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1、第三章第三章 生物样品与样品制备生物样品与样品制备药学院药物分析教研室药学院药物分析教研室1【大纲要求大纲要求】1 1、掌握生物样品的种类及其特点、掌握生物样品的种类及其特点2 2、掌掌握握生生物物样样品品的的各各种种预预处处理理方方法法的的原原理及其应用理及其应用2第一节第一节 生物样品的种类、采集、生物样品的种类、采集、制备与贮存制备与贮存3一、种类、采集和制备一、种类、采集和制备(一一一一)血液血液血液血液(Whole blood,Plasma,SerumWhole blood,Plasma,Serum)1 1 1 1、血样采集、血样采集、血样采集、血样采集2 2 2 2、血样制备、血样
2、制备、血样制备、血样制备血浆的制备血浆的制备血浆的制备血浆的制备血液血液血液血液含有抗凝剂的试管含有抗凝剂的试管含有抗凝剂的试管含有抗凝剂的试管混合混合混合混合 2500r2500r2500r2500rminminminmin3000r3000rminmin离心离心离心离心5min 5min 上清液即为血浆。上清液即为血浆。上清液即为血浆。上清液即为血浆。血清的制备血清的制备血清的制备血清的制备血样血样血样血样室温放置室温放置室温放置室温放置30min30min到到到到1h 1h 出现血饼出现血饼出现血饼出现血饼剥去血剥去血剥去血剥去血饼饼饼饼以以以以2000r/min2000r/min300
3、0r/min3000r/min离心离心离心离心5min5min10min 10min 分取上清液即为分取上清液即为分取上清液即为分取上清液即为血清血清血清血清不能作为作用部位药物浓度的可靠指标不能作为作用部位药物浓度的可靠指标当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品4肝素的加入：肝素的加入：1ml1ml血血液液/需需要要肝肝素素0.10.10.2mg0.2mg，通通常常不不需需准准确确加加入入，在在取取血血前前可可取取少少量量肝肝素素钠钠溶溶液液（1 12 2滴滴）置置于于试试管管内内，旋旋转转试试管管，使使肝肝素素溶溶液液均均匀
4、匀分分布布于于试试管管壁壁上上，干干燥燥后后加加入入血血样样后立即轻轻振摇即可。后立即轻轻振摇即可。5全全全全血血血血：血血血血液液液液置置置置于于于于抗抗抗抗凝凝凝凝管管管管中中中中，不不不不经经经经离离离离心心心心操操操操作作作作，冷冷冷冷冻冻冻冻储储储储存存存存或直接分析或直接分析或直接分析或直接分析 需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度 如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制
5、 血浆药物浓度很低凝影响测定血浆药物浓度很低凝影响测定血浆药物浓度很低凝影响测定血浆药物浓度很低凝影响测定血样的特点：血样的特点：血样的特点：血样的特点：缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦优优优优点点点点：可可可可用用用用于于于于药药药药物物物物动动动动力力力力学学学学、生生生生物物物物利利利利用用用用度度度度、临临临临床床床床治治治治疗疗疗疗药药药药物监测物监测物监测物监测 大多数测定的时原型药物总量大多数测定的时原型药物总量大多数测定的时原型
6、药物总量大多数测定的时原型药物总量6(二二)尿液尿液1 1 1 1、尿药测定用途、尿药测定用途、尿药测定用途、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清：药物剂量回收研究、药物尿清：药物剂量回收研究、药物尿清：药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢过程和代谢类型预测药物的代谢过程和代谢类型预测药物的代谢过程和代谢类型预测药物的代谢过程和代谢类型2 2 2 2、尿的采集、尿的采集、尿的采集、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高
7、、：非损伤性采样方式、药物浓度较高、：非损伤性采样方式、药物浓度较高、：非损伤性采样方式、药物浓度较高、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。3 3 3 3、尿样的保存与处理、尿样的保存与处理、尿样的保存与处理、尿样的保存与处理：7(三三三三)唾液唾液唾液唾液 1 1 1 1、唾液的采集：漱口后、唾液的采集：漱口后、唾液的采集：漱口后、唾液的采集：漱口后15min15min15min15min进行，采集时间为进行，采集时间为进行，采集时间为进行，采集时间为1
8、0min10min10min10min，采用一些，采用一些，采用一些，采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌物理或化学方法刺激唾液分泌物理或化学方法刺激唾液分泌物理或化学方法刺激唾液分泌；（1 1 1 1）缩短采样时间，（）缩短采样时间，（）缩短采样时间，（）缩短采样时间，（2 2 2 2）减）减）减）减小唾液小唾液小唾液小唾液pHpHpHpH变化范围，（变化范围，（变化范围，（变化范围，（3 3 3 3）刺激后得到的唾液其唾液血浆分布）刺激后得到的唾液其唾液血浆分布）刺激后得到的唾液其唾液血浆分布）刺激后得到的唾液其唾液血浆分布比例的个体差异较小。比例的个体差异较小。比例的个体差异较小。比例的个
9、体差异较小。2 2 2 2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清液冻存或直接分析。液冻存或直接分析。液冻存或直接分析。液冻存或直接分析。3 3 3 3、优点、优点、优点、优点：（1 1 1 1）非损伤性取样，（）非损伤性取样，（）非损伤性取样，（）非损伤性取样，（2 2 2 2）可用于药代动力学研究，）可用于药代动力学研究，）可用于药代动力学研究，）可用于药代动力学研究，（3 3 3 3）不受采血时间和地点限制
10、，（）不受采血时间和地点限制，（）不受采血时间和地点限制，（）不受采血时间和地点限制，（4 4 4 4）样品易收集，病人易接）样品易收集，病人易接）样品易收集，病人易接）样品易收集，病人易接受受受受4 4 4 4、应用：（、应用：（、应用：（、应用：（1 1 1 1）在在在在TDMTDMTDMTDM中的应用中的应用中的应用中的应用 根据根据根据根据S/PS/PS/PS/P分类，分类，分类，分类，S/PS/PS/PS/P1.01.01.01.0表示药物在唾液中的浓度很低；表示药物在唾液中的浓度很低；表示药物在唾液中的浓度很低；表示药物在唾液中的浓度很低；S/PS/PS/PS/P1.01.01.0
11、1.0表示适合药物的监测；表示适合药物的监测；表示适合药物的监测；表示适合药物的监测；S/PS/PS/PS/P不固定不固定不固定不固定表示药物显著转移到表示药物显著转移到表示药物显著转移到表示药物显著转移到了唾液中；了唾液中；了唾液中；了唾液中；S/PS/PS/PS/P很大很大很大很大表示药物的离子化程度很低表示药物的离子化程度很低表示药物的离子化程度很低表示药物的离子化程度很低（2 2 2 2）药代动力学参数的测定）药代动力学参数的测定）药代动力学参数的测定）药代动力学参数的测定8组组 织织（1 1 1 1）匀浆化法）匀浆化法）匀浆化法）匀浆化法：组织：组织：组织：组织加入水或缓冲液加入水或
12、缓冲液加入水或缓冲液加入水或缓冲液匀浆匀浆匀浆匀浆上清液上清液上清液上清液（2 2 2 2）沉淀蛋白法：组织）沉淀蛋白法：组织）沉淀蛋白法：组织）沉淀蛋白法：组织加入蛋白沉淀剂加入蛋白沉淀剂加入蛋白沉淀剂加入蛋白沉淀剂上清液上清液上清液上清液（3 3 3 3）水水水水解解解解：组组组组织织织织加加加加入入入入酸酸酸酸或或或或碱碱碱碱加加加加热热热热使使使使组组组组织织织织液液液液化化化化上上上上清清清清液液液液（4 4 4 4）酶酶酶酶水水水水解解解解：组组组组织织织织加加加加入入入入酶酶酶酶和和和和缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液加加加加热热热热使使使使组组组组织织织织液液液液化化化化上清液上清液上
13、清液上清液9头头 发发优优优优点点点点：取取取取样样样样方方方方便便便便、无无无无损损损损伤伤伤伤性性性性、检检检检样样样样的的的的掺掺掺掺伪伪伪伪的的的的可可可可能能能能性性性性低低低低、能能能能对对对对某某某某些些些些特特特特定定定定的的的的代代代代谢谢谢谢物物物物进进进进行行行行测测测测定定定定、能能能能了了了了解解解解数数数数月月月月至至至至数数数数年年年年用用用用药药药药的的的的情情情情况况况况、可可可可用用用用于于于于体体体体内内内内微微微微量量量量元元元元素素素素含含含含量量量量测测测测定定定定、可可可可用用用用于于于于临临临临床床床床用用用用药药药药、滥滥滥滥用用用用药药药药物
14、物物物和和和和毒毒毒毒性性性性药药药药物物物物的的的的检测检测检测检测缺缺缺缺点点点点：样样样样品品品品的的的的预预预预处处处处理理理理繁繁繁繁琐琐琐琐、干干干干扰扰扰扰多多多多、药药药药物物物物的的的的含含含含量量量量低低低低、需要精密仪器需要精密仪器需要精密仪器需要精密仪器10特点：特点：特点：特点：广谱性广谱性广谱性广谱性积累性积累性积累性积累性稳定性稳定性稳定性稳定性依时性依时性依时性依时性相关性相关性相关性相关性指纹性指纹性指纹性指纹性 一一般般在在枕枕部部采采取取样样本本，国国外外一一般般在在靠靠近近头头皮皮处处剪剪取取，分分别别于于6 61010处处取取1010个个样样本本，从从
15、根根部部剪剪断断，超过超过12cm12cm的均按照的均按照12cm12cm处剪断处剪断11头发洗涤头发洗涤1 1 1 1、丙酮水丙酮、丙酮水丙酮、丙酮水丙酮、丙酮水丙酮2 2 2 2、丙酮预洗、丙酮预洗、丙酮预洗、丙酮预洗洗洁精洗涤洗洁精洗涤洗洁精洗涤洗洁精洗涤3 3 3 3、洗衣粉浸泡、洗衣粉浸泡、洗衣粉浸泡、洗衣粉浸泡4 4 4 4、二氯甲烷、二氯甲烷、二氯甲烷、二氯甲烷5 5 5 5、SDSSDSSDSSDS洗涤洗涤洗涤洗涤6 6 6 6、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇头头头头发发发发的的的的预预预预洗洗洗洗都都需需要要反反复复清清洗洗2 23 3次次12毛发样品的制备毛发样品的制备1 1 1
16、1、直接甲醇提取、直接甲醇提取、直接甲醇提取、直接甲醇提取2 2 2 2、酸水解、酸水解、酸水解、酸水解3 3 3 3、碱水解、碱水解、碱水解、碱水解4 4 4 4、酶水解、酶水解、酶水解、酶水解5 5 5 5、超临界流体萃取、超临界流体萃取、超临界流体萃取、超临界流体萃取6 6 6 6、有机破坏、有机破坏、有机破坏、有机破坏13二、生物样品的贮存与处理二、生物样品的贮存与处理（一）冷藏或冷冻（一）冷藏或冷冻（一）冷藏或冷冻（一）冷藏或冷冻1 1 1 1、血浆和血清：采血后及时分离（、血浆和血清：采血后及时分离（、血浆和血清：采血后及时分离（、血浆和血清：采血后及时分离（2h2h2h2h），短
17、期），短期），短期），短期4444，长，长，长，长期期期期-20-20-20-202 2 2 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存3 3 3 3、唾液：在、唾液：在、唾液：在、唾液：在4444下保存，往往需要在取样时测定下保存，往往需要在取样时测定下保存，往往需要在取样时测定下保存，往往需要在取样时测定pHpHpHpH值值值值4 4 4 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测、生物样品总的原则：临时
18、解冻，解冻的样品一次测、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复完，不能反复完，不能反复完，不能反复冷冻冷冻冷冻冷冻解冻解冻解冻解冻冷冻冷冻冷冻冷冻(FTC)(FTC)(FTC)(FTC)；样品应以小；样品应以小；样品应以小；样品应以小体积分装存放。体积分装存放。体积分装存放。体积分装存放。14第二节第二节 生物样品的预处理与制备生物样品的预处理与制备15一、预处理目的一、预处理目的（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度（二）纯化、富集药物（二）纯化、富集药物（三）适应和满足测定方法要求的灵敏度（三）适应和满足测定方法要求的灵敏度（四）防止对分
19、析仪器的污染和劣化（四）防止对分析仪器的污染和劣化16二、样品制备时应考虑的问题二、样品制备时应考虑的问题（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围（二）药物测定的目的（二）药物测定的目的（二）药物测定的目的（二）药物测定的目的（三）生物样品种类和杂质干扰类型（三）生物样品种类和杂质干扰类型（三）生物样品种类和杂质干扰类型（三）生物样品种类和杂质干扰类型（四）样品的化学组成（四）样品的化学组成（四）样品的化学组成（四）样品的化学组成（五）药物的蛋白结合率（五）药物的蛋白结合率（
20、五）药物的蛋白结合率（五）药物的蛋白结合率（六）被测组分在预处理过程中的稳定性（六）被测组分在预处理过程中的稳定性（六）被测组分在预处理过程中的稳定性（六）被测组分在预处理过程中的稳定性（七）样品在收集、储存等过程中容器的污染（七）样品在收集、储存等过程中容器的污染（七）样品在收集、储存等过程中容器的污染（七）样品在收集、储存等过程中容器的污染（八）样品的预处理过程要求简便（八）样品的预处理过程要求简便（八）样品的预处理过程要求简便（八）样品的预处理过程要求简便（九）预处理的最后一步应富集被测组分（九）预处理的最后一步应富集被测组分（九）预处理的最后一步应富集被测组分（九）预处理的最后一步应富
21、集被测组分（十）对分析方法的要求（十）对分析方法的要求（十）对分析方法的要求（十）对分析方法的要求1718三、样品的预处理技术三、样品的预处理技术（一）经有机破坏的方法（一）经有机破坏的方法（一）经有机破坏的方法（一）经有机破坏的方法1 1 1 1、湿法破坏、湿法破坏、湿法破坏、湿法破坏 2 2 2 2、干法破坏、干法破坏、干法破坏、干法破坏硝酸高氯酸法硝酸高氯酸法硝酸高氯酸法硝酸高氯酸法 高温电阻炉灰化法高温电阻炉灰化法高温电阻炉灰化法高温电阻炉灰化法电热消化器法电热消化器法电热消化器法电热消化器法 低温等离子灰化法低温等离子灰化法低温等离子灰化法低温等离子灰化法电热板消化法电热板消化法电热
22、板消化法电热板消化法烘箱消化法烘箱消化法烘箱消化法烘箱消化法3 3 3 3、氧瓶燃烧法、氧瓶燃烧法、氧瓶燃烧法、氧瓶燃烧法19（二）（二）去除蛋白质去除蛋白质1 1、溶剂解法、溶剂解法常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）：常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）：常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）：常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃丙酮、四氢呋喃丙酮、四氢呋喃丙酮、四氢呋喃体积比：体积比：体积比：体积比：1 1 1 1：1 1 1 13 903 903 903 90去除去除去除去除方法：超速离心（方
23、法：超速离心（方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min10000r/min10000r/min10000r/min）2021（二）（二）去除蛋白质去除蛋白质2 2、加入中性盐、加入中性盐常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白脱水而沉淀）：脱水而沉淀）：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐橼酸盐比例：比例：1 1：2 902 90去除去除方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min10000r/min）22（二）（二）去除蛋白质去除蛋白质3 3、加入强酸、加入强酸常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉
24、淀）：常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：10101010三氯醋酸、三氯醋酸、三氯醋酸、三氯醋酸、6 6 6 6高氯酸、硫酸钨酸混合液、高氯酸、硫酸钨酸混合液、高氯酸、硫酸钨酸混合液、高氯酸、硫酸钨酸混合液、5 5 5 5偏磷酸偏磷酸偏磷酸偏磷酸体积比：体积比：体积比：体积比：1 1 1 1：0.6 900.6 900.6 900.6 90去除去除去除去除方法：超速离心（方法：超速离心（方法：超速离心（方法：超速离心（10000r/min10000r/min10000r/min10000r/min）
25、2324其他去除蛋白的一些方法其他去除蛋白的一些方法1 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂2 2、超滤法、超滤法3 3、酶水解法、酶水解法4 4、加热法、加热法25（三）三）分离、纯化与浓集分离、纯化与浓集1、液液提取法（、液液提取法（LLE）2、固相萃取（、固相萃取（SPE）3、自动化、自动化SPE技术技术4、固相微萃取（、固相微萃取（SPME）5、膜萃取（、膜萃取（ME）6、微透析技术（、微透析技术（MD）7、超临界流体萃取（、超临界流体萃取（SFE）261 1、液液提取法（、液液提取法（LLELLE）大大多多数数药药物物都都是是脂脂溶溶性性的的，内内源源性性物物质质基
26、基本本上上都都是是水水溶溶性性的的，当当用用有有机机溶溶剂剂萃萃取取时时，药药物物被被萃萃取取出出来来而而内内源源性性物物质质被被除除去去，因因此此采采用用有有机机溶溶剂剂萃萃取取法法能能够够达达到到纯纯化化的的目的。目的。27关键要考虑三个方面的因素：关键要考虑三个方面的因素：（1 1）有机溶剂的特性）有机溶剂的特性（2 2）有机溶剂相和水相的体积）有机溶剂相和水相的体积（3 3）水相的）水相的pHpH值值28选择溶剂应注意的问题：选择溶剂应注意的问题：（1 1 1 1）了了了了解解解解药药药药物物物物与与与与溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的化化化化学学学学结结结结构构构构及及及及性性性性质质质质，
27、根根根根据据据据相相相相似似似似相相相相溶溶溶溶来来来来选择选择选择选择（2 2 2 2）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶（3 3 3 3）沸点低、易挥发和浓缩）沸点低、易挥发和浓缩）沸点低、易挥发和浓缩）沸点低、易挥发和浓缩（4 4 4 4）要与水不相溶）要与水不相溶）要与水不相溶）要与水不相溶（5 5 5 5）无毒、不易燃）无毒、不易燃）无毒、不易燃）无毒、不易燃（6 6 6 6）不易乳化）不易乳化）不易乳化）不易乳化（7 7 7 7）具有较高的化学稳定性和惰性）具有较高的
28、化学稳定性和惰性）具有较高的化学稳定性和惰性）具有较高的化学稳定性和惰性（8 8 8 8）不影响检测）不影响检测）不影响检测）不影响检测溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的选选选选择择择择与与与与纯纯纯纯度度度度要要要要求求求求292 2 2 2、有机相和水相的体积：一般为、有机相和水相的体积：一般为、有机相和水相的体积：一般为、有机相和水相的体积：一般为1:11:11:11:11:21:21:21:23 3 3 3、水相的、水相的、水相的、水相的pHpHpHpH值：碱性药物值：碱性药物值：碱性药物值：碱性药物pHpHpHpHpKa+1pKa+1pKa+1pKa+12 2 2 2 酸性药物酸性药物酸性药物
29、酸性药物pHpHpHpHpKa+1pKa+1pKa+1pKa+12 2 2 24 4 4 4、提提提提取取取取次次次次数数数数：往往往往往往往往进进进进行行行行的的的的是是是是一一一一次次次次萃萃萃萃取取取取，个个个个别别别别情情情情况况况况下下下下可可可可以以以以对对对对分分分分离离离离出出出出的的的的含含含含药药药药有有有有机机机机相相相相用用用用一一一一定定定定的的的的pHpHpHpH水进行反萃取（水进行反萃取（水进行反萃取（水进行反萃取（Back extractionBack extraction)30优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离优点
30、：选择性；药物能与多数内源性物质分离优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大对极性大对极性大对极性大的化合物的萃取效率低的化合物的萃取效率低的化合物的萃取效率低的化合物的萃取效率低总的流程图：总的流程图：总的流程图：总的流程图：血浆或其他生物样品血浆或其他生物样品血浆或其他生物样品血浆或其他生物样品加入萃取溶剂加入萃取溶剂加入萃取溶剂加入萃取溶剂分取有机层分取有机层分取有机层分取有机层必要时调必要时调必要时调必要时调pHpHpHpH值值值值减压氮气吹干
31、减压氮气吹干减压氮气吹干减压氮气吹干流动相溶解后进样分析流动相溶解后进样分析流动相溶解后进样分析流动相溶解后进样分析31消除消除LLELLE中产生的乳化现象：中产生的乳化现象：1 1、提取前在水相中加入适量的固体食盐、提取前在水相中加入适量的固体食盐2 2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化3 3、置置于于冰冰箱箱中中快快速速冻冻凝凝破破坏坏乳乳化化层层，再再融融化化后后离离心来消除已产生的严重乳化现象心来消除已产生的严重乳化现象32LLELLELLELLE的两种特殊萃取方法：的两种特殊萃取方法：的两种特殊萃取方法：的两种特殊萃取方法：离子对提取法离子对提取
32、法离子对提取法离子对提取法（Ion-pair extraction)Ion-pair extraction)提取烷基法（提取烷基法（提取烷基法（提取烷基法（Extractive alkylationExtractive alkylation）离离离离子子子子对对对对提提提提取取取取法法法法：是是是是一一一一种种种种用用用用有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂提提提提取取取取离离离离子子子子型型型型药药药药物物物物的的的的方法。方法。方法。方法。原原原原理理理理：一一一一些些些些酸酸酸酸性性性性或或或或碱碱碱碱性性性性的的的的有有有有机机机机药药药药物物物物在在在在体体体体液液液液中中中中呈呈呈呈离
33、离离离子子子子状状状状态态态态，成成成成为为为为强强强强亲亲亲亲水水水水性性性性的的的的带带带带电电电电荷荷荷荷离离离离子子子子，不不不不易易易易被被被被提提提提取取取取出出出出来来来来。当当当当加加加加入入入入与与与与药药药药物物物物呈呈呈呈相相相相反反反反电电电电荷荷荷荷的的的的反反反反离离离离子子子子物物物物质质质质时时时时，即即即即可可可可成成成成为为为为具具具具有有有有一一一一定定定定脂脂脂脂溶溶溶溶性性性性的的的的离离离离子子子子对对对对，用用用用有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂可可可可萃萃萃萃取取取取出出出出来。来。来。来。33碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等碱性药物：庚
34、烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵提取溶剂：氯仿、二氯甲烷提取溶剂：氯仿、二氯甲烷提取溶剂：氯仿、二氯甲烷提取溶剂：氯仿、二氯甲烷342 2、固相萃取、固相萃取(Solid phase extraction,SPE)（1 1 1 1）原理）原理）原理）原理 根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与
35、吸附根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。决定因素：药物与固定相表面的活性基团
36、、药物与溶决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶剂分子间的分子间作用力剂分子间的分子间作用力剂分子间的分子间作用力剂分子间的分子间作用力35洗脱方式：洗脱方式：（1 1 1 1）药药药药物物物物与与与与固固固固定定定定相相相相的的的的亲亲亲亲和和和和力力力力 杂杂杂杂质质质质与与与与固固固固定定定定相相相相的的的的亲和力亲和力亲和力亲和力先被保留后解吸先被保留后解吸先被保留后解吸先被保留后解吸（2 2 2 2）药药药药物物物物与与与与固固固固定定定定相相相相的的的的亲亲亲亲和和和和力力力力 部部
37、部部分分分分交交交交联联联联 非键合相非键合相非键合相非键合相69（2 2 2 2）萃萃萃萃取取取取时时时时间间间间：不不不不要要要要求求求求达达达达到到到到完完完完全全全全的的的的萃萃萃萃取取取取或或或或平平平平衡衡衡衡，萃萃萃萃取取取取时时时时间间间间一一一一般般般般为为为为5 5 5 520min20min20min20min，应应应应保保保保持持持持采采采采样样样样时时时时间间间间、温温温温度度度度和和和和纤纤纤纤维维维维侵入的深度等条件一致侵入的深度等条件一致侵入的深度等条件一致侵入的深度等条件一致（3 3 3 3）涂涂涂涂层层层层厚厚厚厚度度度度及及及及其其其其性性性性质质质质：涂
38、涂涂涂层层层层厚厚厚厚有有有有利利利利于于于于提提提提高高高高方方方方法法法法灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度、适适适适合合合合于于于于挥挥挥挥发发发发性性性性物物物物质质质质的的的的保保保保留留留留、吸吸吸吸附附附附速速速速度度度度慢慢慢慢、达达达达平平平平衡衡衡衡时间长、分析速度慢时间长、分析速度慢时间长、分析速度慢时间长、分析速度慢（4 4 4 4）盐盐盐盐的的的的作作作作用用用用和和和和pHpHpHpH的的的的影影影影响响响响：水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中离离离离子子子子强强强强度度度度增增增增大大大大，提高分析灵敏度，样品液的提高分析灵敏度，样品液的提高分析灵敏度，样品液的提高分析灵敏度
39、，样品液的pHpHpHpH值应与涂层的一致值应与涂层的一致值应与涂层的一致值应与涂层的一致（5 5 5 5）搅搅搅搅拌拌拌拌的的的的影影影影响响响响：可可可可提提提提高高高高分分分分析析析析灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度，机机机机械械械械搅搅搅搅拌拌拌拌效效效效率率率率高高高高（6 6 6 6）温温温温度度度度的的的的影影影影响响响响：升升升升高高高高温温温温度度度度缩缩缩缩短短短短平平平平衡衡衡衡时时时时间间间间，加加加加快快快快分分分分析析析析速度，但会使待测物的分配系数减小，不利于分配速度，但会使待测物的分配系数减小，不利于分配速度，但会使待测物的分配系数减小，不利于分配速度，但会使待测物的分
40、配系数减小，不利于分配70（5 5）联用技术）联用技术 71SPMESPME在体内药物分析中的应用：在体内药物分析中的应用：优优优优点点点点：操操操操作作作作时时时时间间间间短短短短，样样样样品品品品量量量量小小小小，无无无无萃萃萃萃取取取取溶溶溶溶剂剂剂剂，重重重重现现现现性性性性好好好好，选选选选择择择择性性性性高高高高，适适适适合合合合于于于于极极极极性性性性和和和和非非非非极极极极性性性性化化化化合合合合物物物物的的的的样样样样品品品品前前前前处处处处理理理理，集集集集采采采采样样样样、萃萃萃萃取取取取、浓浓浓浓集集集集、进进进进样样样样于于于于一一一一体体体体，避避避避免免免免过多的
41、操作误差，还可与过多的操作误差，还可与过多的操作误差，还可与过多的操作误差，还可与GCGCGCGC、HPLCHPLCHPLCHPLC等仪器联用。等仪器联用。等仪器联用。等仪器联用。展展展展望望望望：发发发发展展展展高高高高选选选选择择择择性性性性和和和和高高高高效效效效涂涂涂涂层层层层的的的的新新新新型型型型填填填填料料料料，使使使使分分分分析析析析对象扩展到无机物的分析对象扩展到无机物的分析对象扩展到无机物的分析对象扩展到无机物的分析725 5、膜萃取、膜萃取（Membrance extraction)（1 1 1 1）原原原原理理理理：膜膜膜膜是是是是两两两两相相相相间间间间的的的的选选选
42、选择择择择性性性性屏屏屏屏障障障障，在在在在膜膜膜膜两两两两侧侧侧侧施施施施加加加加一一一一定定定定的的的的动动动动力力力力时时时时，物物物物质质质质就就就就会会会会从从从从一一一一侧侧侧侧迁迁迁迁移移移移到到到到另另另另一一一一测测测测。分子足够小，能通过膜，大分子则不能通过膜。分子足够小，能通过膜，大分子则不能通过膜。分子足够小，能通过膜，大分子则不能通过膜。分子足够小，能通过膜，大分子则不能通过膜。浓度梯度导致分子迁移浓度梯度导致分子迁移浓度梯度导致分子迁移浓度梯度导致分子迁移 电位梯度导致电荷迁移电位梯度导致电荷迁移电位梯度导致电荷迁移电位梯度导致电荷迁移 压力梯度导致气体或松密度液体
43、迁移压力梯度导致气体或松密度液体迁移压力梯度导致气体或松密度液体迁移压力梯度导致气体或松密度液体迁移材料：聚丙烯、纤维素、人造膜、生物屏障材料：聚丙烯、纤维素、人造膜、生物屏障材料：聚丙烯、纤维素、人造膜、生物屏障材料：聚丙烯、纤维素、人造膜、生物屏障73（2 2 2 2）膜的几种萃取方法）膜的几种萃取方法）膜的几种萃取方法）膜的几种萃取方法1 1 1 1、微微微微粒粒粒粒填填填填料料料料薄薄薄薄膜膜膜膜（Particle-loaded Particle-loaded membrancemembrance PLMPLM）：是是是是由由由由各各各各种种种种不不不不同同同同的的的的固固固固定定定定
44、相相相相填填填填料料料料填填填填充充充充于于于于薄薄薄薄膜膜膜膜介介介介质质质质中中中中构构构构成成成成的的的的，C C C C8 8 8 8、C C C C18181818、SDBSDBSDBSDB等等等等，多多多多孔孔孔孔网网网网状状状状聚聚聚聚四四四四氟氟氟氟乙乙乙乙烯烯烯烯、聚聚聚聚氯氯氯氯乙乙乙乙烯烯烯烯等等等等，厚厚厚厚度度度度约约约约为为为为0.55mm0.55mm0.55mm0.55mm。优优优优点点点点：提提提提取取取取效效效效率率率率高高高高，单单单单位位位位体体体体积积积积的的的的提提提提取取取取容容容容量量量量大大大大，洗洗洗洗脱脱脱脱溶溶溶溶剂剂剂剂用用用用量量量量小
45、小小小，提提提提高高高高分分分分析析析析灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度，可可可可多多多多层层层层堆堆堆堆叠叠叠叠，提提提提高高高高分分分分析析析析容容容容量量量量和和和和选选选选择择择择性性性性，不不不不同同同同的的的的填填填填料料料料可可可可同同同同时时时时堆堆堆堆叠叠叠叠，可可可可同同同同时时时时富富富富集集集集不不不不同同同同类类类类型型型型和和和和酸酸酸酸碱碱碱碱性的化合物。性的化合物。性的化合物。性的化合物。注注注注意意意意事事事事项项项项：样样样样品品品品液液液液应应应应先先先先经经经经过过过过0.10.10.10.10.20.20.20.2m m m m的的的的滤滤滤滤膜膜膜膜过过过过
46、滤滤滤滤，防防防防止止止止堵堵堵堵塞，加样前需用少量甲醇润湿塞，加样前需用少量甲醇润湿塞，加样前需用少量甲醇润湿塞，加样前需用少量甲醇润湿742 2 2 2、支持液膜萃取（、支持液膜萃取（、支持液膜萃取（、支持液膜萃取（Supported liquid Supported liquid membrancemembrance extraction SLMEextraction SLME）采采采采用用用用一一一一层层层层渗渗渗渗透透透透性性性性聚聚聚聚四四四四氟氟氟氟乙乙乙乙烯烯烯烯膜膜膜膜分分分分开开开开两两两两种种种种溶溶溶溶液液液液，薄薄薄薄膜膜膜膜中中中中的的的的微微微微孔孔孔孔由由由由溶
47、溶溶溶剂剂剂剂饱饱饱饱和和和和后后后后固固固固定定定定在在在在两两两两个个个个扁扁扁扁平平平平的的的的模模模模块块块块之之之之间间间间，呈呈呈呈现现现现上上上上下下下下两两两两水水水水相相相相层层层层，中中中中间间间间有有有有机机机机层层层层的的的的“三三三三明明明明治治治治”三三三三相相相相萃萃萃萃取取取取系系系系统统统统，即即即即“液液液液液液液液萃萃萃萃取取取取透透透透析析析析液液液液液液液液萃萃萃萃取取取取”三三三三步步步步的的的的结结结结合合合合。一一一一般般般般来来来来说说说说，待待待待测测测测物物物物在在在在样样样样品品品品中中中中呈呈呈呈离离离离子子子子状状状状态态态态与与与与
48、另另另另一一一一试试试试剂剂剂剂形形形形成成成成非非非非离离离离子子子子状状状状态态态态，被被被被有有有有机机机机膜膜膜膜萃萃萃萃取取取取厚厚厚厚扩扩扩扩散散散散进进进进入入入入接接接接受受受受相相相相，完成萃取过程。完成萃取过程。完成萃取过程。完成萃取过程。适适适适用用用用于于于于强强强强极极极极性性性性化化化化合合合合物物物物，非非非非极极极极性性性性和和和和无无无无法法法法离离离离子子子子化化化化的的的的药药药药物物物物不能选用该法不能选用该法不能选用该法不能选用该法753 3 3 3、微孔滤膜液液萃取、微孔滤膜液液萃取、微孔滤膜液液萃取、微孔滤膜液液萃取（MicroporousMicr
49、oporous membrancemembrance liquid-liquid extraction MMLLEliquid-liquid extraction MMLLE）基基基基本本本本原原原原理理理理同同同同支支支支持持持持液液液液膜膜膜膜萃萃萃萃取取取取，将将将将“三三三三明明明明治治治治式式式式”改改改改为为为为两两两两相相相相萃萃萃萃取取取取，用用用用一一一一张张张张疏疏疏疏水水水水性性性性膜膜膜膜将将将将水水水水相相相相与与与与有有有有机机机机相相相相隔隔隔隔开开开开，水水水水相相相相流流流流速速速速快快快快而而而而有有有有机机机机相相相相流流流流速速速速慢慢慢慢，适适适适合合
50、合合于于于于微微微微量量量量弱极性化合物的富集和纯化。弱极性化合物的富集和纯化。弱极性化合物的富集和纯化。弱极性化合物的富集和纯化。76膜萃取的特点：膜萃取的特点：膜萃取的特点：膜萃取的特点：不不不不仅仅仅仅可可可可以以以以实实实实现现现现样样样样品品品品的的的的分分分分离离离离、高高高高选选选选择择择择性性性性、有有有有机机机机溶溶溶溶剂用量小，可以与剂用量小，可以与剂用量小，可以与剂用量小，可以与GCGCGCGC在线联用，易于实现自动化在线联用，易于实现自动化在线联用，易于实现自动化在线联用，易于实现自动化影响因素：影响因素：影响因素：影响因素：样品液的流速样品液的流速样品液的流速样品液的