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1、医学微生物学医学微生物学医学微生物学医学微生物学（细菌感染的实验室诊断及消毒灭菌细菌感染的实验室诊断及消毒灭菌细菌感染的实验室诊断及消毒灭菌细菌感染的实验室诊断及消毒灭菌）严杰，教授医学博士严杰，教授医学博士Department of Medical Microbiology and ParasitologyZhejiang University School of MedicineHangzhou,P.R.China标本的采集与送检：标本的采集与送检：（1）采集标本应注意）采集标本应注意无菌操作无菌操作，尽量避免杂菌污染。，尽量避免杂菌污染。（2）根据患者病程、细菌在体内分布及从人体排出途径
2、的不同，采集相）根据患者病程、细菌在体内分布及从人体排出途径的不同，采集相应的标本。一般情况下，应在病变最明显部位采集标本。应的标本。一般情况下，应在病变最明显部位采集标本。（3）使用抗生素之前采集标本，否则应在分离培养时加入药物拮抗剂。）使用抗生素之前采集标本，否则应在分离培养时加入药物拮抗剂。采集标本时不可用消毒剂，必要时可用生理盐水冲洗，擦干后取材。采集标本时不可用消毒剂，必要时可用生理盐水冲洗，擦干后取材。（4）标本必须新鲜，采集后及早送检。在送检过程中，除少数不耐寒的标本必须新鲜，采集后及早送检。在送检过程中，除少数不耐寒的脑膜炎球菌等细菌需保温外，多数菌的标本均需冷藏送运。脑膜炎球
3、菌等细菌需保温外，多数菌的标本均需冷藏送运。（5）检测特异性抗体时尽量采取急性期与恢复期）检测特异性抗体时尽量采取急性期与恢复期双份血清双份血清。第一份尽可。第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后能在发病后立即采取，第二份在发病后23周采取。血清标本放周采取。血清标本放4或或-20保存，试验前血清标本保存，试验前血清标本56处理处理30分钟以灭活补体。分钟以灭活补体。细菌感染的实验室诊断细菌感染的实验室诊断标本染料、荧光染色后标本染料、荧光染色后直接显微镜检查直接显微镜检查。细菌的分离培养与鉴定：细菌的分离培养与鉴定：菌落菌落(colony)：采用分离划线接种法将细菌临床标本采用分离划线
4、接种法将细菌临床标本接种于固体培养基上，经过培养后出现肉眼可见、单个细接种于固体培养基上，经过培养后出现肉眼可见、单个细菌分裂繁殖形成的细菌集落菌分裂繁殖形成的细菌集落(纯种细菌纯种细菌)。不同细菌大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光不同细菌大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐或不整齐、溶血情况等滑或粗糙、湿润或干燥、边缘整齐或不整齐、溶血情况等均可能有所不同，均可能有所不同，有助于鉴定细菌有助于鉴定细菌。染色镜检、染色镜检、生化试验、血清学试验生化试验、血清学试验(已知抗体已知抗体测抗原测抗原)药物敏感试验：药物敏感试验：选择敏感抗生素。选择敏感抗生素。细菌
5、标本常规病原学检查细菌标本常规病原学检查多聚酶链反应多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)：提取细：提取细菌临床标本总菌临床标本总DNA或或RNA，采用，采用16 S RNA编码基因或其编码基因或其他靶基因特异性引物对进行他靶基因特异性引物对进行PCR或或RT-PCR扩增，反应产扩增，反应产物用溴乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳观察，目前多采用封闭物用溴乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳观察，目前多采用封闭式实时荧光定量式实时荧光定量PCR或或RT-PCR检测。检测。PCR优点与缺点：优点与缺点：优点是快速、敏感、特异，缺点是不能优点是快速、敏感、特异，缺点是不能获得活菌。获
6、得活菌。细菌标本分子生物学检查：细菌标本分子生物学检查：PCR/RT-PCR血清学检查血清学检查(serological examination)：病原菌侵入人体可病原菌侵入人体可刺激机体免疫系统产生特异性血清抗体，抗体水平可随细刺激机体免疫系统产生特异性血清抗体，抗体水平可随细菌感染过程逐渐升高价升高。用已知的抗原检测病人体液菌感染过程逐渐升高价升高。用已知的抗原检测病人体液（主要为血清）中有无相应抗体及其效价的动态变化，可（主要为血清）中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为某些感染性疾病的诊断或辅助诊断。作为某些感染性疾病的诊断或辅助诊断。多数血清学诊断通常采取患者双份血清，一份在疾病的
7、急多数血清学诊断通常采取患者双份血清，一份在疾病的急性期，另一份在恢复期（一般为性期，另一份在恢复期（一般为26周后），当第二份抗周后），当第二份抗体效价较第一份体效价较第一份升高升高4倍及以上倍及以上才有诊断价值。才有诊断价值。单份血清单份血清检查结果根据该病检查结果根据该病效价判断标准效价判断标准进行判定。进行判定。IgM出现早、消失快，可用于血清学早期诊断。出现早、消失快，可用于血清学早期诊断。方法：方法：ELISA、直接或间接凝集试验、中和试验等。、直接或间接凝集试验、中和试验等。血清学检查或诊断血清学检查或诊断人工主动免疫：人工主动免疫：接种疫苗，是预防传染病常用方法，免疫接种疫苗，
8、是预防传染病常用方法，免疫力出现慢但维持时间长力出现慢但维持时间长。疫苗种类：疫苗种类：目前使用的有全菌死疫苗、减毒活疫苗目前使用的有全菌死疫苗、减毒活疫苗、基因、基因工程疫苗、类毒素疫苗。工程疫苗、类毒素疫苗。人工被动免疫：人工被动免疫：主要是抗毒素主要是抗毒素(外毒素中和抗体外毒素中和抗体)。免疫力。免疫力出现快但维持时间短。抗毒素是动物血清，使用前做皮试出现快但维持时间短。抗毒素是动物血清，使用前做皮试防止发生过敏反应。防止发生过敏反应。抗生素治疗：抗生素治疗：青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、喹诺青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类。酮类、四环素类。细菌对抗生素可产生耐
9、药性，临床使用细菌对抗生素可产生耐药性，临床使用抗生素时应遵守如下原则：抗生素时应遵守如下原则：选择敏感抗生素；选择敏感抗生素；剂量合剂量合适；适；长期使用时交替用药；长期使用时交替用药；联合用药。联合用药。细菌感染的防治原则细菌感染的防治原则灭菌灭菌(sterilization)：杀灭所有微生物的方法，包括病原微：杀灭所有微生物的方法，包括病原微生物、非病原微生物及芽胞。生物、非病原微生物及芽胞。消毒消毒(disinfection)：杀灭病原微生物的方法，但不一定能：杀灭病原微生物的方法，但不一定能杀死非病原微生物，一般不能杀灭芽胞。消毒剂。杀死非病原微生物，一般不能杀灭芽胞。消毒剂。抑菌抑
10、菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌生长繁殖的方：抑制体内或体外细菌生长繁殖的方法。如抗生素。法。如抗生素。防腐防腐(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法，：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。防腐剂。细菌一般不死亡。防腐剂。无菌无菌(asepsis)：不存在活的微生物。：不存在活的微生物。无菌操作：无菌操作：防止微生物进入人体或物品的操作技术。防止微生物进入人体或物品的操作技术。消毒与灭菌消毒与灭菌干烤干烤：用干烤箱：用干烤箱160加热加热2 h可达到灭菌效果，适用于耐可达到灭菌效果，适用于耐高温的玻璃器皿等物品。高温的玻璃器皿等物品。高压
11、蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：使用高压蒸汽灭菌器使用高压蒸汽灭菌器121加热加热1520 min可达到灭菌效果。可达到灭菌效果。煮沸法：煮沸法：细菌繁殖体在沸水中细菌繁殖体在沸水中5 min可被杀死。可被杀死。巴氏消毒法：巴氏消毒法：61.1-62.8加热加热30 min和和72加热加热15 s，目，目前主要用于酒类、疫苗的消毒。前主要用于酒类、疫苗的消毒。常用消毒与灭菌法常用消毒与灭菌法紫外线消毒法：紫外线消毒法：以以265266 nm紫外线能使紫外线能使DNA一条链中一条链中相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体，干扰了相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体，干扰了DNA复制与转录复制与转录而导致细菌死亡。而导
12、致细菌死亡。紫外线穿透力弱，仅用于空气和物体表面消毒。紫外线穿透力弱，仅用于空气和物体表面消毒。常用消毒与灭菌法常用消毒与灭菌法电离辐射电离辐射：常用常用60Co对一次性医用塑料制品进行灭菌，对一次性医用塑料制品进行灭菌，也可用于食品、药品和生物制品的灭菌（工业用）。也可用于食品、药品和生物制品的灭菌（工业用）。滤过除菌法滤过除菌法：0.22 m孔径孔径滤器可除去细菌，滤器可除去细菌，0.10 m孔径孔径可除去支原体。可除去支原体。低温抑菌法：低温抑菌法：抑菌不杀菌。抑菌不杀菌。真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法：细菌悬液冻结，负压使水分升华后干燥，细菌悬液冻结，负压使水分升华后干燥，可长期保存菌种
13、。可长期保存菌种。化学消毒剂：化学消毒剂：75%乙醇乙醇，其他浓度高、时间长、效果好。，其他浓度高、时间长、效果好。常用消毒与灭菌法常用消毒与灭菌法生物安全：病原微生物危害等级标准及其适用实验室生物安全：病原微生物危害等级标准及其适用实验室 分类病原微生物实验室生物安全管理条例分级实验室生物安全通用要求（GB19489-2004）适用实验室四类在一般情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。级不会导致人类致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子（低个体危害，低群体危害）BSL-1/P1三类能够引起人类或动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重
14、疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。级能引起人或动物发病，但一般情况下对人、动物和环境不会引起严重危害或导致严重疾病，并且传播风险有限的病原微生物（中等个体危害，有限群体危害），具备有效药物，部分种类有疫苗。如肠道杆菌和肠道病毒等。BSL-2/P2二类能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。级能引起人类或动物严重疾病，但通常不能因偶然接触而在个体间传播的病原微生物（高个体危害，低群体危害），有药物进行有效治疗、多数种类有疫苗。如结核分枝杆菌、炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、布氏菌、霍乱弧菌、问号钩端螺旋体、立克次体、HIV、SARS-Co
15、V、HBV等。BSL-3/P3一类能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。级能引起人类或动物严重疾病，一般无有效药物和疫苗，容易直接或间接或因偶然接触在人与人、人与动物、动物与动物之间传播的病原微生物（高个体危害，高群体危害）。如天花病毒、Ebola病毒、黄病毒、马尔堡病毒等。BSL-4/P4细菌感染临床标本的采集与送检注意事项。细菌感染临床标本的采集与送检注意事项。血清学检查或诊断原理及双份血清检测结果判断标准血清学检查或诊断原理及双份血清检测结果判断标准。人工主动免疫和被动免疫差异及其主要生物制品。人工主动免疫和被动免疫差异及其主要生物制品。菌落、灭菌、消毒、无菌操作概念。菌落、灭菌、消毒、无菌操作概念。干烤和高压蒸汽灭菌法达到灭菌效果的温度与时间。干烤和高压蒸汽灭菌法达到灭菌效果的温度与时间。紫外线消毒原理及其使用范围。紫外线消毒原理及其使用范围。本章要点本章要点Thank you!