纳森斯亚伯史密斯纳森斯一、重组DNA技术中常用的工具酶（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam Hl生理作用：生理作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA，犹似高等动物的免疫系统。，犹似高等动物的免疫系统。l 核酸水解酶，绝大多数来自细菌。核酸水解酶，绝大多数来自细菌。l分类：分类：根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为酶活性，可分为、型三大类。
13、型三大类。（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA主要特性主要特性 I 型型 II 型型 III 型型限制修饰限制修饰蛋白结构蛋白结构辅助因子辅助因子识别序列识别序列切割位点切割位点多功能多功能异源三聚体异源三聚体ATP Mg2+SAMTGAN8TGCT AACN6GTGC距识别序列距识别序列1kb处处随机性切割随机性切割单功能单功能同源二聚体同源二聚体Mg2+旋转对称序列识别序列内或附近识别序列内或附近特异性切割双功能双功能异源二聚体异源二聚体ATP Mg2+SAMGAGCCCAGCAG距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处1、重组、重组DNA技术中通常使用
14、技术中通常使用型限制酶型限制酶第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶 限制性内切酶的命名：限制性内切酶的命名：1、重组、重组DNA技术中通常使用技术中通常使用型限制酶型限制酶
15、 （1）具有特定的识别和切割位点）具有特定的识别和切割位点 限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点限制性内切酶限制性内切酶识别位点识别位点Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGCCGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II型限制性内切酶的识别位点举例（型限制性内切酶的识别位点举例（示切割位点）示切割位点）识别位点通常为识别位点通常为6或或4碱基序列碱基序列（一）限
16、制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性 （2）识别的核苷酸序列通常为回文结构（）识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）两条核苷酸链中，从两条核苷酸链中，从5到到3方向的核苷酸序列完全一致方向的核苷酸序列完全一致2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNAgccgggcgcg gtggcgcgtg cctgtagtcc cAGCTactcg ggatgctgag gctggaggat cgcttgagtc
17、 caggagttct gggctgtagt gcgctatgcc gatcgggtgt ccgcactaag ttcggcatca atatggtgac ctcccgggag cgggggacca ccaggttgcc taaggagggg tgaattcgcc caggtcggaa acggagcagg tcaaaactcc cgtgctgatc agtagtggga tcgcgcctgt gaatagccac tgcactccag cctgggcaac atagcgagac cccgtctct5-3 （2）识别的核苷酸序列通常为回文结构（）识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindro
18、me）两条核苷酸链中，从两条核苷酸链中，从5到到3方向的核苷酸序列完全一致方向的核苷酸序列完全一致EcoRI2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA 553 3 3 3 552、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA（2）识别的核苷酸序列通常为回文结构（）识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）（3）切割双链）切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端2、型限制性内切酶具有一些共性和特
19、性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。黏性末端。EcoR IEcoR I的酶切的酶切的酶切的酶切2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA（3）切割双链）切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端 粘性末端
20、又可分为两种：粘性末端又可分为两种：1 1）5 5-端突出：端突出：2 2）3 3-端突出：端突出：CTGCAOH GG HOACGTC5 3 5 3-5 5-PstICTGCA G C ACGTC5 5 3 3 GOH AATTC.CTTAA HOG5 3-5 5-5 3 EcoRIGAATTC CTTAAG5 3 5 3 平末端平末端平末端平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。SmaI SmaI 限制酶的酶切限制酶的酶切2、型限制性内
21、切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA（3）切割双链）切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端 （4）不同的酶可以产生同样的末端）不同的酶可以产生同样的末端 同尾酶（同尾酶（isocaudarner）：）：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。Bam Bam H
22、 HBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA （5）不同的酶可以识别同一个序列）不同的酶可以识别同一个序列 同识异切酶（同识异切酶（isoschizomer）或同裂酶）或同裂酶能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGG
23、GCCTAGGATCC G+BstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG G+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma为为DNA操作增加了酶的可选余地操作增加了酶的可选余地2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA（6）切割会受其他因素的影响）切割会受其他因素的影响l碱基甲基化碱基甲基化l 缓冲液或环境温度缓冲液或环境温度2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA l碱基甲基化碱基甲
24、基化l 缓冲液或环境温度缓冲液或环境温度例如：例如：EcoR I在正常情况下识别在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓序列，但在甘油浓度大于度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，这种现象称为，这种现象称为星号活性星号活性（star activity），以），以EcoR I*表示。表示。2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA（6）切割会受其他因素的影响）切割会受其他因素的影响（6
25、）切割会受其他因素的影响）切割会受其他因素的影响（5）不同的酶可以识别同一个序列）不同的酶可以识别同一个序列（4）不同的酶可以产生同样的末端）不同的酶可以产生同样的末端（3）切割双链）切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生黏端或平端（2）识别的核苷酸序列通常为回文结构）识别的核苷酸序列通常为回文结构 （1）具有特定的识别和切割位点）具有特定的识别和切割位点 2、型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA （二）（二）DNA连接酶连接酶用于催化用于催化DNA片段连接片段连接（一）限制性核酸内切酶（一）限
26、制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA （二）（二）DNA连接酶连接酶用于催化用于催化DNA片段连接片段连接DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的）：催化两个相邻的3-OH和和5-磷酸基团形成磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，从磷酸二酯键，从而使而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。片段或单链断裂形成的缺口连接起来。lT4噬菌体噬菌体DNA编码、通过感染大肠杆菌而产生的编码、通过感染大肠杆菌而产生的T4 DNA连接酶；连接酶；l大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体DNA编码的编码的DNA连接酶连接酶 geneligationPlasmid（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内
27、切酶用于切割用于切割DNA两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来（二）（二）DNA连接酶连接酶用于催化用于催化DNA片段连接片段连接（二）（二）DNA连接酶连接酶用于催化用于催化DNA片段连接片段连接PvuII （三）碱性磷酸酶（三）碱性磷酸酶去除核酸分子末端的磷酸基团去除核酸分子末端的磷酸基团 用于脱去用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使末端的磷酸基团，使5-P成为成为5-OH，该过程称核酸分子的该过程称核酸分子的脱磷酸作用脱磷酸作用。l来自于大肠杆菌（来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）
28、l来自于小牛肠（来自于小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）防止载体自身连接防止载体自身连接 （四）（四）DNA聚合酶聚合酶I合成合成DNA 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中）是基因工程中常用的常用的DNA聚合酶。聚合酶。l 53 DNA 聚合酶活性：需要引物聚合酶活性：需要引物l 35 外切酶活性外切酶活性 校对功能校对功能l 53 外切酶活性外切酶活性 可用于可用于DNA探针的缺口平移法标记探针的缺口平移法标记（nick translation）DNA pol I3-5方向切除不配对的碱
29、基，重新合成DNA.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中）是基因工程中常用的常用的DNA聚合酶。聚合酶。l 35 外切酶活性外切酶活性 校对功能校对功能（四）（四）DNA聚合酶聚合酶I合成合成DNA53353535DNase DNA 合成时参入标记的单核苷酸DNA 边降解边合成核酸标记功能核酸标记功能 (缺口平移法）缺口平移法）DNA pol I32P-dCTPCC 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中）是基因工程中常用的常用的DNA聚合酶。聚合酶。l 53 外切酶活性外切酶活性（四）（四）DNA聚
30、合酶聚合酶I合成合成DNA大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I蛋白酶（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段保留了有用的酶活性保留了有用的酶活性 枯草杆菌蛋白酶裂解枯草杆菌蛋白酶裂解DNA聚合酶聚合酶I后产生的大片段，也后产生的大片段，也称为称为Klenow片段（片段（Klenow fragment）主要用途：主要用途：补齐双链补齐双链DNA的的3末端，使其转变成平端；或通过补齐末端，使其转变成平端；或通过补齐3端端而使而使3末端标记；末端标记；在在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；克隆中，用于第二股链的合成；用于用于DNA序列分析。序列分析。枯草杆菌蛋白酶裂解枯草杆菌蛋白酶裂解DNA聚
31、合酶聚合酶I后产生的大片段，也后产生的大片段，也称为称为Klenow片段（片段（Klenow fragment）l 53 DNA 聚合酶活性：合成聚合酶活性：合成DNAl 35 外切酶活性：保证外切酶活性：保证DNA复制的准确性复制的准确性（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段保留了有用的酶活性保留了有用的酶活性 枯草杆菌蛋白酶裂解枯草杆菌蛋白酶裂解DNA聚合酶聚合酶I后产生的大片段，也后产生的大片段，也称为称为Klenow片段（片段（Klenow fragment）（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段保留了有用的酶活性保留了有用的酶活性 （六）反转录酶（六）反转录酶以以RNA为
32、模板合成为模板合成cDNA反转录酶反转录酶（reverse transcriptase）反转录酶催化的反转录酶催化的cDNA合成合成RNARNA53AAAAAAAAAAAATTTTTT53cDNAcDNA随机引物随机引物Oligo-dTl禽类成骨细胞性白血病病毒（禽类成骨细胞性白血病病毒（AMV）反转录酶）反转录酶lMoloney小鼠白血病病毒（小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶）反转录酶 （七）（七）末端转移酶末端转移酶给给DNA末端加尾以构成黏端末端加尾以构成黏端 不需要模板不需要模板 （八）（八）Taq DNA聚合酶聚合酶用于用于PCRl 53 DNA 聚合酶活性聚合酶活性l 53 外切
33、酶活性外切酶活性 从水生栖热菌（从水生栖热菌（ThermusaquaticusThermusaquaticus）中提取的耐）中提取的耐热热DNADNA聚合酶，简称聚合酶，简称Taq DNATaq DNA聚合酶。良好的聚合活性、聚合酶。良好的聚合活性、热稳定性（热稳定性（7272活性最高）。活性最高）。l 35 外切酶活性：无！无校正功能！外切酶活性：无！无校正功能！l末端转移酶活性：在所合成末端转移酶活性：在所合成DNA链的链的3末端加上一个单末端加上一个单独的腺苷酸残基（独的腺苷酸残基（A）。）。从水生栖热菌（从水生栖热菌（ThermusaquaticusThermusaquaticus）中
34、提取的耐）中提取的耐热热DNADNA聚合酶，简称聚合酶，简称Taq DNATaq DNA聚合酶。良好的聚合活性、聚合酶。良好的聚合活性、热稳定性。热稳定性。l末端转移酶活性：在所合成末端转移酶活性：在所合成DNA链的链的3末端加上一个单末端加上一个单独的腺苷酸残基（独的腺苷酸残基（A）。）。（八）（八）Taq DNA聚合酶聚合酶用于用于PCR （九）（九）多核苷酸激酶多核苷酸激酶5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化主要用途：主要用途：DNA或或RNA的的5 末端标记；末端标记；使没有使没有5-末端磷酸的末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供连接和克隆。片段磷酸化，以供连接和克隆。l 5 多核苷酸激酶多核苷
35、酸激酶常用的是常用的是T4多核苷酸激酶（多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase），），能催化能催化ATP的的-位磷酸向位磷酸向DNA和和RNA的的5-羟基转移羟基转移themegallery 一、重组DNA技术中常用的工具酶（一）（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶用于切割用于切割DNA（二）（二）DNA连接酶连接酶用于催化用于催化DNA片段连接片段连接（三）（三）碱性磷酸酶碱性磷酸酶去除核酸分子末端的磷酸基团去除核酸分子末端的磷酸基团（四）（四）反转录酶反转录酶以以RNA为模板合成为模板合成cDNA（五）（五）末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶给给DNA末端加
36、尾以构成黏端末端加尾以构成黏端（六）（六）DNA聚合酶聚合酶I合成合成DNA（七）（七）DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段保留了保留了DNA聚合酶聚合酶I的部分酶活性的部分酶活性（八）（八）Taq DNA聚合酶聚合酶用于用于PCR（九）（九）多核苷酸激酶多核苷酸激酶使寡核苷酸链使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第二节 重组DNA技术 在体外将目的DNA与载体连接，形成重组DNA分子，然后再转入细胞，进行复制和扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第二节 重组DNA技术载体：可携带外源载体：可携带外源DNADNA
37、片段（目的基因），转移至受体片段（目的基因），转移至受体细胞的一种能自我复制的细胞的一种能自我复制的DNADNA分子。分子。1.1.按功能按功能克隆载体克隆载体表达载体表达载体2.2.按来源按来源质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体黏粒载体黏粒载体病毒载体病毒载体人工染色体载体等人工染色体载体等载体分类：载体分类：二、重组DNA技术中常用的载体第二十一章 DNA重组及重组DNA技术第二节 重组DNA技术1 1、克隆载体应具备的主要特点、克隆载体应具备的主要特点（1 1）至少有一个复制起点（）至少有一个复制起点（oriori）（2 2）至少有一个选择性标志）至少有一个选择性标志（3 3）有）有单
38、一酶切位点单一酶切位点 多克隆位点（多克隆位点（MCSMCS）（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆二、重组DNA技术中常用的载体MCSSelective marker1 1、克隆载体应具备的主要特点、克隆载体应具备的主要特点（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆themegallery MCSOrigin:to allow vector autonomously replicate independent of hosts genome.Selective marker1 1、克隆载体应具备的主要特点、克隆载体应具备的主要特点（一）
39、（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆themegalleryMCSSelective marker:to allow select cells containing vectors or recombinant DNA.Selective marker1 1、克隆载体应具备的主要特点、克隆载体应具备的主要特点（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆themegalleryMCSMultiple cloning site(MCS):To allow foreign gene inserted Selective marker1 1、克隆载体应
40、具备的主要特点、克隆载体应具备的主要特点（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（1 1）质粒）质粒(plasmid)(plasmid)：最常用的克隆载体：最常用的克隆载体l广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中l独立于宿主细胞染色体外，环状双链独立于宿主细胞染色体外，环状双链DNA(DNA(1 1200 kb)200 kb)l能在宿主细胞能在宿主细胞内独立自主复制内独立自主复制l质粒的不相容性质粒的不相容性在同一个细胞中，同类质粒不能在同一个细胞中，同类质粒不能并存的现象。并存的现象。（一）（一）克隆
41、载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆l质粒的不相容性质粒的不相容性有相同复制起始有相同复制起始区的不同质粒，区的不同质粒，不能稳定共存于不能稳定共存于同一宿主细胞。同一宿主细胞。（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（1 1）质粒）质粒(plasmid)(plasmid)：最常用的克隆载体：最常用的克隆载体pBR322pBR322质粒载体：质粒载体：A A、含有一个复制原点、含有一个复制原点orioriB B、5 5种常用内切酶的单一种常用内切酶的单一切点切点C C、两个筛选标志抗四环、两个筛选标志抗四环素基因素基
42、因(tet)(tet)和抗氨苄青和抗氨苄青霉素基因霉素基因(amp)(amp)。（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（1 1）质粒）质粒(plasmid)(plasmid)：最常用的克隆载体：最常用的克隆载体 pUC18/19 pUC18/19质粒载体：质粒载体：A A、pBR322pBR322的复制起点的复制起点(ori)(ori)B B、AmpAmp基因，但基因，但DNADNA序列发生序列发生变化，不再含原来限制性核变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点酸内切识别位点 C C、lacZlacZ基因基因替换替换TcTcr r基
43、因基因D D、在在lacZlacZ基因内部有一段基因内部有一段MCSMCS（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（1 1）质粒）质粒(plasmid)(plasmid)：最常用的克隆载体：最常用的克隆载体 TA TA克隆载体克隆载体A A、PCRPCR产物在产物在TaqTaq酶的非模板酶的非模板依赖活性作用下，于依赖活性作用下，于33端端加一非配对的加一非配对的A A。B B、故可研制一种线性载体，、故可研制一种线性载体，其其55端各带一不配对端各带一不配对T T，可，可直接与直接与PCRPCR产物以产物以TATA连接进连接进行克
44、隆，即行克隆，即TATA克隆。克隆。（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（1 1）质粒）质粒(plasmid)(plasmid)：最常用的克隆载体：最常用的克隆载体themegalleryAAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体目的基因TATA（2 2）噬菌体噬菌体克隆载体克隆载体DNA(48.5kb)DNA(48.5kb)噬菌体中：线性噬菌体中：线性宿主细胞：环状宿主细胞：环状(cos(cos位点位点)（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体 coscos1
45、2bp12bp48500bpNonessential portionfor replicationLong(left)armShort(right)arm 非必需片段位于非必需片段位于DNADNA的中部，删除后并不影响的中部，删除后并不影响噬菌体侵染大肠杆菌的能力。噬菌体侵染大肠杆菌的能力。噬菌体进行病毒包装时，要求噬菌体进行病毒包装时，要求 DNADNA长度是野长度是野生型基因组的生型基因组的75%75%105%105%。（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（2 2）噬菌体噬菌体克隆载体克隆载体 cos cos位点位点:两端各
46、有一条由两端各有一条由1212个碱基组成，彼此完全互补个碱基组成，彼此完全互补且且55突出的序列突出的序列 插入型：插入型：gtgt系列，可插入系列，可插入7Kb,7Kb,适用于适用于cDNAcDNA克隆克隆 置换型：置换型：EMBLEMBL系列，可插入系列，可插入20Kb20Kb，适用于基因组，适用于基因组DNADNA克隆克隆coscos12bp12bp48500bpNonessential portionfor replicationLong(left)armShort(right)arm（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体
47、（2 2）噬菌体噬菌体克隆载体克隆载体黏粒（黏粒（cosmidcosmid）：）：由由DNADNA的的coscos区与整区与整个个pBR322pBR322质粒重新构质粒重新构建而成的双链环状建而成的双链环状DNADNA载体。载体。（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（3 3）其他）其他克隆载体：增加载体容量克隆载体：增加载体容量 细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACBAC）：基于）：基于F F质粒构建而成。能质粒构建而成。能容纳高达容纳高达400 kb400 kb的外源的外源DNADNA。基于大肠杆菌基于大肠杆菌P1P1噬菌体
48、的载体（噬菌体的载体（PACPAC）：与）：与BACBAC的克的克隆容量相当。隆容量相当。酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）载体：能携带更大的）载体：能携带更大的DNADNA片片段，容量可高达段，容量可高达3 Mb3 Mb。利用重组线性。利用重组线性DNADNA转化细胞，转化细胞，可建成包含人全部基因组可建成包含人全部基因组DNADNA的巨型的巨型YACYAC文库。文库。（一）（一）克隆载体用于外源克隆载体用于外源DNADNA的克隆的克隆2 2、常用克隆载体、常用克隆载体（3 3）其他）其他克隆载体：增加载体容量克隆载体：增加载体容量（二）表达（二）表达载体用于外源载体用于外源DN
49、ADNA的的表达表达 筛选标记筛选标记筛选标记筛选标记OriOri多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点启动子启动子(P)表达表达 质粒质粒具有基因表达所必需的元件具有基因表达所必需的元件转录终止子转录终止子转录终止子转录终止子(TT)(TT)Exon 1Exon 2Exon 3Exon 4Intron 1Intron 2Intron 3ATG5-非翻译区3-非翻译区TGA上游增强子下游增强子启动子终止子结构基因结构基因调控序列调控序列前导区前导区终止区终止区5.AAGUGUAAGU.CURAY.(10-40).(U/C)11NCAGAGG.3 内含子内含子 外显子 外显子5-剪接位点3-剪
50、接位点分叉点序列Polypyrimidine tract（二）表达（二）表达载体用于外源载体用于外源DNADNA的的表达表达 概念：在宿主细胞中表达外源基因的载体。概念：在宿主细胞中表达外源基因的载体。基本特性：基本特性：克隆必需元件：复制子克隆必需元件：复制子;多克隆酶切位点多克隆酶切位点;选择性标志选择性标志 转录必需元件：启动子和终止子转录必需元件：启动子和终止子 翻译必需元件：核糖体结合位点，翻译必需元件：核糖体结合位点，分类：原核表达载体分类：原核表达载体 真核表达载体真核表达载体ori 启动子启动子MCS终止子终止子表达载体表达载体转录单位转录单位ampRSD（二）表达（二）表达载