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1、微生物基础实验项目微生物基础实验项目 1、培养基制备与灭菌；2、微生物的分离培养与菌落观察；3、细菌的染色观察：革兰氏染色、芽孢与荚膜染色；4、放线菌、霉菌的形态观察；5、微生物直接计数与大小测定；6、微生物生理生化反应 微生物基础实验注意事项微生物基础实验注意事项1、提高安全意识，正确操作仪器；2、培养无菌操作的观念；3、自觉清洗器皿；4、注重保持环境卫生和实验室秩序；培养基的制备与灭菌培养基的制备与灭菌 一、目的：一、目的：1、学习一般培养基的制备方法；2、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用的灭菌方法。二、原理二、原理 1、培培养养基基(culture medium)：培养基是按照微生物生
2、长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的一种基质。u 培养基的种类：根据培养基的成分可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基；按物理性状不同，可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。天天然然培培养养基基：主要成分是天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，其成分未完全了解，且各批次不均一。适用于生产上大规模培养微生物。合成培养基：合成培养基：成分明确的化学药品配制而成的培养基。如：高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、营养代谢、分类鉴定、生物
3、测定、菌种选育和遗传分析等工作。半合成培养基：半合成培养基：在天然有机物的基础上，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基。具有广泛的应用，如马铃薯葡萄糖培养基，适合很多霉菌的生长。液体培养基：液体培养基：配好后成为液体状态的培养基。如糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。广泛用于理论研究和大规模的工业发酵。固体培养基：固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂形成的固态培养基。常用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶。硅胶用于配制自养微生物的固体培养基；对于其他多数微生物来讲，琼脂最为合适，一般加入1.5-2.5%，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、菌种保藏等。半半固固体体培培养养基基
4、：在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基，如，加入0.2-0.7%琼脂作为凝固剂。用来观察细菌运动特征、鉴定菌种、菌种保藏和噬菌体的效价滴定等。根据培养基的特殊用途分类根据培养基的特殊用途分类：基基础础培培养养基基：含有一般细菌生长繁殖所需的基本营养物质，常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，也是作为某些特殊培养基的基础成分。加富培养基：加富培养基：是在基础培养基中加入血、血清、动物组织提取液或植物组织提取液，主要用于培养某些对营养要求较为苛刻的微生物。选选择择培培养养基基：根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。根据某些微生物对碳、氮源的特
5、殊要求来设计选择性培养基，可以分离到能分解某些物质的微生物。在培养基中加入某些化学物质，以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时，在培养基中添加10%的酚数滴可抑制细菌和霉菌的生长。鉴别培养基：鉴别培养基：在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂，使培养的微生物产生某种代谢产物与该化合物或化学试剂发生明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将此种微生物与其他种微生物区别开来，如伊红美蓝培养基。2、灭菌：、灭菌：消毒与灭菌是两个不同的概念。消毒：一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，而不能杀死全部芽孢，因此，消毒对微生物的杀灭是不彻底的，而且往往只能作用到物体表面，只能作为一般的卫生
6、措施。如使用酒精、84消毒液浸泡或煮沸法对器械的表面消毒处理，用紫外灯对房间进行照射等。灭菌：杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子，因此，灭菌后的物品不再带有活体微生物。灭菌的方法很多，如加热(干热或湿热)、过滤等。干热法灭菌：干热法灭菌：a)火焰烧灼：火焰烧灼：适用于接种环、接种针、镊子等金属用具，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。b)热空气灭菌：热空气灭菌：使用电热干燥箱，借助热空气在160-1700C下保温2小时进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（如吸管和培养皿）等的灭菌，对带胶皮的器物或培养基不适用。湿热灭菌：湿热灭菌：a)高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌锅内1.05kg/
7、cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟进行灭菌。这种灭菌适用于培养基等的灭菌。b)间歇灭菌法间歇灭菌法 少数培养基，例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等，高温高压灭菌易被破坏，适用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热1000C，30分钟，连续3天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放室温下18-24小时，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热1000C，30分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。三、材料：三、材料：1、药药品品：NaCl 蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉 K2HPO4 H
8、Cl NaOH 琼脂 葡萄糖 蔗糖 Na2SO4 黄豆芽 马铃薯 伊红 美蓝等。2、器材：、器材：台秤 三角瓶 试管 漏斗 电炉 搪瓷杯（铝锅）试管架 玻棒 滴管 称量纸 pH试纸 棉花 纱布 牛皮纸 棉线 灭菌锅 干燥箱等。四、方法及步骤：四、方法及步骤：1、培培养养基基的的配配制制一一般般可可分分为为称称量量、溶溶化化、pH调节、过滤和分装等步骤调节、过滤和分装等步骤 称量：称量：按照培养基配方，称取各种成分；溶化：溶化：在容器中先加入所需蒸馏水水量的一部分，依次将各成分加入，使全部溶解，最后补足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物质配制培养基时，需加热溶解，并补足水分。配制固体培养基时，先将上述
9、配好的液体培养基加热到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热到琼脂完全熔化，在加热过程中要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢。矫矫正正pH值值：初配制好的培养基，往往不能符合所需求的pH值，故必须矫正，用精密pH试纸，以1N HCl或1N NaOH调节至所需要的pH值。过滤：过滤：用滤纸、棉花或双层纱布过滤。分装：分装：将制成的培养基分装于三角瓶或试管内。马铃薯糖琼脂培养基马铃薯糖琼脂培养基(PDA)成分：成分：马铃薯马铃薯 200g 蔗糖蔗糖 20g 琼脂琼脂 25g 水水 补足补足1000ml 方法：方法：将马铃薯洗净去皮切块，放入搪瓷杯中，掺适量将马铃薯洗净去皮切块，放入搪瓷
10、杯中，掺适量水加热煮沸水加热煮沸30分钟（注意不时用玻棒搅拌，避免糊底），用分钟（注意不时用玻棒搅拌，避免糊底），用双层纱布滤去薯块，在薯汁中加入琼脂，加热熔化，再加入双层纱布滤去薯块，在薯汁中加入琼脂，加热熔化，再加入葡萄糖，完全溶化后，用水补足体积，趁热分装到三角瓶中，葡萄糖，完全溶化后，用水补足体积，趁热分装到三角瓶中，121灭菌灭菌20 min。注：无须调注：无须调pH值，保持自然的酸性。值，保持自然的酸性。伊红美蓝琼脂培养基伊红美蓝琼脂培养基(EMB)成分成分1：蛋白胨蛋白胨 10 g NaCl 5 g 乳糖乳糖 4 g 琼脂琼脂 25 g 蒸馏水蒸馏水 1000 ml pH 7.6
11、 成分成分2：2%伊红水溶液伊红水溶液2 ml，0.5%美蓝水溶液美蓝水溶液 1 ml 方法：方法：先配成分先配成分1，调好，调好pH值后才可加入成分值后才可加入成分2，混匀，趁热分装到三角瓶中，混匀，趁热分装到三角瓶中，115灭菌灭菌 20 min。3倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基 成分成分1：蛋白胨蛋白胨 30 g 牛肉膏牛肉膏 9 g 乳糖乳糖 15 g NaCl 15 g 蒸馏水蒸馏水 补足补足1000 ml pH 7.2 成分成分2：1.6%溴钾酚紫乙醇溶液溴钾酚紫乙醇溶液3 ml 方法：方法：先配成分先配成分1，调好，调好pH值后才可加入成分值后才可加入成分2
12、，混匀，分装到三角瓶及大试管中，并加入倒置的事先混匀，分装到三角瓶及大试管中，并加入倒置的事先充满该培养液的杜氏管（勿留气泡），封口后充满该培养液的杜氏管（勿留气泡），封口后115灭菌灭菌 20 min。2、灭菌：、灭菌：干热灭菌步骤干热灭菌步骤：将要灭菌的器皿（培养皿、吸管等）包扎好，放入恒温干燥箱内。接通电源，打开开关；旋动恒温调节器至1400C，当达到此温度时，借助恒温调节器的自动控制，保持恒温两小时。两小时后，关掉电源，当温度降至600C以下后，才可打开箱门，取出灭菌物品。（2）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌 原理：在密闭容器中加热形成的蒸汽不断堆积，使蒸汽压力升高，温度也相应升高，超过水
13、的沸点。利用过热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性，以致失去生命力，从而达到彻底灭菌的效果。高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟进行灭菌，就可杀死一切微生物细胞及其芽孢或孢子。灭菌对象是培养基、玻璃器皿和各种不因高温处理而变质的物品材料。但对不耐高温、高压的溶液或培养基不宜用此种方法。手提式蒸汽灭菌锅立式蒸汽灭菌锅（电加热、自动或半自动）卧式蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅的使用：高压蒸汽灭菌锅的使用：锅内加入适量的水，使水面与三脚搁架相平为宜。把要灭菌的材料装入锅内，注意不要放得太挤，防碍蒸汽流通，影响灭菌效果。盖好灭菌锅
14、锅盖，按对角线形式均匀拧紧锅盖上的螺栓，螺栓松紧一致，以免漏气。打开电源，开启排汽阀，以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关闭排汽开关。让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时。控制热源，维持压力至所需时间。本实验根据培养基不同，分别采用：1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持20分钟；0.7kg/cm2（10磅/英寸2），115.60C保持20分钟。灭菌所需时间到后，关闭热源。让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至“0”时，打开排汽阀。打开灭菌锅盖，取出已灭菌的物品及培养基。五、培养基的配制及器材准备：1 1：配配牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨固固体体培培
15、养养基基2000 2000 mlml，分分装装于于1616个个250 250 mlml三角瓶；三角瓶；2 2：配牛肉膏蛋白胨固体培养基配牛肉膏蛋白胨固体培养基500 ml500 ml，分装于，分装于100100支试管；支试管；3 3：高氏高氏1 1号固体培养基号固体培养基1000 ml1000 ml，分装于，分装于8 8个个250 ml250 ml三角瓶；三角瓶；4 4：淀粉固体培养基淀粉固体培养基1000 ml1000 ml，分装于，分装于8 8个个250 ml250 ml三角瓶；三角瓶；5 5：马铃薯固体培养基马铃薯固体培养基2000 ml2000 ml，分装于，分装于1616个个250
16、ml250 ml三角瓶；三角瓶；6 6：豆豆芽芽汁汁培培养养基基1000 1000 ml,ml,分分装装于于8 8个个250 250 mlml三三角角瓶瓶+20+20支支试试管；管；7 7：无氮培养基无氮培养基500 ml,500 ml,分装于分装于4 4个个250 ml250 ml三角瓶三角瓶8 8：伊红美蓝固体培养基伊红美蓝固体培养基1000 ml1000 ml，分装于，分装于8 8个个250 ml 250 ml 三角瓶；三角瓶；五、培养基的配制及器材准备：9 9：葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基700 ml,700 ml,分装于分装于9090支试管（支试管（7 ml7 ml）；）
17、；1010：蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基400 ml400 ml，分装于，分装于5050支试管（支试管（7 ml7 ml）；）；1111：3 3倍倍乳糖蛋白胨液体培养基乳糖蛋白胨液体培养基100 ml100 ml，2020只大试管（只大试管（5 ml5 ml），），均加入倒置小管；均加入倒置小管；1212：乳乳糖糖发发酵酵液液体体培培养养基基700 700 mlml，分分装装于于9090支支试试管管（7 7 mlml），加加倒置小管；倒置小管；1313：葡葡萄萄糖糖发发酵酵液液体体培培养养基基400 400 mlml，分分装装于于5050支支试试管管（7 7 mlml），加倒置小管；加倒置小管；五、培养基的配制及器材准备：另外，每组清洗包装培养皿20套、10支1ml吸管、2支10ml吸管，1个250ml三角瓶（盛90ml蒸馏水，加30-40 粒玻璃珠）、10支试管（盛9ml蒸馏水）。每两组包细口试剂瓶一只。思考思考 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高，时间长？请设计干热灭菌与湿热灭菌效果比较实验方案。高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？细菌营养体和细菌芽孢对紫外线的抵抗力一样吗？为什么？