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1、肿瘤干细胞高全立高全立河南省肿瘤医院生物治疗科河南省肿瘤医院生物治疗科干干 细细 胞胞 生生 物物 学学 特特 性性干细胞有自我复制更新能力：通常情况下只有干细胞具有分裂产生子代干细胞的能力干细胞有定向分化为功能细胞能力已经定向分化的细胞一般情况下不能逆转化为干细胞干细胞分类干细胞分类根据来源分类根据来源分类 胚胎干细胞 成体干细胞根据分化潜能分类：根据分化潜能分类：全能干细胞 多能干细胞 单能干细胞胚胎干细胞培育过程胚胎干细胞培育过程干细胞的再编程干细胞的再编程核移植 如克隆羊多莉细胞融合基因转染：iPS OCT4,SOX2,KLF4,c-MYC 小分子化合物诱导：多能干细胞多向分化图多能干
2、细胞多向分化图 横向分化横向分化 亚全能干细胞？亚全能干细胞？肿瘤的异质性肿瘤的异质性肿瘤干细胞肿瘤干细胞Reya,T.,et al.Nature.2001.414.105-111肿瘤干细胞的起源肿瘤干细胞的起源由正常干细胞经多基因多步骤突变累积而来由骨髓来源的干细胞与基因发生改变的组织细胞融合而来由基因发生改变已分化的细胞逆转化而来Cancer stem cells should be the therapy targetReya,T.,et al.Nature.2001.414.105-111肿瘤干细胞的特性肿瘤干细胞的特性维持肿瘤生长的基础具有自我更新和多向分化的能力肿瘤组织中含量极低对
3、常用的治疗方法耐药：如化疗、放疗、分子靶向治疗。免疫治疗如何？ABCABC转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用ABC转运子示意图(通过水解ATP将多种化疗药物泵出细胞外）肿瘤干细胞的可变性肿瘤干细胞的可变性易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维细胞的特性细胞的特性非肿瘤干细胞可通过非肿瘤干细胞可通过EMTEMT转变为肿瘤干细胞转变为肿瘤干细胞EMT-表皮细胞向间质细胞转化MET-间质细胞向表皮细胞转化肿瘤干细胞的间质细胞学特性肿瘤干细胞的间质细胞学特性EMT（表皮细胞向间质细胞转化）是肿瘤侵袭和转移的主要机制之一，肿瘤干细胞
4、易于侵袭和转移。多个实验证实肿瘤干细胞具有间质细胞的生物学特性。乳腺上皮细胞系通过EMT可产生乳腺癌干细胞。肿瘤干细胞的表面分子标记肿瘤干细胞的表面分子标记CD44：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，大肠癌大肠癌 CD133：脑胶质瘤，大肠癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，恶性黑色素瘤，卵：脑胶质瘤，大肠癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，恶性黑色素瘤，卵 巢癌巢癌CD90：肝癌，肺癌：肝癌，肺癌CD24：胰腺癌阳性，乳腺癌阴性：胰腺癌阳性，乳腺癌阴性CD117：卵巢癌：卵巢癌CD278：恶性黑色素瘤：恶性黑色素瘤肿瘤干细胞表面标记与预后CD4
5、4：头颈部鳞癌的预后不良标记。乳腺癌中12个研究中的898例meta分析，CD44为预后不良的标记。大肠癌中存在争议。CD133：脑胶质瘤高表达预后差。大肠癌高表达预后差，肺癌有争议。外周血CD133 mRNA的表达水平与预后相关（J Clin Oncol,2011 29(12):1547-55).肿瘤干细胞高表达胚胎干细胞相关基因Oct4Sox2NANOGKlfBmi1C-Myc胚胎干细胞基因与肿瘤预后的关系Oct4：肺癌及乳腺癌中高表达分化差，预后差Sox2：口腔鳞癌、食管癌高表达预后差，而肺鳞癌中高表达预后良好的指标。NANOG：口腔鳞癌中高表达预后差，大肠癌中的表达与预后无关。c-My
6、c：与多种肿瘤的预后不良相关。EMT相关基因与肿瘤的预后的关系E-cadherinN-cadherinVimentin尽管存在争议，一些文章支持与肿瘤的预后相关肿瘤干细胞其它功能基因与预后ALDH1（乙醛脱氢酶1）：ALDEFLUOR的试剂来分选ALDH-1阳性细胞。其表达与多种肿瘤的预后明显相关。ABC转运子家族蛋白：MDR1，ABCG2，ABCB5等，其功能与SP细胞相关。其表达于预后的关系不明确。肿瘤干细胞是否存在的争议肿瘤干细胞是否存在的争议正常组织的干细胞所占比例很低，而某些肿瘤含有很高比例的肿瘤干细胞。非肿瘤干细胞很容易通过EMT转变为肿瘤干细胞。免疫标记技术免疫标记技术抗原抗体反
7、应免疫组化技术基本原理常用酶标抗体间接法免疫组化的优缺点免疫组化的优缺点优点：特异性优点：特异性 敏感性敏感性 定位性定位性缺点：假阳性率高缺点：假阳性率高设计好对照是关键：阴性对照、阳性对照、设计好对照是关键：阴性对照、阳性对照、自身对照自身对照免疫荧光基本原理流式细胞仪的工作原理流式细胞仪流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用细胞生物学细胞生物学肿瘤些肿瘤些免疫学免疫学血液学血液学药物学药物学流式细胞结果分析（散点图）流式细胞分析 肺癌干细胞的分离鉴定肺癌干细胞的分离鉴定 TUMOR SAMPLEDIGESTION:-Collagenase I37C-2 hours-Washing SINGLE
8、 CELL SUSPENSIONCULTURING:Serum free medium原代肺癌细胞培养原代肺癌细胞培养原代培养建立的肺癌细胞系 We have established 5 squamous carcinoma(B),4 adenocarcinoma(D),1 large cell lung cancer(C),1 small cell lung cancer(A),and 1 lung carcinoid cell lines.原代培养的肺癌细胞在原代培养的肺癌细胞在NOD/SCID NOD/SCID 小鼠能形成肿瘤小鼠能形成肿瘤原代培养的肺癌细胞中含有一小群原代培养的肺癌细胞
9、中含有一小群 CD44 CD44 强阳性的细胞强阳性的细胞 Small cell lung cancer(LC004),large cell lung cancer(LC006)have cd44 strong positive population cells.CD44 CD44 强阳性细胞具有较强的增值能力强阳性细胞具有较强的增值能力 When seeded 500 cells/well,there was no obvious difference between the CD44+and CD44+/-cells(figure A),but when seeded 150 cells/
10、well,CD44+cells much stronger proliferative ability(figure B).CD44+CD44+细胞具有较强的克隆形成能力细胞具有较强的克隆形成能力A:large cell lung cancer cell line(LC006)B:small cell line cell line(LC004)只有只有CD44+CD44+的细胞可以形成的细胞可以形成holocloneholocloneWhen single cell seeded into 96 well plate,only CD44+CD+cells could form holoclon
11、e,100 CD44+CD90+cells could form about 1-3 holoclones.只有只有CD44+CD44+的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球A&C:cell spheres formed by CD44+cells of LC-006 and LC021.B&D:no cell sphere formed by CD44+cells of LC-006 and LC021.部分原代培养的肺癌细胞表达CD90A:watched by blue fluorescent light,B:watched by red fluoresc
12、ent light,C:watched by white light,D:overlap of A and B肺癌细胞表达肺癌细胞表达 CD44+CD90+4 main types of lung cancer,adenocarcinoma(LC007),squamous carcinoma(LC021),small cell lung cancer(LC004)and large cell lung cancer(LC006)all had the CD44+CD90+small population cells.大细胞肺癌中的大细胞肺癌中的CD44+CD90+CD44+CD90+和和 CD
13、44+CD90-CD44+CD90-细胞具有间质细胞的形态细胞具有间质细胞的形态A:CD44+CD90+.B:CD44+CD90-C:CD44+CD90+D:CD44+CD90-大细胞肺癌中的大细胞肺癌中的CD44+CD90+CD44+CD90+细胞高表达胚胎干细胞和间质细胞高表达胚胎干细胞和间质细胞相关的基因细胞相关的基因鳞癌细胞鳞癌细胞 CD44+CD90+CD44+CD90+和和CD44+CD90-CD44+CD90-具有间质细胞的形态具有间质细胞的形态A:LC021-P3 before sorting.B:CD44+CD90+.C:CD44+CD90-.D:CD44+CD90+.E:C
14、D44+CD90-.CD44+CD90+CD44+CD90+的鳞癌细胞具有最强的细胞球形成能力和的鳞癌细胞具有最强的细胞球形成能力和X X线抵抗能力线抵抗能力 CD44+CD90+CD44+CD90+的大细胞肺癌具有最强的细胞球形成能力和的大细胞肺癌具有最强的细胞球形成能力和X X线线抵抗能力抵抗能力TGF-TGF-1 1 对肿瘤细胞的作用对肿瘤细胞的作用 抑制肿瘤细胞的生长。使肿瘤细胞恶性程度增强。诱导肿瘤细胞产生EMT。TGF-TGF-1 1 对对 CD44+CD90+CD44+CD90+大细胞肺癌抑制能力最弱大细胞肺癌抑制能力最弱TGF-TGF-1 1 诱导肺癌细胞产生诱导肺癌细胞产生E
15、MTEMTTGF-TGF-1 1增加增加CD44+CD90+CD44+CD90+大细胞肺癌细胞的比例大细胞肺癌细胞的比例TGF-TGF-1 1 处理过的处理过的CD44+CD90+CD44+CD90+同样具有最强同样具有最强的的X X线照射抵抗能力线照射抵抗能力 lung cancer cells could partly return original characters after retreating TGF-1TGF-TGF-1 1 对对 CD44+CD90+CD44+CD90+的鳞癌细胞抑制能力最弱的鳞癌细胞抑制能力最弱TGF-TGF-1 1 选择性地增加选择性地增加 CD44+CD90+CD44+CD90+鳞癌细胞的比例鳞癌细胞的比例Tumor cells formed by“Tip-SP”cells in NOD/SCID mice maintain stable SP ratio