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1、细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法 中国药典中国药典2010年版培训班年版培训班 山东省药品检验所2010.10主 要 内 容n细菌内毒素检查相关理论及概念n中国药典2010年版增修订情况n细菌内毒素检查法及注意事项细菌内毒素检查相关理论及概念 细菌内毒素 鲎试剂 鲎试剂与内毒素的反应机理 细菌内毒素检查名词解释细菌内毒素检查法（Bacterial Endotoxins test）热原检查法（Pyrogen test）LAL(Limulus amebocyte lysate)TestTAL(Tachypleus amebocyte lysate)TestLimulus Test细菌内毒素的发现
2、细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。Boivin：Morgan：内毒素是由多糖、脂质和蛋白质组成的复合体。脂多糖又由化学和生物性质不同的特异O 抗原、核心多糖和类脂A（脂质A）组成。内毒素的多糖结构细菌内毒素参考品的建立
3、细菌内毒素参考品的建立n不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保不同细菌的内毒素对于鲎试剂的反应活性不同，为保证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的证鲎实验法的平行性和重复性，要建立一种内毒素的标准物质作为实验中的控制标准。标准物质作为实验中的控制标准。n由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较由于大肠杆菌内毒素在天然内毒素中的致热活性比较高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于高，在各种细菌内毒素对鲎试剂反应的灵敏性上处于中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠中值的位置，且其稳定、可溶，因此一般都采用大肠杆菌的内毒素作为标准内毒素参考品。杆菌的内毒素作为标准
4、内毒素参考品。标准内毒素与环境内毒素标准内毒素：标准内毒素：指经人工提取精制并经生物效指经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检价测定的细菌内毒素，作为细菌内毒素检查的参考品。查的参考品。国际标准品（国际标准品（IS）参考标准品参考标准品 （RSE）国家标准品（国家标准品（NS/RSE）标准内毒素标准内毒素 工作标准品工作标准品 （CSE）80年代以前以重量作为内毒素的单位年代以前以重量作为内毒素的单位 1982年年USP20引入以生物效价为量值引入以生物效价为量值的内毒素单位的内毒素单位（EU，Endotoxin Unit）细菌内毒素的量值细菌内毒素的量值CP2010年版
5、规定内毒素标准品溶解后要在年版规定内毒素标准品溶解后要在旋涡混合器上混合旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀分钟，以后的每一步稀释前要至少混合释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类秒，其他国家药典也有类似要求；似要求；具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布匀分布 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果不凝等不正确的实验结果 细菌内毒素标准品的稀释细菌内毒素标准品的稀释l鲎是一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。l种类
6、以及分布：美洲鲎：北美洲东岸海域中国鲎：中国东南沿海南方鲎：泰国和马来群岛海域圆尾鲎：东南亚西部海域 世界上现存鲎的种类鲎试验的发现鲎试验的发现n1956年Johns Hophins 大学动物学家Frederik.Bang发现革兰阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚。n19631964年 Jack.Levin和Bang对细菌引起鲎血凝聚进行研究，用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种酶反应。n多位学者对鲎血细胞溶解物（LAL）进行研究，阐释了凝聚机制 鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成鲎试剂：鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成鲎试剂的种类：鲎试剂的种类：q依据鲎的种类分：依据
7、鲎的种类分：n美洲鲎试剂（美洲鲎试剂（LAL）n中国鲎试剂（中国鲎试剂（TAL）n圆尾鲎试剂（圆尾鲎试剂（CAL）q依据检查方法分：依据检查方法分：n凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂q依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分：依据内毒素和鲎试剂反应的专一程度分：n普通鲎试剂和特异性鲎试剂普通鲎试剂和特异性鲎试剂 鲎试剂与分类鲎试剂与分类C因子因子活化的活化的C因子因子内毒素内毒素活化的活化的B因子因子B因子因子凝固酶凝固酶凝固酶原凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原凝固蛋白原(1,3)(1,3)-D-葡聚糖或葡聚糖或LAL-RM活化的活化的G因子因子（旁路反应）（旁
8、路反应）G因子因子二价阳二价阳离子离子凝胶法鲎试剂与内毒素的反应机理 复杂的酶促反应过程复杂的酶促反应过程BET的目的和前提的目的和前提n确保药品不含有能导致患者发热反应发生的确保药品不含有能导致患者发热反应发生的足足量量的细菌内毒素。的细菌内毒素。n一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是一定量的细菌内毒素可以被人体耐受，也是SFDA允许的。允许的。n 前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是前提是假定引起发热反应的热原几乎全部是内毒素。内毒素。二、二、2010年版年版中国药典中国药典细菌内毒细菌内毒素检查法增修订情况素检查法增修订情况n2010版与版与2005版区别版区别n修订背景修订背景n注
9、射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则法指导原则 20102010版与版与20052005版区别版区别2010版2005年版1、细菌内毒素检查用、细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝（用于凝胶法）或胶法）或0.005EU/ml（用于光（用于光度测定法）度测定法）且对内毒素且对内毒素试验无干扰作用的试验无干扰作用的灭菌灭菌注射用水注射用水 凝胶法细菌内毒素检查凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小用水系指内毒素含量小于于0.015EU/ml的灭菌注的灭菌注射用水。光度测定法用射用水。光度测定法用的细菌
10、内毒素检查用水，的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于其内毒素的含量应小于0.005EU/ml 2、本试验操作过程应、本试验操作过程应防止微生物防止微生物和内毒素和内毒素的的污染污染试验操作过程应防止微试验操作过程应防止微生物的污染生物的污染2010版2005年版3 3、1EU1EU与与1 1个内毒素国际单个内毒素国际单位（位（IUIU）相当）相当-4 4、常用干热灭菌法（、常用干热灭菌法（250250、3030分钟以上分钟以上）去除）去除 常用的方法是在常用的方法是在250 250 干烤至少干烤至少6060分钟分钟5、删除对于过酸、过碱或本身有缓冲能对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品
11、，需调节被测溶液力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的（或其稀释液）的pH pH 值，可值，可使用酸、碱溶液或使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂鲎试剂生产厂家推荐的家推荐的适宜的缓冲液调节适宜的缓冲液调节pH pH 值。值。2010版2005年版6 6、内毒素限值按内毒素限值按L=K/ML=K/M计算，计算，M M为人为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以量，以ml/ml/（kgkgh h）、）、mg/mg/（kgkgh h）或或U/U/（kgkgh h）表示，人均体重按）表示，人均体重按 60kg 60kg 计算，计算，人体表面积按人体表面积按1.62m1.
12、62m2 2计算。计算。注射时间若不足注射时间若不足1 1小时，按小时，按1 1小时计算。小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以供试品每平方米体表面积剂量乘以0.0270.027即可转换为每千克体重剂量即可转换为每千克体重剂量（M M）内毒素限值按内毒素限值按L=K/ML=K/M计算，计算，M M为人用每公斤体重每小为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以时的最大供试品剂量，以ml/ml/（kgkgh h）、）、mg/mg/（kgkgh h）或）或U/U/（kgkgh h）表示，人均）表示，人均体重按体重按 60kg 60kg 计算，注射计算，注射时间若不足时间若不足1 1小时，按小时，按
13、1 1小小时计算。时计算。7 7、细节语言文字方面、细节语言文字方面凝胶限凝胶限度度试验试验AntilgAntilg加入加入内毒素的溶液内毒素的溶液处处方方至少至少2 2有任何有任何可能会影响可能会影响凝胶限量试验凝胶限量试验LgLg-1-1配制内毒素的溶液配制内毒素的溶液配方配方不少于不少于2 2个个发生了任何可能会影响发生了任何可能会影响 修订背景修订背景1、细菌内毒素与检查用水除了强调内毒素含量外，还强调应对内毒素试验无干扰作用。2、强调用干热灭菌法（250、30分钟以上）去除内毒素与热原法同步。3、根据某些药（如抗肿瘤药）用体表面积计算给药量的需要，增加了按体表面积给药时的计算方法。注
14、射用药品、生物制品建立细菌内毒素检注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查法指导原则查法指导原则n本原则依据2010年版药典制订，适用于注射用药品、生物制品建立细菌内毒素检查项目时进行的实验及研究。需建立内毒素检查项目的品种需建立内毒素检查项目的品种n质量标准中有家兔热原检查法需转换为细菌内毒素检查方法的品种。n用于注射给药，但未有热原质量控制的品种。n注射用新药需建立热原质量控制的品种。n用于静脉给药的原辅料建立方法时对鲎试剂及样品的要求建立方法时对鲎试剂及样品的要求n同时使用两个鲎试剂厂家的鲎试剂n每个品种至少三批样品（上市品种应检测两个以上生产厂家；新药需检测连续生产的样品）。确定内毒素限
15、值确定内毒素限值n一般按公式L=K/M计算。M为人每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明书，临床用药须知确定。n儿童用药如大于成人，以儿童为准。n为保障安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2或1/3。n对于体积在100ml以上（包括100ml）的复方静脉输液类品种，内毒素限值一般按0.5EU/ml计。其他单方静脉输液品种除另有规定外也可按用药剂量计算，以EU/mg或EU/U表示。n对于美国、欧洲或日本药典已收载的，并已建立细菌内毒素检查法的品种可参考国外药典规定的限值，与按公式计算出的数值比较，以严格者
16、为该品种的限值。如果使用的是国外药典的限值，应以最新版本药典为准。干扰实验干扰实验n建议使用较低灵敏度鲎试剂(0.5EU/ml或0.25EU/ml),以避免供试品中内毒素的阳性影响。三、细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法n定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。n细菌内毒素的量用内毒素单位细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。表示。1、概述n凝胶法凝胶法n光度测定法光度测定法 浊度
17、法（终点浊度法和动态浊度法）浊度法（终点浊度法和动态浊度法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）显色基质法（终点显色法和动态显色法）凝胶法凝胶法n最简单、经济、应用最广泛，中国药典的最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁仲裁”方法方法n对干扰相对不敏感。对干扰相对不敏感。n有两倍的误差有两倍的误差n较光度测定法不灵敏较光度测定法不灵敏光度测定法光度测定法n灵敏（动态浊度检测限灵敏（动态浊度检测限0.001EU/ml，动态显动态显色色0.005EU/ml）n检测范围宽（动态浊度达到检测范围宽（动态浊度达到100EU/ml,动态显动态显色色50EU/ml）n较之凝胶法易受干扰较之凝胶法易受干扰
18、n对结果的解释更慎重。对结果的解释更慎重。实验基本流程图实验基本流程图供试品供试品限值确定限值确定最大有效稀释最大有效稀释倍数确定倍数确定供试品干扰实验供试品干扰实验 正式实验正式实验结果判断结果判断2.试剂、仪器设备等细菌内毒素检查法所应用的细菌内毒素检查法所应用的试剂，主要包括：鲎试剂、细菌试剂，主要包括：鲎试剂、细菌内毒素检查用水、细菌内毒素工内毒素检查用水、细菌内毒素工作标准品等。作标准品等。国内鲎试剂的生产情况国内鲎试剂的生产情况n安度斯生物技术有限公司安度斯生物技术有限公司n湛江海洋生物制品厂湛江海洋生物制品厂n福州新北鲎试剂厂福州新北鲎试剂厂n厦门鲎试剂厂厦门鲎试剂厂n福州东方鲎
19、试剂厂福州东方鲎试剂厂n福州平潭东方鲎试剂厂福州平潭东方鲎试剂厂n广西北海鲎试剂厂广西北海鲎试剂厂n细菌内毒素检查用水 1.药典规定：凝胶法：0.015Eu/ml 光度法：0.005Eu/ml 且对内毒素试验无干扰作用 2.和鲎试剂配套使用?细菌内毒素国家标准品(RSE)n细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品(CSE)n细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。仪器设备与实验器具n分析天平n超净工作台n细菌内毒素检查专用干式恒
20、温器n电热恒温干燥箱n旋涡混合器n 实验器具n 试管架、镊子、消毒棉球、称量瓶(30mm60mm)、刻度吸管(1、2、5、10、15ml)、各种试管、中号金属饭盒、加样器等。n目前已有多种无热原的一次性用品 实验器具的洗涤与除内毒素实验器具的洗涤与除内毒素 实验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接实验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接影响试验结果。影响试验结果。实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸泡后，取出用自来水、泡后，取出用自来水、纯化水依次冲洗干纯化水依次冲洗干净（可用纯化水浸泡）净（可用纯化水浸泡）。实验器具的洗涤与灭菌n试验中所用的器皿，需要经过处理，除
21、去可能存在的外源性内毒素。常用的方法是250干烤至少30分钟，达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温，一般约需68 小时。n将冲洗干净的试管、称量瓶、玻璃小瓶置金属饭盒内，吸管置金属筒内，放入烤箱，于250干烤至少30分钟，放冷，密闭保存备用。n灭菌后的实验器具应在规定时间内使用。实验器具的洗涤与灭菌n也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰细菌内毒素的检查。n除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内使用，否则须再次除去可能存在的外源性内毒素。n试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。3.供试品溶液的配制 n按各药品项下规定，取供试品，精密称定于称量瓶(事先已除去外源性内毒素)中，按其效价或
22、含量，用各药品项下规定的稀释剂稀释至规定浓度，充分摇匀使完全溶解，放置 510分钟，再摇匀,放置备用。3.供试品溶液的配制 n一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液的pH值，可以使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已经去除内毒素的容器中配制，缓冲液必须经过验证不含内毒素或干扰因子。3.供试品溶液的配制 n注意事项：n1、供试品溶液的浓度如以*mg/ml表示，此*mg/ml是指供试品溶液中活性物质的浓度。n2、样品初试时一般按照样品的估计百分含量或效价单位计算稀释液溶剂加入量，复试时，则必须根
23、据该供试品的实际百分含量或效价来计算。n3.考虑供试品本身的体积 4.内毒素限值的确定内毒素限值 L=K/M 每小时静注入人体内，不引起热原反应的最大内毒素剂量（阈值）K=5EU/（kgh）nL 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示；nK 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/（kgh）表示，注射剂K=5EU/（kgh），放射性药品注射剂K=2.5EU/（kgh），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kgh）。nM 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kgh）、mg/（kgh）或U/（kgh）表示，人均体重按60kg 计算，人体表
24、面积按1.62m2计算。注射时间若不足1 小时，按1 小时计算。n按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。内毒素限值n大输液 K=0.5EU/mln注射用水 K=0.25 EU/mln注意M一定要找到最大量，如果有儿童用量，按体重计一般高于成人量内毒素限值n大部分药品的内毒素限值=k/最大给药剂量（mg/kg）n假如剂量为14.3mg/kg，内毒素限值=5/14.3=0.35EU/mg 假如此产品的浓度为100mg/ml 内毒素限值=0.35100=35EU/ml5.凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验 n当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响
25、检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。5、鲎试剂灵敏度复核试验n鲎试剂的标示灵敏度：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，其单位用EU/ml表示。5、鲎试剂灵敏度复核试验n1、取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。5、鲎试剂灵敏度复核试验n2、将细菌内毒素国家标准品或工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后根据鲎试剂标示灵敏度()，制成 2、0.5和0.254个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。5、鲎试剂灵敏度
26、复核试验n3、取鲎试剂，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。将鲎试剂按标示装量复溶，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。n取 0.1ml/支的鲎试剂18支备用（规格大于 0.1ml支的鲎试剂按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后分装）。5、鲎试剂灵敏度复核试验n4、按检查法项下试验，将待复核的鲎试剂18管放在试管架上，排成5列，4列4管，1列2 管，其中前4列分别加入4个不同浓度的内毒素标准溶液0.1ml（每1个内毒素浓度平行做4管），另一列2管加入细菌内毒素检查用水0.1ml。加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，垂直放入细菌内毒素检
27、查专用干式恒温仪中，在371保温60分钟2分钟后，观察并记录结果。5、鲎试剂灵敏度复核试验n5、试验结果中，如最大浓度2管均为阳性，最低浓度 0.25管均为阴性，阴性对照均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值(c)。n cantilg(X/4)n 式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。5、鲎试剂灵敏度复核试验n6、当c在0.52(包括0.5和2)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。l结果判断上上图：阳性图：阳性下图：阴性下图：阴性6、供试品的干扰试验 当进行新药的内毒素检查
28、试验前，或无内当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验。果的变化时，须进行干扰试验。n干扰试验实际上是两个鲎试剂灵敏度复核试验：n 一个真正的鲎试剂灵敏度复核n 一个“鲎试剂灵敏度复核”试验是用一定浓度的供试品溶液替代BET水（鲎试剂复溶仍采用BET水）。也就是说“用供试品溶液将同一支细菌内素素标准品制成2、0.5和0.25
29、4个浓度的内毒素标准溶液”进行干扰试验一般步骤：n供试品限值确定n根据鲎试剂的灵敏度范围确定MVD范围（供试品溶液浓度范围）n预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度n正式干扰试验预试验n通过一系列含有标准内毒素浓度为2的供试品溶液与后试剂反应，初步筛选出不干扰的浓度范围。n前提：供试品对内毒素检查的干扰多数为抑制n目的：避免干扰试验的盲目性6、供试品的干扰试验 n1、按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，分别制成含细菌内毒素工作标准品2、0.5和0.25 4个浓度的内毒素标准溶液系列C和B。凝胶法干扰试验溶液的制备
30、 编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液12*4*8*210.50.254444C2/检查用水检查用水1248210.50.254444D无/检查用水 2n*注：稀释倍数是指内毒素浓度，而其中供试品浓度是不变的6、供试品的干扰试验 n2、鲎试剂的准备：36支n3、按检查法项下试验，照表一制备溶液A、B、C和D。将准备好的18管鲎试剂放在试管架上，排成5列，1 列2管作为A，4列4管作为B，其中4列分别加入4个不同浓度的含供试品的内毒素标准溶液，另一列加入供试品溶液。6、供试品的干扰试验n将准备好的另外18管鲎试剂放在
31、试管架上，排成5列，4列4管作为C，1列2管作为D，其中4列分别加入 4个不同浓度的内毒素标准溶液，另一列加入细菌内毒素检查用水。加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，垂直放入细菌内毒素检查专用干式恒温仪中，在371保温60分钟2分钟后，观察并记录结果。6、供试品的干扰试验 n4、试验结果中，只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度符合范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。6、供试品的干扰试验nEsantilg(Xs/4)nEtantilg(Xt/4)n n式中Xs、Xt分别为系列溶液C
32、和B的反应终点浓度的对数值(lg)。6、供试品的干扰试验n当Es在0.52(包括0.5和2)及Et在0.5Es2Es(包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。6、供试品的干扰试验n供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：nMVDCL/n式中：L：为供试品的细菌内毒素限值。n C：为供试品溶液的浓度（抗生素样品浓度以活性成分计）。当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml，当L以EU/mg、EU/u表示时，C为mg/ml、u/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原
33、料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=/L。n ：鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。7、凝胶限度试验 编号内毒素浓度/被加入内毒素溶液平行管数A无/供试品溶液2B 2/供试品溶液2C2/检查用水2D无/检查用水2nA为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照7、凝胶限度试验n1.供试品溶液的配制n用细菌内毒素检查用水将供试品配成对应MVD的浓度。n2 阳性对照液的制备：用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成 2浓度的内毒素溶液。7、凝胶限度试验n3 供试品阳性对照液的制备：n用被测供试品溶液将细菌内毒素工作标准品制成 2浓度的内毒素溶液。n实际工作中
34、一般采用2倍MVD的供试品溶液和4的内毒素溶液等体积混合的方法配制，因此供试品稀释过程要有2MVD和MVD两个浓度，内毒素标准品稀释要有4和2两个浓度7、凝胶限度试验n4 将8管鲎试剂放置在试管架上，其中2支加入 0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，2支加入 0.1ml阳性对照液作为阳性对照管，2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管。7、凝胶限度试验n5 加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，垂直放入细菌内毒素检查专用干式恒温仪中，在371保温 60分钟2分钟后，观察并记录结果。注意在保温和拿
35、取试管过程应避免受到震动制成假阴性结果。7、凝胶限度试验n6 结果判断n将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转 180时，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为()；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为()。若阴性对照溶液的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液的平行管均为阳性，阳性对照溶液的平行管均为阳性，试验有效。7、凝胶限度试验n结果判断n供试品2管均为()，应认为符合规定。如2管均为()，应认为不符合规定；如2管中1管为()，1管为()，按上述方法另取4支供试品管复试，若所有平行管均为(-)，即认为符合规定。否则判供试品为不符合规定。凝胶法限量检
36、查n美国药典和欧洲药典n溶液A和供试品阳性对照液B使用不超过MVD的供试品溶液nUSP32:Prepare Solution A and positive product control Solution B using a dilution not greater than the MVD nEP 6.0:Prepare solution A and solution B(positive product control)using a dilution not greater than the MVD8、凝胶半定量试验 n凝胶半定量试验系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。n按
37、下表制备溶液A、B、C、D。按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。8、凝胶半定量试验编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水12482222B2/供试品溶液122C2/检查用水检查用水1248210.50.252222D无/检查用水 28、凝胶半定量试验n注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释不得超过MVD。nB为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。nC为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。nD为阴性对照。8、凝胶半定量试验n结果判断n1、若阴性对照溶
38、液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.52之间，试验有效。8、凝胶半定量试验n系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度按公式CE=antilg(X/2)。如果检测时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。8、凝胶半定量试验n如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒
39、素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以。8、凝胶半定量试验n若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。细菌内毒素定量检查法发展现状n我国2000版药典细菌内毒素检查法应用指导原则正式列入，定量法在我国得到肯定、应用和推广。n20052005版将版将20002000年版的指导原则合并入检查法中，年版的指导原则合并入检查法中，正式收载细菌内毒素定量检测法（光度测定法）正式收载细菌内毒素定量检测法（光度测定法）。分类 终点浊度法 浊度法 光度测定法 动态浊度法（定量法）终点显色法 显色基质法 动态显色法浊度法n原理：利用检测鲎试剂与内毒素反应过
40、程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。n根据内毒素与鲎试剂的反应机理，被激活的凝固酶切断凝固蛋白原中特定位置的精氨酸肽链，形成凝固蛋白，产生浊度变化，用适当浊度仪进行定量分析的一种方法。n根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。显色基质法n原理：利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。n根据被内毒素激活的凝固酶水解
41、鲎三肽中精氨酸肽链，释放出对硝基苯胺（PNA)，用冰醋酸终止反应进行吸光度测定，或用游离的PNA和偶氮试剂反应，最终形成偶氮蓝复合物显色而进行比色测定的一种方法。n根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。n终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。n动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。内毒素与鲎试剂的凝胶反应光密度OD 时间（分钟）不同浓度的内毒素反应曲线鲎试剂定量检测内毒素原理检测样品原理检测样品的反应时间通过标准曲线反算浓度lgTlgClgClgTTx
42、Cx用系列稀释的标准品与反应时间回归标准曲线动态浊度法实验方法n1.标准曲线的可靠性实验:r绝对值0.980n2.供试品的干扰实验:MVD=L.C/1n 测定及判断:回收率50%-200%n3.供试品的定量测定：测定结果与L比较实验器材n微量移液器，配套的除热原玻璃吸头n仪器专用的比浊玻璃小试管和稀释样品的大玻璃试管n旋涡混旋器n封口膜及试管架定量检测仪n检查用水n鲎试剂加样后摇匀，用封口膜封好，立即插入仪器加入鲎试剂阴性对照样品阳性对照标准曲线n当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。n用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液（
43、相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。标准曲线q内毒素含量浓度与反应时间 n浓度与反应时间分别取对数后n将两组数据用最小二乘法统计n能够拟合出直线：标准曲线LgT=a+b LgC内毒素浓度C反应时间T10倍稀释标准曲线n例：把内毒素标准品稀释为10 EU/ml，1 EU/ml，0.1 EU/ml，0.01EU/ml四个浓度n优点：检测范围宽，线性好，易操作。n缺点：相对于对倍稀释的标准曲线数据准确性
44、稍差。2倍稀释标准曲线n例：把内毒素标准品稀释为0.5 EU/ml，0.25EU/ml，0.125 EU/ml，0.0625EU/ml，0.03125 EU/ml 五个浓度。n优点：数据准确性好。n缺点：曲线范围窄，线性稍差，初学者不易于操作。理想标准曲线评价n最少有四个连续浓度梯度点。n相关系数。n标准品回收率应在10025%。n每个点至少2个平行管，平行管的变异系数不应大于10%。n连作3条标准曲线的合并后，仍满足以上条件可以存档供日常检测。光度测定法干扰试验溶液的制备编号编号内毒素浓度内毒素浓度被加入内毒素被加入内毒素的溶液的溶液平行管数平行管数A无无供试品溶液供试品溶液至少至少2B标准
45、曲线的中点（或附近点）标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为的浓度（设为m）供试品溶液供试品溶液至少至少2C至少至少3个浓度（最低一点设定个浓度（最低一点设定为为）检查用水检查用水每一浓度至少每一浓度至少2D无无检查用水检查用水至少至少2nA为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。nB为加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液；nC为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液；nD为阴性对照。供试品干扰试验n供试品限值的确定：L=K/Mn最大有效稀释倍数的确定：MVD=CL/（标准曲线最低点浓度）n通过检测从MVD到较高浓度的供试品溶液（可以到原液），计算回收率，判断供试品干扰情况。nR=(Cs-Ct)/m 100%n干扰试验的预试验和正式试验、样品检测都同时完成，也是定量法的优势。实验结果的判断n阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间n标准曲线相关系数n回收率50-200%n建议：变异系数CV%10%n定量检测的优点n定量检测实例